血液生物標志物在阿爾茨海默病早期診斷中的研究進展

董麗華 李加梅 鄭加平 雷小晶

AD常伴有一種或多種認知域的損傷,是最常見的癡呆類型,約占老年期癡呆的60%～80%。《2022年中國阿爾茨海默病報告》顯示:截至2019年,中國AD及其他癡呆病人人數約為1314萬,約占全球數量的25.5%,已經成為導致中國居民死亡的第五大疾病,給家庭和社會帶來沉重的經濟和社會負擔[1]。AD的典型病理學表現為β淀粉樣蛋白(amyloid-β,Aβ)沉積形成神經炎性斑塊、tau蛋白異常磷酸化形成神經原纖維纏結(neurofibrillary tangles,NFTs)以及神經元缺失等[2]。目前對AD的診斷主要基于2018年美國國立衰老研究院和阿爾茨海默病協會(NIA-AA)的生物標志物框架[3],常用的檢驗方法為腦脊液(cerebrospinal fluid,CSF)和正電子發射計算機斷層顯像(PET)檢測Aβ及tau蛋白的水平及沉積陽性病灶。但是CSF檢測為有創性操作,病人依從性差;PET檢測價格昂貴,具有一定的輻射性,可及性比較差。近年來,隨著免疫磁減量、單分子免疫列陣和免疫沉淀-質譜(immunoprecipitation-mass spectrometry,IP-MS)等生物檢測技術的進步,尋找創傷性小、特異性強、靈敏度高、可重復操作且易于采集的外周生物標志物成為當前AD篩查與早期診斷研究的熱點。本文回顧了近3年來AD相關外周生物標志物的研究,以期為AD的早期診斷提供新的見解。

1 AD生物標志物的發展歷程

AD生物標志物的臨床應用和診斷標準的制定經歷了漫長的歷程。1984年,美國國立神經病學與語言障礙、卒中和阿爾茨海默病及相關疾病協會(NINCDS-ADRDA)制定了第一個AD診斷標準,即NINCDS-ADRDA診斷標準。1992年CSF中Aβ被鑒定出,這為開發AD的診斷測試和旨在減少Aβ腦沉積的治療策略提供了新的希望[4]。1993年,Vandermeeren等[5]首次在CSF中檢測到總tau蛋白(t-tau)。隨后,大量的AD研究中對CSF Aβ42、t-tau和磷酸化tau蛋白(p-tau)進行了評估。2007年,國際工作組織(IWG)發布了NINCDS-ADRDA診斷標準的修訂版,即IWG-1診斷標準[6]。該標準提出AD是一個連續的疾病過程,并首次將生物標志物納入AD的診斷標準,包括PET、結構磁共振掃描(sMRI)以及CSF Aβ、t-tau、p-tau等,這將AD的診斷由臨床病理診斷轉變成了一個臨床生物學診斷。基于CSF的AD生物標志物反映了AD潛在病理的大量臨床證據,2011年,NIA-AA修訂了新的NIA-AA診斷標準,提出了臨床前AD的概念性框架,并將AD的發病過程更新為連續的3個階段:臨床前AD(preclinical AD)、輕微認知功能障礙(mild cognitive impairment,MCI)和AD癡呆(AD dementia)。并且每個階段都具有相應的生物學標志物作為診斷標準,該診斷標準將AD生物標志物分為兩大類:Aβ積聚的生物標志物和神經元變性或損傷的生物標志物[7]。由于AD病理生理過程的生物標志物僅用于研究中,2014年IWG進一步修訂了AD的診斷標準,即IWG-2診斷標準。該診斷標準將AD生物標記物分為診斷性生物標志物(CSF Aβ、t-tau、p-tau,Aβ-PET)、AD致病基因和進展性生物標志物[sMRI和氟脫氧葡萄糖正電子發射計算機斷層掃描術(FDG-PET)],同時擴充了AD的分類,即前驅期型AD(prodromal AD)、典型AD(typical AD)、非典型AD(atypical AD)、混合型AD(mixed AD)[8]。

