靶向脂質(zhì)體的藥理學(xué)評(píng)價(jià)

王富喜，鄧宏圖 綜述，王 濱 審校

(濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院藥學(xué)部，山東 濱州 256600)

靶向給藥系統(tǒng)是指通過(guò)局部給藥或經(jīng)全身血液循環(huán)，由載體對(duì)目標(biāo)組織、細(xì)胞或細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)進(jìn)行選擇性濃集和定位的給藥系統(tǒng)。靶向給藥能使藥物濃度富集于靶標(biāo)，從而減少用藥劑量，同時(shí)提高藥物療效，減少不良反應(yīng)，還能控制釋藥速率和方式，最終達(dá)到高效低毒的效應(yīng)。靶向給藥系統(tǒng)可分為脂質(zhì)體、微囊、微球、納米粒等，目前應(yīng)用最為廣泛的為靶向脂質(zhì)體[1]。

臨床前的藥理評(píng)價(jià)可以為臨床研究提供可靠的實(shí)驗(yàn)支持，為臨床研究提供有關(guān)藥物有效性或安全性的重要參數(shù)。臨床前藥理學(xué)研究的主要內(nèi)容包括：(1)主要藥效學(xué)研究，內(nèi)容包括客觀評(píng)價(jià)受試藥的優(yōu)劣，并與已上市的、公認(rèn)的有效藥物進(jìn)行比較后，經(jīng)過(guò)科學(xué)嚴(yán)格的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，確定取舍；(2)一般藥理學(xué)研究，指對(duì)受試藥主要藥效之外的藥物效應(yīng)進(jìn)行研究；(3)作用機(jī)制的研究；(4)臨床前藥動(dòng)學(xué)的研究，是研究藥物吸收、分布、轉(zhuǎn)化和排泄，并根據(jù)數(shù)學(xué)模型得出重要的藥物動(dòng)力學(xué)參數(shù)[2]。本文首先簡(jiǎn)要介紹靶向脂質(zhì)體的分類(lèi)及理化性質(zhì)評(píng)價(jià)，再?gòu)乃幮W(xué)、靶向性、體外及體內(nèi)實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)等全面綜述靶向脂質(zhì)體的藥理學(xué)評(píng)價(jià)。

1 靶向脂質(zhì)體的分類(lèi)及特點(diǎn)

根據(jù)作用機(jī)制的不同，靶向脂質(zhì)體可分為物理化學(xué)靶向、主動(dòng)及被動(dòng)脂質(zhì)體。物理化學(xué)靶向脂質(zhì)體是在脂質(zhì)體中加入一些特殊的磁性材料，使脂質(zhì)體對(duì)光、熱、pH、磁場(chǎng)等刺激產(chǎn)生反應(yīng)，從而使藥物直接作用于目標(biāo)組織，如磁性、溫度敏感型、pH敏感型靶向脂質(zhì)體等均屬此類(lèi)[3]。主動(dòng)靶向脂質(zhì)體是指在脂質(zhì)體表面連接能夠與靶蛋白結(jié)合的一些糖殘基、抗體、激素和受體配體等，使脂質(zhì)體主動(dòng)到達(dá)特定的靶器官、靶組織和細(xì)胞系后釋放藥物而發(fā)揮藥效。被動(dòng)靶向脂質(zhì)體是指脂質(zhì)體通過(guò)靜脈注射進(jìn)入機(jī)體后易被體內(nèi)的吞噬細(xì)胞吞噬，形成了天然傾向的富集作用，其與主動(dòng)靶向脂質(zhì)體最大的區(qū)別是脂質(zhì)雙分子層沒(méi)有修飾，具有特定功能的配體、抗體等[4]。

此外，脂質(zhì)體的關(guān)鍵質(zhì)量屬性包括形態(tài)、粒徑、包封率、釋放度、靶向性等，其表征方法包括理化性質(zhì)評(píng)價(jià)和藥理學(xué)評(píng)價(jià)[5]。

2 靶向脂質(zhì)體的理化性質(zhì)評(píng)價(jià)

