沙庫(kù)巴曲纈沙坦治療肺動(dòng)脈高壓大鼠的效果及其機(jī)制研究

李敏琦，譚思遠(yuǎn)，唐藝金，唐毅，2，鄭昭芬，2

肺動(dòng)脈高壓（pulmonary arterial hypertension，PAH）是一種以肺血管重塑和肺動(dòng)脈壓力升高為特征的致命性疾病，可導(dǎo)致右心室肥厚、纖維化，最終發(fā)展成右心衰竭甚至導(dǎo)致患者死亡［1］。盡管經(jīng)過了有效的管理與治療，PAH患者仍存在癥狀反復(fù)發(fā)作、預(yù)后欠佳等情況。因此，尋找新型的、能有效治療PAH的藥物具有重要意義。

研究表明，內(nèi)皮素1通路、前列環(huán)素通路和一氧化氮（nitric oxide，NO）/可溶性鳥苷酸環(huán)化酶（soluble guanylate cyclase，sGC）/環(huán)磷酸鳥苷（cyclic guanosine monophosphate，cGMP）通路在PAH發(fā)生發(fā)展過程中具有重要意義［2］，其中，增加cGMP水平的治療策略是目前已批準(zhǔn)的治療方案之一［3-4］。沙庫(kù)巴曲纈沙坦是一種由腦啡肽酶抑制劑和1型血管緊張素Ⅱ受體阻滯劑組成的復(fù)合藥物，其能通過調(diào)控cGMP水平及抑制利鈉肽的降解而發(fā)揮舒張血管、抗心肌肥厚及纖維化的作用［5-6］。近年來，國(guó)外有少量研究表明，沙庫(kù)巴曲纈沙坦可通過增加體內(nèi)cGMP水平而舒張小動(dòng)脈并改善血管重塑，有作為PAH有效治療方式的潛力［4，6］，但國(guó)內(nèi)尚未見相關(guān)報(bào)道。本研究旨在探討沙庫(kù)巴曲纈沙坦治療PAH大鼠的效果及其機(jī)制，以期為臨床PAH的藥物治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)時(shí)間 本實(shí)驗(yàn)時(shí)間為2020年6—11月。

1.2 實(shí)驗(yàn)大鼠 27只6周齡雄性SD大鼠（體質(zhì)量160～180 g）購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司，飼養(yǎng)在室內(nèi)空氣（O2濃度為21%）、光照/黑暗12 h交替循環(huán)的環(huán)境中，使用專用大鼠合成飼料喂養(yǎng)，不限制飲水。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)湖南省人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)文號(hào)：2020-59）。

1.3 主要實(shí)驗(yàn)試劑 野百合堿（monocrotaline，MCT）購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司，抗α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（alpha-smooth muscle actin，α-SMA）抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司，cGMP ELISA試劑盒購(gòu)自美國(guó)開曼公司，心房利鈉肽（atrial natriuretic peptide，ANP）ELISA試劑盒購(gòu)自武漢華美生物工程有限公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 分組與干預(yù)方法 適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后將大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、PAH組和沙庫(kù)巴曲纈沙坦組，各9只。將MCT溶解在1 mol/L的HCl溶液中，并用1 mol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至7.4，以制備MCT溶液；PAH組、沙庫(kù)巴曲纈沙坦組大鼠單次腹腔注射MCT溶液（60 mg/kg）以構(gòu)建PAH模型，對(duì)照組大鼠單次腹腔注射等體積0.9%氯化鈉溶液；從第2天起，對(duì)照組、PAH組給予0.5%羥乙基纖維素鈉灌胃（3 ml·kg-1·d-1），沙庫(kù)巴曲纈沙坦組給予沙庫(kù)巴曲纈沙坦灌胃（將100 mg沙庫(kù)巴曲纈沙坦溶于5 ml 0.5%羥乙基纖維素鈉中）（60 mg·kg-1·d-1），持續(xù)給藥3周。PAH組中1只大鼠在實(shí)驗(yàn)第18天死亡。