2018年,NIA-AA在指南中提出了基于Aβ(A)、病理性tau蛋白(T)及神經變性(N)生物標志物的ATN研究框架,明確地將AD從一種臨床綜合征轉變為一種生物學定義的疾病譜系,包括AD病理改變和AD。其中,僅Aβ沉積陽性,但病理性tau陰性的病人,即A(+)T(-)(N),稱為“AD病理改變”。Aβ沉積和病理性tau均陽性時,即A(+)T(+)(N),方可定義為AD[3]。ATN框架的提出,肯定了CSF檢驗和PET檢查對AD診斷的意義。隨著對AD病理認識的不斷深入及更多新型標志物的出現,ATN診斷框架并不能涵蓋AD的全部病理類型,因此,在ATN框架的基礎上,NIA-AA又提出新的ATX(N)框架,其中“X”代表新生的候選生物標志物,并在AD診斷中重點關注外周生物標志物[9]。《阿爾茨海默病源性輕度認知障礙診療的中國專家共識2021》指出,血漿Aβ42/Aβ40、p-tau181、p-tau217和神經絲輕鏈(neurofilament light,NfL)可用于AD源性MCI的早期診斷和疾病進展的評估[10],肯定了血液生物標志物在AD早期診斷中的價值,為AD新型血液標志物的開發帶來了新的希望。

2 外周血液標志物在AD早期診斷中的價值

2.1 Aβ相關生物標志物 Aβ學說被認為是AD的主要發病機制。Aβ是由跨膜蛋白β淀粉樣前體蛋白(amyloid precursor protein,APP)經β分泌酶與γ分泌酶水解產生的含有36～43個氨基酸的肽段[11]。Aβ40和Aβ42是體內Aβ最常見的亞型,Aβ42/Aβ40可以平衡不同個體間Aβ的差異,其較Aβ42具有更好的診斷性能[12]。目前,臨床上診斷AD主要依靠Aβ-PET,CSF Aβ40、Aβ42及其比值的測定。血液Aβ的檢測比CSF更具挑戰性,因為他們在血液中的濃度比在CSF中至少低100倍[13]。但是血液檢測方便實施,且隨著超敏感的IP-MS的應用,血漿Aβ的測定越來越受到關注。一項應用IP-MS技術測定血漿Aβ42/Aβ40比值的研究結果顯示,血漿Aβ42/Aβ40與Aβ-PET腦掃描具有良好的一致性,可用于輔助診斷AD,能夠準確識別受試者是否具有認知障礙[14]。Janelidze等[15]用8種方法檢測血漿Aβ,發現與Aβ-PET陰性個體相比,Aβ-PET陽性人群中血漿Aβ42/Aβ40水平明顯降低。但是,血漿Aβ42/Aβ40檢測不如CSF樣本穩健,不同檢測方法中血漿Aβ42/Aβ40的結果存在差異。

2.2 tau蛋白相關生物標志物 tau蛋白是一種主要在中樞神經系統神經元表達的微管相關蛋白,p-tau在維持微管的組裝和穩定方面具有重要作用,但其過度磷酸化發生聚集導致的NFTs是AD的標志性病理改變。Fossati等[16]研究發現,AD病人血漿t-tau水平顯著升高,并且與認知水平的下降相關,可反映病情的進展程度,是AD的預后標志,但其與CSF t-tau及CSF p-tau的相關性比較微弱,目前也缺乏診斷的可靠性,并不能作為AD的特異性生物標志物。tau蛋白片段上有許多位點存在異常過度磷酸化,目前研究較多的磷酸化位點有p-tau181、p-tau217及p-tau231。