理化性質(zhì)評(píng)價(jià)通常包括粒徑大小及分布均勻程度、穩(wěn)定性及包封率等方面。粒徑大小及分布除與其包封率及穩(wěn)定性有關(guān)外，同時(shí)對(duì)載藥脂質(zhì)體的治療效果有直接的影響。因物理和生理作用，機(jī)體能夠選擇性地在肝、脾、肺、淋巴等部位聚集不同大小的載藥脂質(zhì)體，從而使其釋放藥物發(fā)揮藥效。脂質(zhì)體形態(tài)與粒徑的檢測(cè)主要通過(guò)3種途徑：(1)光學(xué)顯微鏡，是最常規(guī)的鏡檢方式，其適于檢測(cè)粒徑較大的脂質(zhì)體。(2)電子顯微鏡，是最通用的鏡檢方式，也是直接測(cè)定粒徑最準(zhǔn)確的方法。(3)激光散射法，又稱(chēng)動(dòng)態(tài)光散射法，能夠測(cè)定出脂質(zhì)體樣品的平均粒徑[6]。

穩(wěn)定性是通過(guò)檢測(cè)Zeta電位來(lái)評(píng)價(jià)的。Zeta電位越高，粒子間的斥力越大，體系因不易聚集從而穩(wěn)定性越強(qiáng)。此外，Zeta電位高時(shí)進(jìn)入擴(kuò)散層的反離子較多，吸附層的反離子較少，在膠粒周?chē)鷷?huì)產(chǎn)生水化膜從而穩(wěn)定性好，因?yàn)殡x子在雙電層中具有較強(qiáng)的水化作用[7]。

包封率一般采用重量包封率表示，其測(cè)定時(shí)須分離載藥脂質(zhì)體和游離藥物。包封率受藥物的性質(zhì)、粒徑、藥脂比、制備方法等多種因素影響。測(cè)定方法包括紫外分光光度法、電子順磁波譜法、核磁共振波譜、高效液相色譜法及液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用等方法[8]。新藥研發(fā)中，要求脂質(zhì)體對(duì)藥物的包封率一般不得低于80%。

3 靶向脂質(zhì)體的藥理學(xué)評(píng)價(jià)

3.1靶向脂質(zhì)體的藥效學(xué)評(píng)價(jià) 靶向脂質(zhì)體的藥效學(xué)評(píng)價(jià)是指經(jīng)過(guò)科學(xué)、嚴(yán)格的實(shí)驗(yàn)，并經(jīng)過(guò)與已上市及公認(rèn)的經(jīng)典藥物比較，至少在體內(nèi)及體外2種以上的模型上進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，從而客觀評(píng)價(jià)新制劑的優(yōu)劣。脂質(zhì)體所荷載的藥物主要包括抗腫瘤藥物、抗生素及抗病毒藥物等。近年來(lái)，在抗肝損傷、抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、抗腦卒中、抗血栓及抗腫瘤等體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究中，承載常規(guī)藥物或基因藥物的靶向脂質(zhì)體得到了廣泛應(yīng)用，并表現(xiàn)出了明顯的高效、低毒等優(yōu)良特性。

抗腫瘤藥物脂質(zhì)體是近年來(lái)研究的熱點(diǎn)之一?？鼓[瘤靶向脂質(zhì)體的體外藥效學(xué)評(píng)價(jià)包括MTT等方法檢測(cè)腫瘤細(xì)胞的增殖，TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞的凋亡，劃痕法檢測(cè)細(xì)胞的遷移，Transwell法檢測(cè)細(xì)胞的侵襲等。體內(nèi)藥效學(xué)評(píng)價(jià)一般以荷瘤鼠為研究對(duì)象，觀察實(shí)驗(yàn)鼠的生存狀態(tài)(包括精神狀態(tài)、自主活動(dòng)、毛發(fā)狀態(tài)等)，記錄動(dòng)物的體重，測(cè)量腫瘤的大小及計(jì)算腫瘤抑制率，檢測(cè)血清中的氧化炎癥因子及腫瘤標(biāo)志物，分子生物學(xué)手段檢測(cè)目的基因及目的蛋白的表達(dá)等[9]。

抗生素靶向脂質(zhì)體的體外藥效學(xué)評(píng)價(jià)一般通過(guò)LPS刺激RAW264.7細(xì)胞致炎癥模型進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)檢測(cè)體系包括腫瘤壞死因子、白細(xì)胞介素、一氧化氮等炎癥因子水平的檢測(cè)及活性氧水平的檢測(cè)等。體內(nèi)藥效學(xué)評(píng)價(jià)一般采用肝損傷、肺損傷、關(guān)節(jié)炎等動(dòng)物模型，肝或肺損傷模型的檢測(cè)指標(biāo)包括靶組織損傷特異性標(biāo)志物的檢測(cè)、血清炎癥及氧化應(yīng)激因子水平的測(cè)定，靶組織病理學(xué)檢測(cè)、目的基因及目的蛋白的表達(dá)檢測(cè)等；關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型的檢測(cè)指標(biāo)包括關(guān)節(jié)腫脹度的測(cè)定，關(guān)節(jié)炎癥指數(shù)的測(cè)定、血清及關(guān)節(jié)組織炎癥因子水平的測(cè)定，關(guān)節(jié)組織病理學(xué)檢測(cè)等[10]。