1.4.2 血流動(dòng)力學(xué)、右心室重構(gòu)指標(biāo)檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后腹腔注射2%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）以麻醉大鼠，分離頸部血管，將聚乙烯-50導(dǎo)管經(jīng)右頸外靜脈送入右心室，使用生物信號(hào)采集和分析系統(tǒng)（成都泰盟軟件有限公司）測(cè)量并記錄大鼠右心室收縮壓（right ventricular systolic pressure，RVSP），共測(cè)量3次，取平均值。檢測(cè)完RVSP后，對(duì)所有大鼠進(jìn)行安樂死，打開大鼠胸腔，立即解剖心臟和肺，將右心室從左心室和室間隔中分離出來，并分別稱重，計(jì)算右心室肥厚指數(shù)（right ventricular hypertrophy，RVH），RVH=右心室重量/（左心室重量+室間隔重量）。

1.4.3 肺血管重構(gòu)指標(biāo)檢測(cè) 使用4 ℃的杜氏磷酸鹽緩沖液灌洗大鼠肺后取出肺組織，并用4%多聚甲醛溶液固定，乙醇溶液脫水、石蠟包埋并切片后進(jìn)行HE染色；收集肺小動(dòng)脈（直徑為30～100 μm）的圖像并測(cè)量其外徑和肺動(dòng)脈中膜厚度（pulmonary artery media thickness，PAMT），計(jì)算肺動(dòng)脈中膜厚度百分比（percentage of pulmonary artery media thickness，PAMT%），PAMT%=2×PAMT/外徑×100%。大鼠肺組織經(jīng)固定切片后進(jìn)行抗α-SMA免疫組化染色，使用Image-Pro Plus 6.0版軟件（美國(guó)Media Cybernetics公司）計(jì)算α-SMA積分光密度值，即α-SMA水平。

1.4.4 血漿cGMP、ANP檢測(cè) 檢測(cè)完RVSP后，從大鼠的腹主動(dòng)脈收集全血樣本，1 000 r/min離心10 min（離心半徑8.6 cm），取血漿保存在-80 ℃冰箱中備用。參照ELISA試劑盒說明書檢測(cè)各組大鼠血漿cGMP、ANP。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血流動(dòng)力學(xué)、右心室重構(gòu)指標(biāo) 三組大鼠RVSP、RVH比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；PAH組、沙庫(kù)巴曲纈沙坦組大鼠RVSP、RVH高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；沙庫(kù)巴曲纈沙坦組大鼠RVSP、RVH低于PAH組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

表1 三組大鼠血流動(dòng)力學(xué)、右心室重構(gòu)指標(biāo)比較（±s）Table 1 Comparison of hemodynamic and right ventricular remodeling indexes in the three groups

表1 三組大鼠血流動(dòng)力學(xué)、右心室重構(gòu)指標(biāo)比較（±s）Table 1 Comparison of hemodynamic and right ventricular remodeling indexes in the three groups

注：PAH=肺動(dòng)脈高壓，RVSP=右心室收縮壓，RVH=右心室肥厚指數(shù)；1 mm Hg=0.133 kPa；a表示與對(duì)照組比較，P＜0.05；b表示與PAH組比較，P＜0.05

組別 只數(shù) RVSP（mm Hg） RVH對(duì)照組 9 28.6±6.6 0.23±0.02 PAH組 8 56.6±10.4a 0.44±0.09a沙庫(kù)巴曲纈沙坦組 9 40.6±8.4ab 0.34±0.05ab F值 22.967 28.470 P值 ＜0.001 ＜0.001

2.2 肺血管重構(gòu)指標(biāo) 三組大鼠PAMT%、α-SMA比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；PAH組、沙庫(kù)巴曲纈沙坦組大鼠PAMT%、α-SMA高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；沙庫(kù)巴曲纈沙坦組大鼠PAMT%、α-SMA低于PAH組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表2、圖1～2。

