超聲造影及剪切波彈性成像評估急性放射性肝損傷：實驗研究

趙 彤，王 戰，張 超，段彤彤，房 寧，謝 凱，周曉莉，范光磊，李曉琴*，倪昕曄

(1.南京醫科大學附屬常州第二人民醫院超聲科，3.放療科，4.病理科，5.核醫學科，江蘇 常州 213164；2.大連醫科大學第二臨床醫學院，遼寧 大連 116000)

放射性肝損傷(radiation-induced liver injury，RILI)系正常肝組織受到一定劑量放射線輻射后發生肝靜脈閉塞性改變及炎癥反應所致以局部纖維化為主要病理改變的疾病，為放射治療的重要并發癥之一[1-2]；急性RILI指發生于放射治療后4～8周內的肝損傷，可持續性進展，晚期可發展為不可逆性肝纖維化直至肝衰竭。局部RILI仍屬可逆，早期診斷RILI并及時予以干預極為重要[3]。CT、MR彌散加權成像、超聲造影(contrast enhanced ultrasound，CEUS)等均可用于早期評估RILI，但尚未形成統一標準，目前仍以穿刺活檢為診斷RILI的金標準[4-6]。剪切波彈性成像(shear-wave elastography，SWE)用于評估肝纖維化具有無創、無輻射等優點[7-8]，但診斷急性RILI尚處于探索階段。本研究通過動物實驗觀察CEUS和SWE評估急性RILI的價值。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與模型建立 20只6月齡雄性健康新西蘭兔由蘇州高新區鎮湖實驗動物科技有限公司提供[SCXK(蘇)2020-0007]，體質量2.9～3.8 kg，隨機均分為4組，每組5只，常規單籠飼養。本研究經南京醫科大學實驗動物福利倫理委員會批準(2020_KY146-01)。

經兔耳緣靜脈注射3%戊巴比妥鈉(1 ml/kg體質量)麻醉動物后，將其仰臥位保定于實驗臺，常規備皮。采用Mindray Resona 7彩色超聲診斷儀、頻率7～9 MHz L9-3U線陣探頭行CEUS和SWE檢查并確保各組兔肝臟基礎情況相近后，將探頭垂直于體表掃查肝右葉并進行體表定位，設定約3.0 cm×3.0 cm照射野，并于體表勾畫其邊界。采用Elekta Infinity直線加速器以6MV X線照射，源皮距100 cm，照射劑量600 cGy/min，參照文獻[9]方法分別予各組單次0、16、20、24 Gy劑量照射，而后于室溫下待兔自然蘇醒并繼續常規飼養28天。

1.2 超聲檢查 建模后以二維超聲顯示照射區域肝實質及大血管，之后進入造影模式，經耳緣靜脈團注聲諾維造影劑(0.1 ml/kg體質量)并跟注2 ml生理鹽水行CEUS，盡量保持每只兔所選切面一致，采集并儲存注入造影劑后300 s動態造影圖像。由2名具有5年以上工作經驗的超聲科醫師觀察照射區，以其內顯像均勻的肝實質為ROI，獲取自肝動脈顯影直至顯影消失的時間-強度曲線(time-intensity curve，TIC)，記錄峰值強度(peak intensity，PI)、達峰時間(time to peak，TTP)和峰值強度減半時間(the half time of peak intensity descent，DT/2)；各測量5次，以平均值作為結果(圖1A、1B)。之后切換至彈性成像模式，于照射區域肝實質選定ROI，選擇可信區間>90%測量彈性值，每名醫師各測量6～10次楊氏模量值，以平均值作為平均彈性模量(mean elastic modulus，Emean)，之后測量最大彈性模量(maximum elastic modulus，Emax)，見圖1C。

圖1 兔急性RILI照射區肝臟超聲表現 A.CEUS(紅色圓圈為ROI，紅色曲線為TIC)；B.CEUS定量分析圖；C.SWE圖(白色方框為取樣框，白色圓圈為ROI)

1.3 病理學分析 完成超聲檢查后處死動物，對各組兔均于或相當于照射區域取肝組織并以甲醛固定24 h行常規包埋、切片及HE染色。由2名不知曉分組情況的病理科醫師參照文獻[7]標準根據肝臟損傷程度重新進行分組，建立對照組和輕度、中度及重度損傷組；意見不一致時經與另1名具有10年以上工作經驗的病理科醫師協商后達成一致意見。

1.4 統計學分析 采用SPSS 26.0統計分析軟件。以±s表示符合正態分布的計量資料，組間行單因素方差分析；兩兩比較采用LSD檢驗。以Spearman秩相關分析觀察CEUS和SWE參數與肝臟損傷程度的相關性。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 一般情況 至實驗結束，20只兔全部存活。0 Gy輻射后兔基本情況未見明顯異常；16、20 Gy輻射后兔精神狀態尚佳，食欲輕度減退，體質量變化不明顯；24 Gy輻射后兔精神萎靡，食欲減退，體質量降低。