3.2靶向脂質(zhì)體的靶向性評(píng)價(jià) 在靶向制劑的研究過(guò)程中，建立良好的靶向評(píng)價(jià)體系是必不可少的。首先，需要建立可視化的數(shù)據(jù)或圖表支持制劑靶向、并能夠精準(zhǔn)客觀反映靶向性的評(píng)價(jià)體系；其次，需要為制劑的條件優(yōu)化提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。體外實(shí)驗(yàn)通常采用細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)，將靶向脂質(zhì)體接上熒光素，再與選定的細(xì)胞進(jìn)行共孵育，一定時(shí)間后檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度，從而表明制劑的細(xì)胞靶向性。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)通常采用具體的動(dòng)物模型，仍然是將靶向脂質(zhì)體接上熒光素，再將其靜脈注射入動(dòng)物體內(nèi)，一定時(shí)間后檢測(cè)動(dòng)物全身各處熒光強(qiáng)度的差異，表明制劑的組織靶向性。

3.2.1體外評(píng)價(jià)方法 體外評(píng)價(jià)內(nèi)容包括粒徑大小、電位、體外釋放特性、載藥量檢測(cè)、包封率、體外細(xì)胞研究、組織切片技術(shù)等。不同類(lèi)型的靶向制劑最佳的體外評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)需要根據(jù)其本身及靶標(biāo)的特性以及采用的靶向策略而定。

3.2.1.1粒徑大小 例如，脂質(zhì)體粒徑小于50 nm時(shí)一般都能夠靶向至脾組織；在50～100 nm時(shí)能靶向至肝組織；在0.1～0.2 μm時(shí)能夠靶向至肝組織肝巨噬細(xì)胞的溶酶體；在7～12 μm時(shí)可被肺組織細(xì)胞攝??；>12 μm時(shí)能夠被毛細(xì)血管上皮細(xì)胞攝取進(jìn)而到達(dá)荷瘤組織內(nèi)；>15 μm時(shí)能被腸系膜動(dòng)脈等血管上皮細(xì)胞攝取[11]。因此，針對(duì)制劑不同大小顆粒的阻留性，可根據(jù)機(jī)體不同組織的生理學(xué)特性構(gòu)建靶向釋藥制劑，通過(guò)觀察顆粒大小，可對(duì)該類(lèi)制劑的靶向進(jìn)行評(píng)價(jià)。

3.2.1.2釋放度測(cè)定 釋放度指在一定時(shí)間內(nèi)藥物從制劑溶入特定介質(zhì)中的累計(jì)百分率。針對(duì)靶向脂質(zhì)體的釋放度測(cè)定除了選用常規(guī)釋放介質(zhì)外，還需要根據(jù)不同疾病特點(diǎn)選用特定介質(zhì)。某些病變組織常伴有一些物理化學(xué)性質(zhì)的改變，研究指出，腫瘤細(xì)胞內(nèi)通常伴有高熱、高酸性、特殊微菌群產(chǎn)生多種酶等特性，因此針對(duì)腫瘤通常需要設(shè)計(jì)出pH、溫度或酶敏感的靶向制劑。此外，物理化學(xué)因素敏感的靶向脂質(zhì)體主要是通過(guò)在不同組織有不同的釋放度這一特點(diǎn)而實(shí)現(xiàn)靶向行為；同時(shí)還應(yīng)考慮到，理化因素除了會(huì)影響藥物擴(kuò)散速度，還會(huì)影響基質(zhì)材料的降解速度[4]。

