氧糖剝奪影響人臍靜脈內皮細胞緊密連接相關蛋白的機制研究

李敏，甄瑾，朱潤秀，梁子紅，崔藍心，姚遠

缺血性腦血管病是臨床常見病、多發病，其發病率、致殘率、復發率及死亡率較高，給患者家庭及社會帶來了沉重的經濟負擔［1-2］。研究表明，腦梗死后的血管再通、局部血流恢復不僅會引起血腦屏障（blood brain barrier，BBB）結構及功能破壞，且損傷的BBB也會再次加重缺血腦組織損傷，形成惡性循環［3］。既往研究表明，緊密連接相關蛋白變化將導致BBB功能改變，其中Claudin-5和Occludin是兩個重要的緊密連接相關蛋白［4］。ZO-1是與緊密連接相關蛋白功能相關的主要胞質蛋白，其可以使Claudin-5和Occludin與肌動蛋白細胞骨架連接，進而構成跨膜蛋白復合體［5］?；|金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）-9可直接降解細胞外基質，導致BBB破壞，與腦組織損傷密切相關［6］。研究表明，排斥導向分子（repulsive guidance molecules，RGM）a可通過細胞分裂周期蛋白42（cell division cycle protein 42，CDC42）而調控絲狀偽足，而緊密連接相關蛋白Occludin、ZO-1、Claudin-5水平改變與細胞骨架蛋白及肌動-肌球微細纖維系統的調控關系密切［7］。本研究旨在探究氧糖剝奪影響人臍靜脈內皮細胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVEC）緊密連接相關蛋白的機制，以期為缺血性腦血管病的臨床防治提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 主要實驗試劑與儀器 實驗試劑：DMEM購于Corning公司（貨號：R10-017-CV），Gibco?胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）購于Invitrogen（貨號：16000-044），青霉素-鏈霉素溶液（100×）購于Gibco公司（貨號：15140122），兔抗CDC42抗體（貨號：ab187643）、兔抗Claudin-5抗體（貨號：ab131259）、兔抗MMP-9抗體（貨號：ab38898）、兔抗RGMa抗體（貨號：ab169761）、兔抗ZO-1抗體（貨號：ab214228）均購于Abcam公司，鼠抗GAPDH抗體購于Proteintech公司（貨號：60004-1-lg），羊抗兔二抗購于Beyotime（貨號：A0208），抗β-actin抗體購于Proteintech公司（貨號：66009-1-Ig），山羊抗鼠二抗購于翌圣生物科技（上海）股份有限公司（貨號：33A212ES60），Fluoroshield 封固劑（含DAPI）購于Abcam公司（貨號：ab104139）。實驗儀器：細胞二氧化碳培養箱購于SANYO公司（貨號：MCO-175），離心機購于Thermo Scientific公司（貨號：Fresco 21），化學發光成像儀購于Millipore公司。

1.2 實驗時間 本實驗時間為2021年5月至2022年1月。

1.3 氧糖剝奪模型制備 HUVEC來自上海懿貝瑞生物醫藥科技有限公司細胞庫。在細胞二氧化碳培養箱中，使用含Gibco?FBS和青霉素-鏈霉素溶液（100×）的DMEM培養基進行細胞培養。制備氧糖剝奪模型：將正常培養的HUVEC按3×105個/孔鋪于6孔板，24 h后生長密度達到80%～85%，采用移液槍吸去培養基，加入2 ml 1×PBS清洗1遍，吸掉PBS，換成無糖DMEM培養基（含10% FBS、1%青霉素-鏈霉素溶液），置于缺氧培養箱（向箱室內充入95% N2和5% CO2，將氣流自動控制為20 L/min，約4 min后箱室被完全充滿，切斷氣體來源，關上白色塑料鉗夾以緊閉箱室，最后將箱室置于37 ℃環境下溫育）培養，制備氧糖剝奪模型；氧糖剝奪后，棄去無糖DMEM培養基，置于含1% FBS、1%PBS的DMEM高糖培養基中，培養24 h。

1.4 細胞形態觀察及細胞增殖水平檢測 將HUVEC分為正常組和氧糖剝奪6 h組、氧糖剝奪24 h組。正常組HUVEC進行正常培養；氧糖剝奪6 h組HUVEC制備氧糖剝奪模型，并在缺氧培養箱中培養6 h；氧糖剝奪24 h組HUVEC制備氧糖剝奪模型，并在缺氧培養箱中培養24 h。在倒置顯微鏡下觀察HUVEC的形態并拍照。然后分別在96孔板中接種3組細胞懸液（100 μl/孔），向每孔加入10 μl CCK-8溶液孵育，孵育1、2、3、4 d時，采用酶標儀測定450 nm處的吸光度，制成標準曲線，記錄細胞增殖水平。

