壞死性凋亡在慢性阻塞性肺疾病中的研究進展

劉佳麗 趙卉

慢性阻塞性肺疾病(慢阻肺)是一種常見的氣道炎癥性疾病，通常指由于長期暴露于有毒顆粒或氣體，導致不可逆的氣道重塑和肺泡破壞，引起慢性支氣管炎和肺氣腫[1]，是全球第三大死亡原因[2]。慢阻肺是一種具有多種分子致病機制的復雜疾病，與氧化應激，氣道炎癥，蛋白酶/抗蛋白酶失衡，自身抗體產生，細胞衰老和細胞死亡等有關。炎癥反應和細胞死亡是慢阻肺最重要的致病因素[3]。壞死性凋亡是一種由受體相互作用蛋白激酶(RIPK1、RIPK3)和混合譜系激酶結構域樣蛋白(MLKL)介導的新型非凋亡性細胞死亡形式，細胞發生壞死性凋亡后可產生很多的炎癥物質，導致持續的炎癥反應。最新研究表明壞死性凋亡在慢阻肺的發病機制中起著重要的作用[4-5]，且抑制壞死性凋亡信號通路，可緩解香煙煙霧暴露引發的肺部炎癥及氣道重塑，有望成為治療慢阻肺的潛在新靶點。因此，明確壞死性凋亡在慢阻肺發病機制中的作用，具有一定的理論及臨床指導意義。

一、壞死性凋亡的概述

程序性細胞死亡是多細胞生物組織中消除受損、感染或衰老細胞，維持正常發育和穩態的關鍵過程，在人體病理生理學中具有重要作用[6]。細胞凋亡為程序性細胞死亡的主要形式，由半胱天冬酶家族蛋白質(Caspase)執行，可消除體內不必要和有害的細胞，包括病毒感染的細胞，衰老細胞和癌細胞等[7]；與細胞凋亡不同，壞死性凋亡是一種非Caspase依賴的，可驅動組織炎癥和壞死的程序性細胞死亡形式，它是一種溶解性死亡，通過破壞質膜的完整性使細胞內容物溢出到細胞外環境中，促進炎癥反應[5, 8]。先前的研究證實了壞死性凋亡在急性腎損傷、骨關節炎、心血管疾病、視網膜變性、顱內損傷、肝損傷和膿毒性休克等疾病中的潛在作用，最近多項研究強調了其在慢性阻塞性肺疾病中起著不可或缺的作用[9-10]。

二、壞死性凋亡的分子調節機制

壞死性凋亡由一類死亡受體誘導發生[11]，包括腫瘤壞死因子受體(TNFR1、TNFR2)、干擾素受體(IFNR)、Toll樣受體(TLR3、TLR4)、干擾素調節因子(DAI)的DNA依賴性激活劑、以及細胞內RNA或DNA感受器等[12-13]。這些死亡受體與各自的配體結合后被激活，促使細胞沿著壞死性凋亡途徑向下移動。

其中研究最為廣泛的是TNF-α/TNFR1誘導途徑，首先TNF-α與TNFR1結合，TNFR1被激活后與RIPK1、腫瘤壞死因子受體1型相關死亡域蛋白(TRADD)、FADD、E3泛素化連接酶、腫瘤壞死因子受體相關因子2/5(TRAF2/5)及細胞凋亡蛋白-1的細胞抑制劑(cIAP1/2)形成復合物I，其中RIPK1通過TRAF2/5，cIAP1/2在63位的賴氨酸被多泛素化，活性受到抑制，當體內Caspase-8活性降低或者缺失時，復合體I中的RIPK1去泛素化后被激活[14]，并與RIPK3相互作用導致RIPK3磷酸化，形成RIPK1-RIPK3復合物招募并磷酸化下游的MLKL[12, 15]，活化的MLKL與磷脂酰肌醇磷酸鹽(PIP)、心磷脂(CL)和磷脂酰甘油(PG)結合[14]，形成壞死體復合物易位到細胞膜，其中MLKL破壞細胞膜，導致膜透化、細胞腫脹和破裂，促使細胞內容物如危險相關分子模式(DAMPs)的釋放[16]。DAMPs的產生是慢性和急性炎癥的關鍵因素，可觸發免疫反應并與模式識別受體結合，將原代免疫細胞募集到壞死部位，導致炎癥反應發生[14]。