3.2.1.3體外實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià) 評(píng)價(jià)靶向脂質(zhì)體將藥物遞送至靶細(xì)胞，主要是通過(guò)檢測(cè)制劑的細(xì)胞攝取率來(lái)實(shí)現(xiàn)。(1)細(xì)胞成像技術(shù)是將熒光素與磷脂等進(jìn)行結(jié)合，制備具有熒光標(biāo)記的靶向脂質(zhì)體，利用細(xì)胞成像等方法檢測(cè)靶向效果[12]。(2)激光掃描共聚焦顯微鏡(confocallaserscanningmicroscope，CLSM)可用于實(shí)時(shí)觀察細(xì)胞水平的藥物制劑釋放行為。CLSM原理是對(duì)藥物在細(xì)胞內(nèi)的相對(duì)熒光值進(jìn)行動(dòng)態(tài)比較。細(xì)胞將大分子物質(zhì)以質(zhì)膜的方式攝入細(xì)胞內(nèi)，并由此引發(fā)一系列連續(xù)的過(guò)程，如膜小泡的產(chǎn)生、融合及轉(zhuǎn)運(yùn)等，這是基本且重要的靶向給藥系統(tǒng)內(nèi)化相應(yīng)靶細(xì)胞作用的模式，正因?yàn)檫@種模式，通過(guò)CLSM可精準(zhǔn)地檢測(cè)靶向脂質(zhì)體進(jìn)行細(xì)胞的過(guò)程，包括方式、速率及程度等[13-14]。(3)流式細(xì)胞術(shù)(flow cytometry，F(xiàn)CM)是一種在快速直線(xiàn)流動(dòng)狀態(tài)下進(jìn)行檢測(cè)或分選單列細(xì)胞或生物顆粒的技術(shù)，通過(guò)流式細(xì)胞儀可測(cè)定載藥靶向脂質(zhì)體細(xì)胞內(nèi)化相對(duì)量[15]。有研究將配體樹(shù)枝狀聚合物與表柔比星復(fù)合，將復(fù)合物在MCF-7和C16細(xì)胞(目標(biāo)細(xì)胞)中進(jìn)行細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)，F(xiàn)CM發(fā)現(xiàn)復(fù)合物在細(xì)胞中的熒光強(qiáng)度顯著大于游離多柔比星在細(xì)胞中的熒光強(qiáng)度，同時(shí)發(fā)現(xiàn)復(fù)合物在MCF-7細(xì)胞中的熒光強(qiáng)度要明顯低于其在C16細(xì)胞中的光強(qiáng)，表明通過(guò)FCM檢測(cè)靶向制劑可鑒別靶細(xì)胞和非靶細(xì)胞[16]。(4)鄰位連接技術(shù)(proximity ligation assay，PLA)常用來(lái)檢測(cè)腫瘤標(biāo)志物，靈敏度高、特異性強(qiáng)。PLA是將寡核苷酸單鏈分別標(biāo)記在單克隆抗體等試劑上作為鄰位探針，當(dāng)探針在空間上因識(shí)別同一靶蛋白而接近時(shí)，寡核苷酸的自由端點(diǎn)被拉近，在一個(gè)附加連接寡核苷酸的作用下進(jìn)行雜交實(shí)現(xiàn)鄰位連接，連接酶再以連接探針為模板連接探針的輔助核酸序列，從而實(shí)現(xiàn)鄰位連接。MIRZAVI等[17]在體外實(shí)驗(yàn)中通過(guò)PLA檢測(cè)HSP90 的抑制劑TAS-116對(duì)其選擇性，結(jié)果顯示，TAS-116對(duì)HSP90具有極高的選擇性，能夠?qū)SP90發(fā)揮明顯抑制作用。

3.2.2體內(nèi)實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià) 體內(nèi)評(píng)價(jià)主要是采用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)分析藥物在體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)和藥效學(xué)，方法包括藥動(dòng)學(xué)/藥效學(xué)模型(PK/PD模型)、成像技術(shù)分析等。

3.2.2.1PK/PD模型 靶向脂質(zhì)體的靶向性可通過(guò)體內(nèi)分布直觀地評(píng)價(jià)。一般以小鼠或荷瘤裸鼠為受試對(duì)象，按預(yù)定的給藥途徑將靶向脂質(zhì)體給藥后，于不同的時(shí)間點(diǎn)處死動(dòng)物，取血，分離主要組織并勻漿，測(cè)定血清或組織中的藥物水平，據(jù)此繪制血液及不同組織中的藥物濃度-時(shí)間曲線(xiàn)，進(jìn)行動(dòng)力學(xué)處理，以同劑量非靶向制劑做對(duì)照，評(píng)價(jià)靶向制劑在動(dòng)物體內(nèi)的分布[18]。通過(guò)PK/PD模型檢測(cè)制劑的靶向性可由以下3個(gè)參數(shù)體現(xiàn)：(1)相對(duì)攝取率(re)，其表示不同制劑對(duì)同一組織或細(xì)胞的選擇性。re越大(一般大于1)代表該制劑對(duì)靶組織或細(xì)胞的靶向性越好。(2)靶向效率(te)，te越大(一般大于1)表示該制劑對(duì)靶組織或細(xì)胞的選擇性越好。(3)峰濃度比(Ce)，也反映了不同制劑對(duì)同一組織或器官的選擇性。Ce越大表示該制劑改變藥物分布的能力越強(qiáng)[19-20]。