1.5 RGMa敲減質粒的構建 將shRNA序列（RGMa靶點序列：GTGTGTGGACCAGAAGGTGTA）連接至骨架質粒大腸桿菌感受態細胞Top10 LV-002（YBR，YBRLV002）載體中，酶切位點1為EcoR 5-'GAATTC-3'，酶切位點2為AgeI 5-'ACCGGT-3'，載體連接使用T4 DNA Ligase（EL0016，Fermentas）完成，質粒載體構建成功后進行測序分析，如質粒序列與預設序列一致、測序結果為單一峰，則提示該病毒可敲低RGMa。質粒轉化與克?。翰捎脽峒し▽①|粒轉入大腸桿菌感受態細胞Top10（酶康GTC，GTCBC-G001），平板篩選培養，單克隆擴大培養并提取高純度的質粒DNA。

1.6 慢病毒轉染 將RGMa敲減質粒包裝成慢病毒，準備HUVEC，復蘇HUVEC并進行慢病毒轉染：慢病毒轉染前18～24 h，將貼壁細胞以1×106個/孔鋪到6孔板中培養，使細胞在慢病毒轉染時的數量為2×106個/孔左右。第2天用含6 μg/ml polybrene的新鮮培養基2 ml替換原培養基，加入適量病毒懸液，于37 ℃環境下孵育；繼續培養24 h，采用新鮮培養基替換含有病毒的培養基，繼續培養48～72 h，熒光顯微鏡下觀察轉染率達到80%以上，表明慢病毒轉染成功。

1.7 Western blot法檢測RGMa、緊密連接相關蛋白、MMP-9、CDC42 將HUVEC分為氧糖剝奪組、空質粒組、RGMa質粒敲減組。氧糖剝奪組HUVEC制備氧糖剝奪模型，并在缺氧培養箱中培養24 h；空質粒組HUVEC在氧糖剝奪組基礎上，轉染空載體；RGMa質粒敲減組HUVEC在氧糖剝奪組基礎上，轉染慢病毒。然后從培養箱中取出HUVEC，棄去細胞培養液，PBS洗滌1次；棄去PBS，加入細胞裂解液，置于4 ℃冰上；采用移液槍頭吹打至細胞充分裂解，將細胞裂解樣品轉移至離心管，冰上繼續裂解10～15 min；離心（4 ℃，12 000 r/min，離心半徑10 cm）10 min，取上清液并轉移到新的離心管中，加入Loading Buffer（100 ℃，20 min）后再次離心（4 ℃，12 000 r/min，離心半徑10 cm）1 min，于-20 ℃環境中保存備用。行SDSPAGE，將蛋白轉印到PVDF膜上；加入5%脫脂牛奶，室溫封閉1 h，加入一抗兔抗CDC42抗體（1∶3 000）、一抗兔抗Claudin-5抗體（1∶1 000）、一抗兔抗MMP-9抗體（1∶1 000）、一抗兔抗RGMa抗體（1∶5 000）、一抗兔抗ZO-1抗體（1∶2 000）及一抗鼠抗GAPDH抗體（1∶30 000），室溫孵育2 h；TBST洗膜3次，10 min/次；加入辣根過氧化物酶-羊抗兔二抗（1∶3 000），室溫孵育1 h；TBST洗膜3次，10 min/次。使用化學發光成像儀進行化學發光顯色，檢測RGMa、Claudin-5、ZO-1、MMP-9及CDC42。

1.8 統計學方法 采用SPSS 23.0統計學軟件進行數據處理。計量資料以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗；兩組間比較采用成組t檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 氧糖剝奪對細胞形態的影響 與正常組相比，氧糖剝奪6 h組、氧糖剝奪24 h組細胞體腫脹或變形，光暈消失，細胞邊緣不清晰，細胞體內出現空泡，突起縮短，連接斷裂，視野內顆粒樣物質增多，細胞變形，見圖1。

圖1 正常組、氧糖剝奪6 h組、氧糖剝奪24 h組細胞形態（×200）Figure 1 Cell morphology in the normal group，oxygen glucose deprivation 6 h group and oxygen glucose deprivation 24 h group

2.2 氧糖剝奪對細胞增殖水平的影響 孵育1、2、3、4 d，正常組和氧糖剝奪6 h組細胞增殖水平比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；孵育1、2、3、4 d，氧糖剝奪24 h組細胞增殖水平均低于正常組，差異有統計學意義（P＜0.05），見表1～2。

