底泥中降解鄰苯二甲酸二甲酯菌群的特性研究*

周 婷 王宏杰,2,3# 董文藝,2,3 黃 瀟 楊 墨

(1.哈爾濱工業大學(深圳)土木與環境工程學院,廣東 深圳 518055;2.哈爾濱工業大學環境學院,城市水資源與水環境國家重點實驗室,黑龍江 哈爾濱 150090;3.深圳市水資源利用與環境污染控制重點實驗室,廣東 深圳 518055;4.南京信息工程大學環境科學與工程學院,江蘇 南京 210000)

鄰苯二甲酸二甲酯(DMP)由于用途廣泛[1],加上溶解度低、對顆粒物具有較強親和性[2],在河道底泥中的檢出率較高[3],其中深圳市某感潮河道底泥就受到了DMP污染。目前用于去除底泥中DMP的方法主要有植物法和土著微生法,但是前者受天氣等環境影響較大,對DMP利用不穩定[4],而土著微生物法具有廉價、綠色無污染、受環境影響小等優點[5],是修復受DMP污染底泥的好方法[6]。

土著微生物法可以用單一菌株,也可以用混合菌群。DMP結構比較復雜,其中間代謝產物也表現出穩定性和一定的微生物毒害作用,多數單一菌株只能對DMP進行初步降解,無法對其實現完全礦化[7]。深圳市某感潮河道鹽度較高,重金屬、有機物等污染物種類繁多,且pH、溫度、鹽度對微生物生長代謝所需酶類物質的活性影響較大,對物質進出細胞的速率等也有影響[8],因此單一菌株較難適應此類復雜環境。與單一菌株相比，土著混合菌群的生態系統更穩定,對環境適應能力更強[9],可以實現對難降解有機物的徹底礦化[10]。HE等[11]馴化得到的混合菌群HD-1對鄰苯二甲酸二丁酯(DBP)的降解效果相較于單一菌株就更具優勢。

本研究從深圳市某感潮河道底泥中富集馴化出具有DMP降解功能的土著混合菌群,對其群落結構進行分析,分析pH、溫度和鹽度對其降解DMP的影響,研究其對DMP的降解途徑,并用于模擬底泥中DMP的降解,以拓寬該菌群的應用范圍。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 底泥樣品采集

馴化混合菌群所用底泥取自深圳市某感潮河道,取樣深度為0～60 cm,采集到的底泥避光運回實驗室,冷庫中保存。

1.1.2 無機鹽培養液(MSM)

MSM成分：2 g/L (NH4)2SO4,0.098 g/L MgSO4,0.011 g/L CaCl2,0.594 g/L Na2HPO4,1.5 g/L KH2PO4,0.5 g/L NaCl,1 mL/L微量元素。微量元素中含：1.093 g/L FeSO4,2.544 g/L MnCl2,1 g/L ZnCl2,0.545 g/L CoCl2,1.090 g/L NiCl2,0.320 g/L CuSO4。

1.1.3 模擬底泥

模擬底泥用校園內潔凈土壤配制,使用前對其進行121 ℃高溫滅菌。配置后pH為6～7,含砂率15%～20%,DMP質量濃度為0～100 mg/kg,含水率41%～57%。

1.2 實驗方法

1.2.1 土著混合菌群的富集馴化

取10 g采集的底泥樣品溶于20 mL去離子水中,在25 ℃的恒溫搖床中以140 r/min振蕩攪拌1 d后靜置,得到底泥浸出液。接種1 mL底泥浸出液于100 mL MSM中,加入DMP使其質量濃度為1 mg/L,在25 ℃的恒溫搖床中以140 r/min振蕩培養7 d。靜置后,取2 mL上清液接種于100 mL MSM中,加入DMP使其質量濃度為5 mg/L,在25 ℃的恒溫搖床中以140 r/min振蕩培養7 d;重復以上操作,其中MSM中DMP質量濃度逐次增大,依次為5、10、20、50、100 mg/L,實現富集馴化的目的。最后一次培養7 d后,檢測培養液中DMP的殘余量。將最終富集馴化得到的功能菌群命名為ZM。