2.2.1 p-tau181:研究表明,血漿p-tau181水平在AD病程中呈逐漸增加的趨勢,MCI及AD癡呆病人血漿中p-tau181的表達水平顯著高于認知未受損個體,可以有效區分AD癡呆病人與無AD病理變化的其他類型癡呆[17]。另有研究發現,血漿p-tau181不僅與CSF p-tau181呈正相關,與tau-PET也具有很好的相關性,還可用于預測與AD相關的神經變性[18]。Moscoso等[19]研究發現,血漿p-tau181水平在Aβ-PET和CSF生物標志物達到異常水平之前就已經開始出現動態變化,且隨著Aβ病理嚴重程度的增加而升高,在Aβ病理形成后5年達到異常水平;在MCI和AD癡呆受試者中,血漿p-tau181的基線水平與Aβ沉積的相關性更強,而在認知正常的受試者中,這種相關性明顯較弱;除此之外,血漿p-tau181縱向增加還與6年后tau蛋白的廣泛聚集相關。Lussier等[20]發現,血漿p-tau181水平在Aβ陽性和認知受損的個體以及載脂蛋白E4攜帶者中均升高,并且與年齡、認知能力下降、18F-FDG-PET低代謝和CSF p-tau181水平顯著相關。綜上,血漿p-tau181被認為是AD特異性的生物標志物之一,還可作為神經退行性病變進展的預測因子。

2.2.2 p-tau217:Palmqvist等[21]報道,血漿p-tau217區分AD和其他神經退行性疾病的準確性達96%,明顯優于血漿p-tau181和NfL,且與CSF p-tau217無明顯差異。同時,血漿p-tau217在鑒別tau-PET是否異常的準確性上明顯高于血漿p-tau181、NfL,以及CSF p-tau181和Aβ42/Aβ40比值。在AD病人中,與非攜帶者相比,PSEN1突變攜帶者的血漿p-tau217水平顯著升高,據估計,這項異常在MCI發病前約20年就已出現。我國一項薈萃分析顯示:AD病人的血漿p-tau181、p-tau217和p-tau231水平明顯高于MCI組及認知正常對照組,且血漿p-tau217在區分MCI和AD方面比血漿p-tau181、p-tau231更敏感[22]。Ashton等[23]最新的研究評估了多種AD血液生物標志物在AD早期階段病人中與Aβ病理、認知功能和腦萎縮的相關性,發現僅有p-tau217濃度隨著AD病人淀粉樣蛋白沉積的加重而縱向增加,且p-tau217的縱向變化與AD病人認知功能的下降和腦萎縮的程度顯著相關。因此,血漿p-tau217可作為臨床前AD或前驅期型AD疾病進展的替代生物標志物。

2.2.3 p-tau231:Ashton等[24]的研究表明,血漿p-tau231濃度在診斷AD方面表現出較高的準確性(AUC=0.94)。在TRIAD隊列中,與Aβ陰性組相比,Aβ陽性組的AD病人、MCI病人以及認知未受損老年人中血漿p-tau231水平均顯著升高。而且血漿p-tau231的升高先于p-tau181和p-tau217,在Aβ少量沉積時就開始出現,是目前最早出現的p-tau類型;血漿p-tau231水平還與CSF p-tau231、tau-PET呈顯著正相關,與CSF Aβ42呈負相關,被認為是新興的AD病理學分期的生物標志物。另有研究發現,血漿p-tau231、p-tau217水平與Aβ早期沉積的PET攝取具有較強的相關性,在無明顯Aβ病理改變的個體中,也同Aβ-PET攝取的縱向增加相關。因此,血漿p-tau231水平還可以反映早期Aβ改變,并作為臨床前AD的Aβ病理學狀態的生物標志物[25]。

2.2.4 腦源性tau蛋白(brain-derived tau,BD-tau):血清BD-tau水平與AD病人腦組織中的淀粉樣斑塊和tau蛋白纏結的嚴重程度密切相關,并表現出與CSF t-tau和CSF BD-tau相當的診斷性能。同時,血漿BD-tau還能準確地將尸檢證實的AD病人與其他神經退行性疾病區分開來,準確率高達86.4%[26]。因此,血漿BD-tau或許可以用于評估AD相關的神經退行性病程。