3.2.2.2放射性同位素技術(shù) 放射性同位素標(biāo)記靶向脂質(zhì)體后，通過(guò)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物整體自顯影或活體動(dòng)態(tài)顯影的方式，觀察動(dòng)物體內(nèi)不同組織、不同時(shí)間的藥物分布，優(yōu)點(diǎn)是直觀方便，缺點(diǎn)是不宜定量評(píng)價(jià)分布情況；也可標(biāo)記載體后制備微粒，給藥后，用新制劑的體內(nèi)變化間接描述藥物的體內(nèi)過(guò)程，不同時(shí)間處死動(dòng)物后檢測(cè)靶組織放射性強(qiáng)度以評(píng)價(jià)體內(nèi)過(guò)程。此外，還可用放射性同位素標(biāo)記藥物，測(cè)定給藥后不同時(shí)間各靶器官放射強(qiáng)度，優(yōu)點(diǎn)是靈敏度和重現(xiàn)性均較好[21-23]。

3.2.2.3活體熒光成像(Biofluores-CenceImaging，BFI)技術(shù) BFI技術(shù)多采用近紅外熒光，可用來(lái)評(píng)估靶向脂質(zhì)體在體內(nèi)的靶向性，特點(diǎn)是穿透能力強(qiáng)及圖像分辨率高。將靶向制劑上接上熒光標(biāo)記物后注射到動(dòng)物體內(nèi)，再進(jìn)行實(shí)時(shí)及原位熒光強(qiáng)度測(cè)定。BFI常用染料包括AlexaFluor、CY7、DIR等。研究表明，在關(guān)節(jié)炎大鼠模型上，通過(guò)BFI可表征多種腫瘤壞死因子α抑制劑(賽妥珠單抗、阿達(dá)木單抗等)在其正常組織和炎癥組織中的分布[24]。此外，粒徑相同但標(biāo)記的不同熒光染料的脂質(zhì)體在動(dòng)物體內(nèi)的分布也不同相同，可通過(guò)BFI進(jìn)行熒光強(qiáng)度定量，以此對(duì)納米載體驅(qū)動(dòng)藥物在體內(nèi)的分布進(jìn)行進(jìn)一步的確證[25]。

4 結(jié) 論

近年來(lái)，主動(dòng)靶向脂質(zhì)體研究最為廣泛，其不僅能夠?qū)⑺幬镏鲃?dòng)靶向到靶組織從而提高藥物的生物利用度，還能夠負(fù)載診斷試劑在腫瘤等疾病診斷領(lǐng)域發(fā)揮獨(dú)特優(yōu)勢(shì)[26]。但主動(dòng)靶向脂質(zhì)體藥物與其他脂質(zhì)體藥物一樣同樣存在著部分缺點(diǎn)，如穩(wěn)定性不夠、包被不同藥物的理化性質(zhì)差別較大、制備工藝難以工業(yè)化、包封率及載藥量低下等。但目前，主動(dòng)靶向脂質(zhì)體種類(lèi)日益繁多，且新設(shè)計(jì)的主動(dòng)靶向脂質(zhì)體可以同時(shí)利用多種靶向功能，如單克隆抗體與長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體相結(jié)合，能夠明顯增強(qiáng)長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體的靶向性。靶向脂質(zhì)體存在很多優(yōu)點(diǎn)，但目前大部分相關(guān)研究仍局限于動(dòng)物體內(nèi)藥效學(xué)及藥動(dòng)學(xué)研究，且通過(guò)動(dòng)物模型得到的研究結(jié)果并不能完全代表人體的臨床實(shí)際情況。雖然靶向脂質(zhì)體應(yīng)用于臨床還有待深入研究，但藥理學(xué)評(píng)價(jià)方法的發(fā)展和利用將為創(chuàng)制出更多更好的新型靶向脂質(zhì)體提供有力的技術(shù)支撐，使其作為載體在疾病的治療和診斷中具有更廣闊的應(yīng)用前景。