圖1 三組大鼠肺組織HE染色結(jié)果（×20）Figure 1 HE staining results of lung tissue of rats in three groups

圖2 三組大鼠肺組織α-SMA免疫組化染色結(jié)果（×20）Figure 2 Immunohistochemical staining results of α-SMA in lung tissue of rats in three groups

表2 三組大鼠肺血管重構(gòu)指標(biāo)比較（±s）Table 2 Comparison of pulmonary vascular remodeling indexes in the three groups

注：PAMT%=肺動(dòng)脈中膜厚度百分比，α-SMA=α-平滑肌肌動(dòng)蛋白；a表示與對(duì)照組比較，P＜0.05；b表示與PAH組比較，P＜0.05

組別 只數(shù) PAMT%（%） α-SMA（AU）對(duì)照組 9 18.6±2.0 1.19±0.12 PAH組 8 43.7±1.9a 1.62±0.18a沙庫(kù)巴曲纈沙坦組 9 29.0±2.1ab 1.40±0.07ab F值 340.096 24.472 P值 ＜0.001 ＜0.001

2.3 血漿cGMP、ANP 三組大鼠血漿cGMP、ANP比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；PAH組大鼠血漿cGMP低于對(duì)照組，血漿ANP高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；沙庫(kù)巴曲纈沙坦組大鼠血漿cGMP、ANP高于對(duì)照組、PAH組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表3。

表3 三組大鼠血漿cGMP、ANP比較（±s）Table 3 Comparison of plasma cGMP and ANP in the three groups

表3 三組大鼠血漿cGMP、ANP比較（±s）Table 3 Comparison of plasma cGMP and ANP in the three groups

注：cGMP=環(huán)磷酸鳥苷，ANP=心房利鈉肽；a表示與對(duì)照組比較，P＜0.05；b表示與PAH組比較，P＜0.05

組別 只數(shù) cGMP（pmol/ml） ANP（pg/ml）對(duì)照組 9 0.20±0.04 214.4±79.7 PAH組 8 0.14±0.21a 313.8±110.6a沙庫(kù)巴曲纈沙坦組 9 0.35±0.09ab 521.3±111.3ab F值 28.191 21.501 P值 ＜0.001 ＜0.001

3 討論

PAH是嚴(yán)重影響人類健康的疾病，其突出特點(diǎn)是肺血管重塑導(dǎo)致肺血管阻力和肺動(dòng)脈壓升高。在PAH發(fā)生發(fā)展過程中，肺循環(huán)后負(fù)荷持續(xù)升高可導(dǎo)致右心室肥大、右心室纖維化和右心室功能障礙，最終導(dǎo)致右心衰竭。沙庫(kù)巴曲纈沙坦是腦啡肽酶抑制劑和血管緊張素Ⅱ受體阻滯劑組成的復(fù)合藥物，可發(fā)揮舒張血管、抗心室重構(gòu)的作用。本研究旨在進(jìn)一步探討沙庫(kù)巴曲纈沙坦對(duì)PAH大鼠右心室肥厚、肺血管重構(gòu)的影響及其潛在機(jī)制。

本研究結(jié)果顯示，PAH組、沙庫(kù)巴曲纈沙坦組大鼠RVSP高于對(duì)照組，提示造模成功；沙庫(kù)巴曲纈沙坦組大鼠RVSP低于PAH組，提示沙庫(kù)巴曲纈沙坦可減小PAH大鼠右心室壓力。本研究結(jié)果還顯示，PAH組、沙庫(kù)巴曲纈沙坦組大鼠RVH高于對(duì)照組，沙庫(kù)巴曲纈沙坦組大鼠RVH低于PAH組，表明沙庫(kù)巴曲纈沙坦可以減輕PAH大鼠右心室重構(gòu)。此外，本研究結(jié)果還顯示，PAH組、沙庫(kù)巴曲纈沙坦組大鼠PAMT%、α-SMA高于對(duì)照組，沙庫(kù)巴曲纈沙坦組大鼠PAMT%、α-SMA低于PAH組，提示沙庫(kù)巴曲纈沙坦可以減輕PAH大鼠肺血管重構(gòu)。ANDERSEN等［6］通過Mikro-Tip導(dǎo)管測(cè)量SU5416和缺氧（SU5416 and hypoxia，SuHx）誘導(dǎo)的PAH大鼠的RVSP，并采用體視學(xué)方法評(píng)估肺血管和右心室組織形態(tài)學(xué)改變情況，結(jié)果顯示，沙庫(kù)巴曲纈沙坦能夠降低大鼠RVSP，減輕大鼠肺血管重構(gòu)及右心室肥厚、擴(kuò)張，本研究結(jié)果與之相似。