1.2.2 菌懸液的制備

將菌群ZM培養至對數生長期后,轉移至已滅菌的50 mL離心管中離心分離并過濾掉上清液;用50 mL無菌磷酸鹽緩沖液(Biosharp 1×PBS,pH=7.4)重懸浮菌體沉淀物后繼續離心。待上清液透明后即完成離心,用MSM重懸浮再次離心得到的菌體沉淀物即為菌懸液，4 ℃密封保存,備用。

1.2.3 菌群ZM的降解性能研究

(1) 環境因子影響實驗

將100 mL含有一定DMP的MSM加入三角燒瓶中,接種2 mL菌懸液,用封口膜封住瓶口后,在恒溫搖床中以140 r/min振蕩培養,pH研究了4、5、6、7、8、9、10共7個水平(30 ℃,鹽度0,30 mg/L DMP)；培養箱溫度研究了15、20、25、30、35、40 ℃共6個水平(pH=6,鹽度0,100 mg/L DMP);鹽度研究了0、0.05%、0.10%、1.00%、2.00%、3.00%、4.00%共7個水平(pH=6,35 ℃,100 mg/L DMP)。每個處理設置3組平行實驗,定時取樣并檢測DMP殘余量,計算殘余率。

(2)菌群ZM對DMP的降解途徑探析

將1 L DMP質量濃度約為100 mg/L的MSM(pH=6,鹽度0.05%)加入三角燒瓶中,接種2 mL菌懸液,用封口膜封住瓶口后,在35 ℃的恒溫搖床中以140 r/min振蕩培養,定時取樣并分析中間產物。

(3) 模擬底泥中菌群ZM對DMP的降解

配制不同初始DMP含量的模擬底泥,加入底泥質量3%的菌懸液,攪拌均勻后用封口膜封住瓶口,置于35 ℃恒溫箱培養。設置3組平行試驗,定時取樣檢測DMP殘余量,并計算降解量和降解率。

1.2.4 分析檢測方法

(1) 初始底泥微生物群落結構檢測

群落結構由美吉生物公司進行檢測。

(2) 培養液中DMP及其中間代謝產物的檢測

檢測儀器用超高效液相色譜儀(UPLC,Acquity H-Class),色譜柱為C18(1.7 μm,2.1 mm×100 mm),采用甲醇和水(體積比3∶2)作為流動相,測樣前需過膜處理。通過對比標準樣品的保留時間,在240 nm波長下檢測DMP、鄰苯二甲酸單甲酯(MMP)和鄰苯二甲酸(PA),在226 nm波長下檢測原兒茶酸(PCA)。

(3) 底泥中DMP的檢測

樣品前處理包括冷凍干燥、微波萃取及濃縮。其中,冷凍干燥使用冷凍型高通量高速離心機(Eppendof,Centrifuge 5810R),干燥時長為48 h。微波萃取方法如下：將2.000 g凍干底泥和15 mL乙腈混合于萃取罐中,微波萃取參數設置參考文獻[12],萃取時間改為30 min;冷卻后,上清液過玻璃纖維濾膜,保留萃取液;底泥重復萃取1次,合并萃取液,通過旋轉蒸發、氮吹濃縮至約1 mL,定容至2 mL,待上機檢測。

檢測儀器用氣相色譜—質譜聯用儀(GC—MS),色譜柱為硅熔毛細管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm),進樣口溫度為290 ℃,電子電離,離子源溫度為230 ℃。柱溫箱初始溫度為50 ℃,1.00 min后,開始升溫,11.33 min后達到220 ℃,保持1.00 min后,繼續升溫2.40 min達到280 ℃,保持1.00 min。底泥中DMP的加標回收率為80%～110%。