在正常情況下，DAMPs存在于細胞內，壞死性凋亡導致大量DAMPs釋放，DAMPs通過半胱天冬酶1依賴性機制產生炎癥細胞因子，并形成核苷酸結合寡聚結構域樣受體(NLRP3)炎癥小體。NLRP3炎癥小體可介導IL-1α，IL-1β，IL-33和IL-18的分泌。IL-1β和IL-18激活嗜中性粒細胞，巨噬細胞，Th1和Th17淋巴細胞，導致1型氣道炎癥[15-16]。IL-33在肺上皮細胞中高表達，釋放后驅動以調節性T細胞、嗜酸性粒細胞和細胞因子為特征的2型免疫應答。另外，IL-33與表達ST2的細胞(包括先天性和適應性免疫細胞)結合[15]，可激活NF-κB途徑，刺激細胞因子/趨化因子的產生以及嗜酸性粒細胞、肥大細胞和嗜堿性粒細胞的脫顆粒。IL-33還可以促進巨噬細胞向替代激活的促纖維化M2表型分化，導致促纖維化細胞因子(包括單核細胞化學吸引蛋白(MCP-1)、IL-6和轉化生長因子(TGF)-β1)的上調，加重呼吸系統疾病中的氣道炎癥和組織損傷[9]。

此外，有研究發現，TLR3、TLR4以及干擾素調節因子(DAI)的DNA依賴性激活劑也可直接激活RIPK3來促進壞死性凋亡[12, 17]，但其一般機制和慢阻肺的關系尚未明確[18]。

三、壞死性凋亡與慢性阻塞性肺疾病

慢阻肺的特征是持續存在的呼吸系統癥狀和氣流受限[19]，其發病率和死亡率逐年上升，嚴重影響患者的工作能力和生活質量，造成沉重的社會經濟負擔[20]。大量研究表明，慢阻肺由長期暴露于香煙煙霧(CS)、室內外空氣污染物、過敏原、化學毒素，細菌和病毒感染的異常細胞反應或基因突變等引起，其中CS是最常見的危險因素。目前驅動慢阻肺炎癥和隨后組織重塑的機制尚不完全清楚，但長期吸煙引起持續的慢性炎癥是慢阻肺的典型特征，即使戒煙數年后仍無法恢復[21]。

據統計，80%～90%的慢阻肺患者為吸煙者，10%～15%的吸煙者會發展為慢阻肺患者[3]。CS中含有數千種化學毒物，其中大量是抗原、致癌物、細胞毒物等，是驅動肺部疾病發病機制和進展的主要因素[3, 18]。CS暴露可激活免疫細胞產生過多的溶酶體酶、氧自由基、髓過氧化物酶和彈性蛋白酶，導致細胞內氧化/抗氧化失衡，損害巨噬細胞吞噬細菌的能力，降低自然殺傷細胞的活性，也可誘導氣道上皮細胞分泌各種炎癥因子、內源性活性氧以及線粒體損傷等[18, 20]，最近的研究表明，CS暴露可誘導肺內組織壞死性凋亡介導的炎癥反應。