2.3 NfL NfL是神經絲蛋白的一個組成部分,特異表達于神經細胞內,多種神經系統疾病的發生發展過程均伴隨著NfL水平的改變[27]。Mattsson等[28]的研究顯示,與認知正常的對照組相比,血漿NfL水平在MCI及AD癡呆病人中明顯升高,具有較高的診斷準確性(AUC為0.87),且與認知損害、腦萎縮和大腦18F-FDG-PET低代謝之間存在相關性。另有研究發現,與非攜帶者相比,常染色體顯性遺傳性AD突變攜帶者[APP、早老素1(PSEN1)、早老素2(PSEN2)]血清NfL水平顯著升高,并且在無癥狀攜帶者轉化為臨床認知障礙期間達到峰值,在癥狀攜帶者中達到平臺期[29]。因此,血液NfL的動態變化可以作為預測家族性AD癥狀前階段的疾病進展和腦神經退行性變的生物標志物。最新研究發現,與主觀認知衰退(subjective cognitive decline,SCD)病人相比,MCI病人和AD病人的血漿NfL水平顯著升高。此外,MCI Aβ陽性病人血漿NfL濃度高于MCI Aβ陰性和SCD Aβ陽性病人,但與AD病人差異無統計學意義。同時,MCI病人血漿中NfL水平與CSF Aβ42和Aβ42/Aβ40比值呈負相關,與p-tau、t-tau呈正相關。這表明NfL可能是AD臨床前階段有用的外周生物標志物[30]。除此之外,血漿NfL水平還與CSF NfL水平具有很好的相關性,并可用于評估神經元軸突的損傷,因此,血漿NfL也可以作為神經變性的生物標志物[28-29]。

2.4 膠質纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP) GFAP在中樞星形膠質細胞的發育和成熟中起著重要作用,該蛋白也存在于周圍神經系統的非髓鞘化Schwann細胞中。GFAP在星形膠質細胞的再生和突觸可塑性中起著非常重要的作用,是星形膠質細胞增生的標志物,也是一種反映AD早期神經病理損傷的標志物。多項研究發現,與認知未受損Aβ陰性組相比,Aβ陽性組血漿GFAP濃度顯著升高,在Aβ-PET陽性組中,血漿GFAP水平與Aβ-PET沉積存在顯著相關性,而與tau-PET無關。與CSF GFAP相比,血漿GFAP能更好地追蹤腦內Aβ的變化,更準確地識別Aβ陽性狀態[31]。因此,血漿GFAP可以預測Aβ沉積和認知能力的下降,是與Aβ沉積相關的AD早期特異性標志物[32]。Chatterjee等[33]報道,血漿GFAP可區分Aβ陽性和Aβ陰性常染色體顯性阿爾茨海默病(autosomal dominant Alzheimer’s disease,ADAD),與有癥狀ADAD者相比,無癥狀ADAD者血漿GFAP與Aβ負荷的關系更強,血漿GFAP水平還與神經退行性變和認知障礙的程度和發生率相關。此外,血漿GFAP水平僅在伴有Aβ病理的個體中與tau病理呈正相關[31,34]。血清GFAP對AD的診斷性能(AUC=0.84)與血清p-tau181(AUC=0.89)相當,且優于血清NfL。Oeckl等[35]的研究顯示,與認知正常的對照組和行為變異型額顳葉癡呆(bvFTD)病人相比,MCI和AD病人的血清GFAP水平明顯升高,在MCI轉化為癡呆的病人中,其血清GFAP水平明顯更高。因此,血液GFAP水平可能是AD和bvFTD鑒別診斷的一個很有前途的候選生物標志物,也是MCI向癡呆轉化的一個很好的預測指標。GFAP水平在其他神經變性疾病中也會升高,將血液中的GFAP作為神經退行性疾病的生物標志物,特別是與其他標志物結合使用,是提高鑒別診斷精度的一個很有前景的方法。

2.5 神經源性外泌體(neural-derived exosomes,NDEs)突觸損傷相關標志物 突觸是學習和記憶的基本結構,突觸的缺失與認知能力下降有一定的相關性,一些突觸功能障礙的生物標志物也與AD有關[36]。生長相關蛋白43(growth-associated protein 43,GAP-43)是突觸前膜的鈣調素結合磷蛋白,主要定位于成人海馬區和聯合皮質區,并在神經元發育和突觸形成過程中高度表達,參與調節軸突生長、突觸可塑性以及學習和記憶功能[37]。突觸結合蛋白-1(synaptotagmin-1,Syt1)是對胞吞有著雙向調控的Ca2+感受器,可通過調節膜的彎曲程度精確調控胞吞-胞吐之間的偶聯平衡[38]。神經顆粒素(neurogranin,NRGN)是一種突觸后蛋白,在海馬、尾狀核和杏仁核等的樹突棘中高度表達,參與鈣信號調節和突觸可塑性,在長時程增強中起重要作用[39]。研究表明,在有癥狀的AD病人中,CSF突觸生物標志物會增加,并能準確地將有癥狀的AD與其他癡呆癥區分開來[36]。