2 結果與分析

2.1 菌群ZM的群落結構分析

菌群ZM與初始底泥微生物多樣性指數見表1。兩者的Coverage指數均為0.999,說明本次測序的微生物相對豐度與實際相符,結果可信。初始底泥微生物的Ace指數和Shannon指數均大于菌群ZM,說明初始底泥中物種豐富度較高,群落多樣性也非常大,而菌群ZM的物種豐富度和群落多樣性明顯降低,這是由于在富集馴化過程中始終以DMP為單一碳源,DMP降解菌大量生長、逐漸成為優勢菌,而不能降解DMP的菌因缺乏碳源而逐漸被淘汰。

表1 菌群ZM與初始底泥微生物的多樣性指數Table 1 Diversity indexes of ZM consortium and origin sediment microorganisms

菌群ZM和初始底泥微生物在不同水平上的群落組成如圖1所示。由圖1(a)可知,初始底泥微生物主要包括10個門,而菌群ZM主要由變形桿菌門(80.2%)、疣微菌門(15.8%)和擬桿菌門(3.7%)3個門組成。經過富集馴化后,變形桿菌門相對豐度增加了2.47倍,疣微菌門增加了16.95倍。相關研究表明,變形桿菌門、擬桿菌門中多種微生物具有DMP降解能力,但針對疣微菌門的相關報道相對較少[13-14],推測是因為疣微菌門中存在與DMP降解菌共生的微生物。

圖1 菌群ZM與初始底泥微生物的群落微生物相對豐度Fig.1 Community microorganism relative abundance of ZM consortium and origin sediment microorganisms

由圖1(b)可知,經過富集馴化后,在綱水平上,微生物的菌綱數量從17(初始底泥微生物)降至5(菌群ZM)。其中,γ-變形菌綱(16.2%)相對豐度增大了0.82倍,α-變形菌綱(7.4%)增大了5.86倍。目前已報道的多項研究中DMP降解菌多屬于上述兩種菌綱[15-17]。

由圖1(c)可知,菌群ZM中85%的微生物屬于新鞘氨醇桿菌屬、代爾夫特菌屬和Saccharimonadales,這些菌屬中多種微生物被證明了具有DMP降解能力[18-20],而初始底泥微生物中這些菌屬占比很低。

綜上,推測菌群ZM中具有DMP降解功能的主要微生物屬于變形桿菌門α-變形菌綱的新鞘氨醇桿菌屬。

2.2 環境因子對菌群ZM降解DMP的影響

2.2.1 pH

pH對菌群ZM降解DMP的影響如圖2所示。隨著pH從4增至6,菌群ZM對DMP的降解能力是提升的;而繼續增大pH,降解能力開始下降。菌群ZM在pH為6時,24 h后DMP殘余率下降至5%;pH為10時,即使降解了96 h,DMP殘余率依舊大于20%。這可能是因為微生物的細胞膜在堿性環境中會被改變,選擇透過性受損導致[21]。而且,在堿性較強的條件下,微生物酶的空間結構也容易變形,活性降低,穩定性變差[22]。總體而言,在不同pH環境中菌群ZM對DMP始終保持有一定的降解能力。綜上,菌群ZM在pH為6的環境中具有最好的DMP降解能力,同時也表現出一定的耐酸堿性。

圖2 pH對菌群ZM降解DMP的影響Fig.2 Influence of pH on DMP degradation by ZM consortium

2.2.2 溫 度

溫度對菌群ZM降解DMP的影響如圖3所示。當溫度從15 ℃逐漸升高到35 ℃,DMP降解速率顯著提升;然而繼續升溫到40 ℃,反而略有降低。因此,菌群ZM在35 ℃時具有最佳的DMP降解能力,18 h即可將DMP完全降解,而在15 ℃時需要70 h才能將DMP完全降解。在15 ℃的低溫環境下,菌群ZM的生命活動速率會變慢[23],DMP分子運動也會變慢,生化酶促反應會受到抑制[24]。綜上,最適合菌群ZM降解DMP的溫度為35 ℃。

圖3 溫度對菌群ZM降解DMP的影響Fig.3 Influence of temperature on DMP degradation by ZM consortium