表1 正常組和氧糖剝奪6 h組孵育不同時間細胞增殖水平比較（±s，n=3）Table 1 Comparison of cell proliferation levels between normal group and oxygen glucose deprivation 6 h group at different time of incubation

表1 正常組和氧糖剝奪6 h組孵育不同時間細胞增殖水平比較（±s，n=3）Table 1 Comparison of cell proliferation levels between normal group and oxygen glucose deprivation 6 h group at different time of incubation

組別 孵育1 d 孵育2 d 孵育3 d 孵育4 d正常組 1.36±0.01 2.28±0.01 5.42±0.07 10.4±0.03氧糖剝奪6 h組 1.35±0.01 2.30±0.03 5.33±0.04 10.5±0.06 t值 0.71 1.25 1.80 1.90 P值 0.52 0.28 0.15 0.13

表2 正常組和氧糖剝奪24 h組不同時間細胞增殖水平比較（±s，n=3）Table 2 Comparison of cell proliferation levels between normal group and oxygen glucose deprivation 24 h group at different time of incubation

表2 正常組和氧糖剝奪24 h組不同時間細胞增殖水平比較（±s，n=3）Table 2 Comparison of cell proliferation levels between normal group and oxygen glucose deprivation 24 h group at different time of incubation

組別 孵育1 d 孵育2 d 孵育3 d 孵育4 d正常組 1.36±0.01 2.28±0.01 5.42±0.07 10.40±0.03氧糖剝奪24 h組 1.00±0.00 1.00±0.01 1.30±0.01 1.50±0.02 t值 49.94 141.40 98.61 394.80 P值 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01

2.3 RGMa質粒敲減對RGMa、緊密連接相關蛋白、MMP-9、CDC42的影響 氧糖剝奪組、空質粒組、RGMa質粒敲減組RGMa、Claudin-5、ZO-1、MMP-9、CDC42比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；氧糖剝奪組和空質粒組RGMa、Claudin-5、CDC42比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；空質粒組ZO-1、MMP-9低于氧糖剝奪組，差異有統計學意義（P＜0.05）；RGMa質粒敲減組RGMa、ZO-1、CDC42低于氧糖剝奪組，Claudin-5、MMP-9高于氧糖剝奪組，差異有統計學意義（P＜0.05），見表3。

表3 氧糖剝奪組、空質粒組、RGMa質粒敲減組RGMa、緊密連接相關蛋白、MMP-9、CDC42比較（±s，n=3）Table 3 Comparison of RGMa，tight junction-related protein，MMP-9 and CDC42 in the oxygen glucose deprivation group，empty plasmid group，RGMa plasmid knockdown group

表3 氧糖剝奪組、空質粒組、RGMa質粒敲減組RGMa、緊密連接相關蛋白、MMP-9、CDC42比較（±s，n=3）Table 3 Comparison of RGMa，tight junction-related protein，MMP-9 and CDC42 in the oxygen glucose deprivation group，empty plasmid group，RGMa plasmid knockdown group

注：RGM=排斥導向分子，MMP=基質金屬蛋白酶，CDC42=細胞分裂周期蛋白42；a表示與氧糖剝奪組比較，P＜0.05

組別 RGMa Claudin-5 ZO-1 MMP-9 CDC42氧糖剝奪組 0.84±0.03 0.63±0.03 0.51±0.03 0.59±0.02 0.85±0.07空質粒組 0.76±0.05 0.55±0.01 0.25±0.05a0.40±0.03a 0.81±0.35 RGMa質粒敲減組 0.65±0.01a0.79±0.12a0.29±0.02a0.75±0.03a 0.45±0.09a F值 23.40 8.73 125.59 46.42 28.19 P值 ＜0.01 0.02 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01

3 討論

在發達國家，缺血性腦卒中是僅次于癌癥和心臟病的第三大死亡原因，腦缺血/再灌注導致細胞損傷的機制比較復雜。腦血管內皮細胞及其之間的緊密連接、基底膜、周細胞及星形膠質細胞是BBB的結構基礎，BBB的結構和功能完整性是維持大腦內環境穩定的重要保障［8］。近年越來越多的證據表明，BBB功能障礙和內皮細胞炎癥參與了腦缺血/再灌注損傷的病理過程［9］。BBB功能障礙使大量炎癥因子如腫瘤壞死因子α、腫瘤壞死因子β、白介素1、白介素6及其他有害物質進入大腦，進而加重腦損傷［3］；而維持BBB的完整性是保護大腦免受腦缺血損傷的關鍵措施。目前，腦缺血/再灌注損傷后BBB功能障礙的分子機制尚不清楚。血管內皮細胞間緊密連接是維持血管通透性和機械屏障的重要結構基礎，胞質附著蛋白家族中ZO-1和跨膜蛋白Occludin、Claudin-5是BBB緊密連接的主要組分，也是研究BBB結構及功能變化的重要指標。