2.2 病理所見及分組 對照組：兔肝臟組織呈鮮紅色、邊緣銳利，表面光滑、質地柔軟，光鏡下見肝細胞形態正常，肝小葉分界清楚。損傷組：兔肝臟組織質地均變硬；輕度損傷組兔肝組織血管擴張充血，匯管區見少量炎性細胞浸潤，肝細胞無顯著改變；中度損傷組兔肝組織血管充血擴張，匯管區可見較多炎性細胞浸潤，局部肝細胞水腫變性；重度損傷組兔肝臟組織呈暗紅色，失去光澤，光鏡下見肝細胞廣泛水腫變性伴肝細胞壞死，匯管區見大量炎性細胞浸潤。見表1、圖2。

圖2 病理圖示兔急性RILI(HE，×100) A.對照組；B.輕度損傷組；C.中度損傷組；D.重度損傷組

表1 根據經不同輻射劑量后兔肝臟病理改變的分組結果(只)

2.3 CEUS 隨肝損傷程度加重，照射區兔肝組織TIC的TTP逐漸延長，組間兩兩比較差異均有統計學意義(P均<0.05)。相比對照組，各肝損傷組PI均不同程度降低(P均<0.05)，但組間差異均無統計學意義(P均>0.05)。DT/2總體差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

2.4 SWE 相比對照組，各肝損傷組Emean均增加，Emean則隨損傷程度加重而逐漸減小(P均<0.05)。與對照組相比，各肝損傷組Emax均增加(P均<0.05)，重度損傷組Emax小于輕度損傷組(P均<0.05)，而輕、重度損傷組與中度損傷組間Emax差異均無統計學意義(P均>0.05)。見表2。

表2 不同程度急性RILI兔肝臟超聲參數比較

2.5 相關性分析 照射后兔肝損傷程度與TTP呈正相關(r=0.899，P<0.05)，而與PI、Emean、Emax均呈負相關(r=-0.777、-0.877、-0.586，P均<0.05)。

3 討論

RILI主要病理改變為肝中央小葉靜脈損傷、肝血竇淤血造成的肝實質血流灌注改變，而常規多普勒超聲無法用于分析上述改變。作為血池示蹤劑，微泡造影劑可隨血液循環進入微病灶，使毛細血管及血竇顯影[10]，故利用CEUS可定量評估肝纖維化，而RILI血流動力學改變與肝纖維化相似。本研究結果顯示，照射后兔肝實質TTP、PI與肝臟損傷程度相關，TTP隨肝臟損傷程度加重而逐漸延長，各肝損傷組PI均有所降低，與XIN等[6,11]的結果相符。肝小葉中央靜脈內皮細胞受損后形成微凝血酶，并經一系列生物學改變而致小葉中央肝細胞循環受損，引起肝血竇內血流量減少；RILI過程中，炎性細胞浸潤、肝細胞水腫變性及脂肪變性發生并進行性加重，使肝實質內管道受壓、肝實質內血流灌注進一步減少；隨著肝損傷加重，肝臟逐漸纖維化，纖維分隔附近肝竇毛細血管化，肝細胞與血液之間物質交換減少，肝竇萎縮，部分肝細胞壞死，肝竇內血流淤滯[12-13]；以上改變使經過肝竇的微泡數量減少、速度減慢，并隨肝損傷程度增加而加劇。

近年來，SWE已廣泛用于評估肝臟纖維化分期，并以楊氏模量對硬度加以量化：楊氏模量越大代表硬度越大[14]。相關研究[15-16]表明，肝臟纖維化同樣發生于急性RILI過程中，其主要機制為肝竇內皮細胞受損傷后釋放腫瘤壞死因子α、轉化生長因子β等炎性因子而增加肝星狀細胞(hepatic stellate cell，HSC)對射線的敏感性，加速肝臟細胞凋亡及大量肌成纖維細胞樣HSC(myofibroblast HSC，MF-HSC)代償性增殖，最終引起肝臟不可逆性纖維化。本研究結果顯示，照射后兔肝損傷程度與肝臟Emean相關，且各肝損傷組Emean均較對照組增大，Emean則隨損傷程度增加而逐漸減小，但其最小值仍大于對照組，可能原因在于竇內皮細胞受損誘導紅細胞穿透并激活中央靜脈中的纖維蛋白，后者大量沉積并沿肝竇增殖，形成不完全纖維間隔并向周圍延伸，大量MF-HSC代償性增殖加速肝臟纖維化進程[17]，最終導致肝組織硬度增加；另一方面，隨肝臟損傷程度加重，肝細胞廣泛水腫，肝竇內血液大量淤積，可使肝實質硬度有所下降。

綜上所述，本實驗成功建立了兔RILI模型，并發現CEUS及SWE均可用于評估兔急性RILI，TTP可定量分析肝實質微循環，Emean可用于評估兔肝纖維化程度。