2.2.3 鹽 度

不同鹽度下菌群ZM降解DMP的能力差異明顯(見圖4)。當鹽度低于1.00%時,鹽度對菌群ZM降解DMP的能力表現出促進作用,鹽度為0.05%～1.00%時16 h就可以將DMP完全降解,而鹽度為0時DMP殘余率約35%。然而,當鹽度增加到4.00%時,菌群ZM幾乎完全不能降解DMP,26 h后DMP殘余率仍為100%。這可能是因為鹽度超過一定范圍后,蛋白質逐漸發生變性，酶活性受到抑制[25]。但是在3.00%鹽度下,菌群ZM仍有一定的DMP降解能力,說明其對鹽度有良好的耐受性。綜上,菌群ZM在鹽度為0.05%～1.00%的環境中具有很好的DMP降解能力,同時也表現出一定的鹽度耐受性。

圖4 鹽度對菌群ZM降解DMP的影響Fig.4 Influence of salinity on DMP degradation by ZM consortium

2.3 菌群ZM對DMP的降解途徑

由圖5可見,DMP含量隨著降解時間延長而逐漸降至零,而產生了MMP、PA和PCA 3種中間代謝產物,其中MMP含量相對較低,且只在前6 h呈現增加趨勢,這可能是因為MMP會被紅球菌屬等微生物高效降解[26]。PA含量前4 h較少,然后呈先增后減趨勢變化,其減少的原因推測是由于細桿菌屬等微生物利用PA的速率比紅球菌屬生成PA的速率快[27]。另外,PCA的含量特別低,可能是因為PCA結構簡單,且對微生物的毒害作用弱,易于被甲基桿菌屬等微生物降解[28]。

圖5 菌群ZM降解DMP過程中各物質質量濃度變化Fig.5 Mass concentration changes of various substances during the degradation of DMP by ZM consortium

結合圖5和文獻[29]推測菌群ZM降解DMP的途徑如下：通過轉酯化作用,DMP被水解生成MMP;隨后,MMP通過脫酯作用生成PA;PA最后轉化為PCA,隨后進入三羧酸循環,完成對DMP的完全降解,如圖6所示。

圖6 菌群ZM對DMP的降解途徑Fig.6 Degradation pathway of DMP by ZM consortium

2.4 菌群ZM對模擬底泥中DMP的降解

離開了土著環境,在模擬底泥中,菌群ZM對DMP仍有較好的降解能力(見圖7)。在1～100 mg/kg,隨著初始DMP含量增加,菌群ZM的DMP降解率先增后減;當初始DMP質量濃度為15 mg/kg時,1 d時即可降解約60% DMP。繼續增大初始DMP含量,菌群ZM對DMP的降解速率受到抑制,但是在100 mg/kg條件下2 d后仍然達到了70%左右,且降解量一直在逐漸增加,說明菌群ZM對高濃度DMP具有一定耐受性。WANG等[30]從底泥中馴化得到了一個可以在48 h內將500 mg/L DBP完全降解的菌群LV-1,但是未對其在實際底泥中的降解效果進行驗證。周長健[31]從環境中分離出一株鄰苯二甲酸二辛脂(DEHP)降解菌JQ-1,該菌株需要42 d才能將模擬土壤中50 mg/kg DEHP降解至低濃度。YANG等[32]馴化得到的菌群B1在含有100 mg/kg DBP土壤中培養2 d后只能降解40%的DBP。對比分析可知,本研究中的菌群ZM在修復受DMP污染底泥方面具有一定的實際應用價值。

圖7 菌群ZM對模擬底泥中DMP的降解Fig.7 Degradation of DMP in simulated sediment by ZM consortium

3 結 論

(1) 菌群ZM的最主要優勢菌為變形桿菌門α-變形菌綱的新鞘氨醇桿菌屬,屬于DMP降解的功能菌。

(2) 菌群ZM最適合降解DMP的pH為6、溫度為35 ℃,在0.05%～1.00%的鹽度內具有較好的耐受性。

(3) 菌群ZM對模擬底泥中的高DMP仍保持優異的降解性能,2 d內可以降解70%初始質量濃度為100 mg/kg的DMP,具有較好的實際應用價值。