HUVEC是一種具有完整內皮屏障功能的人源內皮細胞，是研究BBB功能的一種理想的內皮細胞模型［10］。因此，本研究采用HUVEC構建氧糖剝奪模型，結果顯示，孵育1、2、3、4 d，正常組和氧糖剝奪6 h組細胞增殖水平比較差異無統計學意義，但氧糖剝奪24 h組細胞增殖水平均低于正常組，且氧糖剝奪24 h組細胞形態發生了明顯改變，提示氧糖剝奪24 h模擬腦缺血缺氧效果較好。

在成年神經系統中RGMs具有多種生物學活性，其可以參與調節細胞形態和免疫系統、抑制新生血管形成及調控BBB通透性、多種肌動蛋白運動、細胞骨架重組等細胞生理代謝過程［11］。此外，RGMa作為一種新的軸突分子，其主要作用是調控神經元的分化、增殖等［12］。研究表明，RGMa可以通過Rho激酶和GSK-3β信號通路而使腦衰反應調節蛋白2（collapsin response mediator protein 2，CRMP-2）磷酸化，進而抑制軸突生長［13］。Rho激酶和CDC42均屬于Ras超家族成員，其中CDC42能結合鳥嘌呤三核苷酸，在哺乳動物細胞信號轉導系統中發揮著“分子開關”樣的重要作用，且對細胞骨架的動態變化具有重要調節作用［14］。血管內皮之間緊密連接相關蛋白發生改變可引起BBB的結構變化，而RGMa可以通過RhoA或CDC42而影響BBB的緊密連接［15］。既往實驗表明，腺病毒載體誘導的RGMa沉默可減輕大腦中動脈閉塞/再灌注大鼠BBB功能障礙［9］。RGMa及其受體Neogenin在大鼠腦缺血/再灌注損傷后皮質神經元及血管內皮上表達，可影響梗死灶周圍皮質血管再生［16］。BBB的完整性可由緊密連接相關蛋白維持，而Claudin-5和ZO-1在封閉緊密連接和維持BBB完整性方面起著至關重要的作用，缺血損傷可導致Claudin-5和ZO-1明顯減少［17］。MMP是體內重要的細胞外基質降解酶，既往研究表明，在缺血性腦組織中MMP-9表達增加及活性增強，并通過降解細胞外基質而提高BBB的通透性［18］。鑒于Claudin-5、ZO-1及MMP-9在影響BBB通透性中的關鍵作用，本實驗構建RGMa敲減質粒，并將其包裝成慢病毒后轉染HUVEC，結果顯示，RGMa質粒敲減組RGMa、ZO-1、CDC42低于氧糖剝奪組，Claudin-5高于氧糖剝奪組，提示RGMa質粒敲減后CDC42和ZO-1表達下調，Claudin-5表達上調，推測氧糖剝奪引起HUVEC緊密連接相關蛋白改變的機制可能與RGMa影響CDC42蛋白有關。既往研究顯示，缺血損傷可導致Claudin-5明顯減少［17］，而本研究結果顯示氧糖剝奪可導致Claudin-5表達上調，分析原因可能與RGMa干預或CDC42有關，仍需要動物實驗進一步驗證。本研究結果還顯示，空質粒組MMP-9低于氧糖剝奪組，RGMa質粒敲減組MMP-9高于氧糖剝奪，提示MMP-9降低與轉染空載體有關。

綜上所述，氧糖剝奪24 h可引起HUVEC增殖水平降低，氧糖剝奪引起HUVEC緊密連接相關蛋白改變的機制可能為RGMa通過CDC42而影響BBB的緊密連接，這對于探究腦缺血損傷患者BBB功能障礙機制具有重要意義。

作者貢獻：姚遠進行文章的構思與設計，負責文章的質量控制及審校，并對文章整體負責、監督管理；李敏、梁子紅進行研究的實施與可行性分析；李敏、甄瑾、梁子紅、崔藍心進行數據收集、整理、分析；甄瑾、朱潤秀進行結果分析與解釋；李敏、姚遠負責撰寫、修訂論文。

本文無利益沖突。