舒張血管以降低血管阻力是PAH的重要治療策略，而cGMP、ANP在血管舒張過程中發(fā)揮著重要作用。組織中的NO可激活sGC，而激活后的sGC可促進(jìn)其底物三磷酸鳥苷（guanosine triphosphate，GTP）轉(zhuǎn)化為cGMP并激活蛋白激酶G（protein kinases G，PKG），進(jìn)而導(dǎo)致平滑肌松弛［7-8］。有研究提示，ANP延緩PAH進(jìn)展的潛在機(jī)制可能是其與自身受體結(jié)合后，可使cGMP水平升高，進(jìn)而促進(jìn)血管舒張［9］。CLEMENTS等［10］研究顯示，沙庫(kù)巴曲纈沙坦能降低SuHx誘導(dǎo)的PAH大鼠的右心室舒張末期壓和肺動(dòng)脈收縮壓，減輕右心室肥厚及纖維化，減輕肺血管重構(gòu)，增加肺組織中ANP、腦鈉肽（brain natriuretic peptide，BNP）、cGMP水平。本研究結(jié)果顯示，PAH組大鼠血漿cGMP水平低于對(duì)照組，沙庫(kù)巴曲纈沙坦組大鼠血漿cGMP水平高于對(duì)照組、PAH組，提示沙庫(kù)巴曲纈沙坦可能通過升高血漿cGMP水平來降低PAH大鼠RVSP、減輕其右心室重構(gòu)及肺血管重構(gòu)。本研究結(jié)果還顯示，PAH組大鼠血漿ANP水平高于對(duì)照組，這可能與PAH發(fā)病時(shí)右心負(fù)荷增加導(dǎo)致心肌細(xì)胞釋放ANP有關(guān)；沙庫(kù)巴曲纈沙坦組大鼠血漿ANP水平高于對(duì)照組、PAH組，分析原因?yàn)樯硯?kù)巴曲纈沙坦可抑制腦啡肽酶，從而減少ANP的降解。

綜上所述，沙庫(kù)巴曲纈沙坦可以降低PAH大鼠RVSP，減輕大鼠右心室重構(gòu)和肺血管重構(gòu)，其機(jī)制可能與上調(diào)大鼠血漿cGMP水平有關(guān)，這為PAH的臨床治療提供了新思路。但本研究是通過MCT構(gòu)建PAH大鼠模型的，結(jié)果不宜直接套用到其他PAH模型（如SuHx誘導(dǎo)的PAH模型）上，需要在不同方法構(gòu)建的PAH模型中進(jìn)一步驗(yàn)證沙庫(kù)巴曲纈沙坦治療PAH的效果。

作者貢獻(xiàn)：李敏琦進(jìn)行文章的構(gòu)思與設(shè)計(jì)，撰寫論文；李敏琦、唐毅進(jìn)行研究的可行性分析、論文修訂；李敏琦、譚思遠(yuǎn)、唐藝金進(jìn)行實(shí)驗(yàn)實(shí)施及統(tǒng)計(jì)學(xué)處理；鄭昭芬負(fù)責(zé)文章的質(zhì)量控制及審校，對(duì)文章整體負(fù)責(zé)、監(jiān)督管理。

本文無利益沖突。