血液中反映突觸功能障礙的生物標志物往往無法反映大腦的損傷情況,在血漿中直接檢測突觸生物標志物的性能并不理想。而血漿NDEs是從中樞神經系統衍生出的,能較為特異性地反映中樞神經系統生物標志物的水平。NDEs是神經元、小膠質細胞和星形膠質細胞分泌的細胞外囊泡,在神經系統中通過其多種信號功能參與神經元的發育、維持和信息交流[40]。Jia等[41]對5～7年前認知功能正常的人群進行隨訪研究,發現AD與MCI受試者血清中NDEs突觸相關蛋白GAP43、突觸相關蛋白25、Synaptotagmin1和Neurogranin水平顯著低于健康對照組,且與CSF中相應蛋白的表達高度相關,作為認知障礙出現前5～7年預測AD和MCI的生物標志物,其準確率高達87%～89%。這些NDEs能穿過血腦屏障[40],在一定程度上反映了大腦的病理變化,被認為是AD生物標志物的理想候選。

2.6 其他 Flotillin蛋白是位于細胞內和細胞外囊泡中的疏水蛋白,主要參與信號轉導和膜蛋白的相互作用。Flotillins通過影響APP內吞作用和加工、鈣穩態、神經元凋亡、線粒體功能障礙、Aβ誘導的神經毒性,在AD的發病機制中發揮作用[42]。Abdullah等[43]研究發現,AD病人血清Flotillin蛋白水平較非AD病人顯著降低,PET檢查出現Aβ沉積的MCI病人較未出現Aβ沉積病人的Flotillin蛋白水平也顯著下降。除此之外,血清Flotillin水平還與腦內PET檢查的Aβ沉積即標準化攝取值比值(standard uptake value ratio,SUVR)呈負相關,與MMSE評分呈正相關,因此,血清Flotillin蛋白的測定有助于AD-MCI及AD的早期診斷。

3 總結與展望

早在臨床癥狀出現前的20～30年,AD的病理過程就已經開始,因此,AD早期,尤其是臨床前AD可能是未來AD干預的重要節點,早篩查、早發現、早診斷、早干預已成為AD防治的重要策略和共識。本文總結了近3年報道的AD外周血中潛在的生物標志物,這些標志物在臨床診斷AD中尚未得到一致認可,仍然存在一些問題[11]:(1)含量較低。來自中樞的一小部分生物標志物通過血腦屏障、蛛網膜顆粒、類淋巴系統和血管系統進入外周血中,進而在血液系統中被進一步稀釋;同時,這些外周血生物標志物也可以被蛋白酶降解或與血液蛋白、血細胞等結合形成復合物,從而阻礙了標志物的準確測定。(2)產生和清除受到干擾。部分外周血生物標志物在肝、腎等組織器官中被巨噬細胞清除,并且外周組織也可產生并釋放相同的標志物到血液系統中。(3)水平存在波動。由于新陳代謝、飲食和藥物以及其他因素的影響,外周血液生物標志物的水平在不同個體之間存在差異,并且在整個AD疾病譜中是動態變化的。

目前,臨床上基于血液的AD生物標志物是對CSF和神經影像生物標志物的補充,可用于篩查和隨訪病人,實際臨床應用仍需要大規模的臨床研究進行驗證以及統一血液生物標志物的檢測方法和閾值。AD的發生發展是一個極其復雜的過程,AD進程中生物標志物發生動態變化,單一生物標志物難以描述AD全譜,多個生物標志物的聯合檢測不僅能顯著提高AD的早期診斷,也能為疾病的進展、治療以及預后提供重要依據。因此,尋找創傷性小、特異度強、靈敏度高的AD早期甚至超早期血液生物標志物組合以及在不同的臨床中心之間建立AD生物標志物的統一標準,可能是未來研究的重點和熱點。