(一)壞死性凋亡調節香煙煙霧誘導的肺上皮細胞炎癥反應

Chen等人發現在CS誘導的肺氣腫小鼠模型及慢阻肺患者肺上皮細胞內，磷酸化的MLKL(pMLKL)和高遷移率組框(HMGB1)釋放顯著增加。為進一步證明CS可引起壞死性凋亡，他們研究了在體外暴露于CS的細胞，觀察到細胞中的pMLKL和細胞培養基中的HMGB1釋放增加，且隨著煙霧暴露時間和劑量的增加而增加。同時，他們發現RIPK1的缺失不會影響CS誘導的細胞死亡，而RIPK3的耗竭抑制了體外CS誘導的壞死性凋亡信號通路，減弱了體內CS引起的氣道炎癥。由于MLKL是RIPK3的下游效應分子，因此他們進一步研究發現CRISPR/Cas9對MLKL的消耗也保護了小鼠肺上皮細胞免受CS誘導的壞死，由此證明CS誘導的肺上皮細胞壞死性凋亡是由RIPK3/MLKL介導的[22]，隨后Lu等人也證實了這些發現，他們發現與從不吸煙或無慢阻肺疾病的吸煙者對照組相比，尤其重度慢阻肺患者上皮細胞和巨噬細胞中的總MLKL蛋白以及肺組織中的pRIPK3和pMLKL增加，且RIPK3和pMLKL的耗竭可緩解CS暴露后的氣道炎癥和組織重塑[23]。總之，這些結果表明，CS可誘導壞死性凋亡的發生，尤其RIPK3介導的壞死性凋亡引起了慢阻肺的肺部炎癥和肺氣腫的進展。靶向抑制RIPK3及其下游途徑可能是慢阻肺的有效治療方法。

(二)壞死性凋亡調節香煙煙霧誘導的巨噬細胞炎癥反應

巨噬細胞是先天免疫細胞，在防御外源性病原體及炎癥反應中起著關鍵作用。巨噬細胞分為經典激活型(M1)和替代激活型(M2)。M1巨噬細胞由IFN-γ和脂多糖(LPS)誘導[24]，產生誘導性一氧化氮合酶(iNOS)和TNF-α，發揮促炎和細胞毒性作用；M2巨噬細胞受到IL-4、IL-13的刺激后，可表達CD163和CD206，分泌Arg1和TGF-β，參與免疫調節和組織重塑過程[25-26]。肺泡巨噬細胞在氣道炎癥中起核心作用[16]，其中M1肺泡巨噬細胞通過分泌大量炎癥介質、活性氧，金屬蛋白酶和組織蛋白酶，促進多種炎癥細胞的遷移，破壞肺泡結構并誘導纖維化介質如TGF-β1等觸發氣道重塑，促進慢阻肺的發展[16, 27]。

Wang等人觀察到CS暴露導致小鼠肺泡巨噬細胞和骨髓源性巨噬細胞(BMDM)中RIPK1和RIPK3水平顯著增加，他們發現壞死性凋亡會促進巨噬細胞中CS誘導的炎癥反應，而抑制RIPK1或RIPK3可緩解CS誘導的BMDM中炎癥細胞因子的mRNA轉錄水平，明顯減弱了后續的炎癥反應[10]。先前研究已證實，NF-κB是一種調節各種炎癥基因表達的轉錄因子，與慢阻肺的發病機制密切相關[28]，通常由P50/P65異源二聚體組成，其中P65控制NF-κB的轉錄激活。Wang等人進一步研究發現壞死凋亡可調節p65的磷酸化狀態，進而調節巨噬細胞中的炎癥基因轉錄。另外，也有研究報道RIPK3上調可通過NF-κB途徑引起炎癥反應[10]。這些研究表明CS誘導的肺泡巨噬細胞壞死性凋亡可能通過NF-κB信號傳導通路促進肺部炎癥。不過，參與調節NF-κB通路的特定壞死凋亡相關機制仍然未知，需要進一步研究。

(三)壞死性凋亡參與調節線粒體功能障礙及線粒體自噬

線粒體是真核細胞的能量工廠，可以為身體的各種生理活動提供能量[20]。研究發現，CS可以誘導肺組織細胞內線粒體活性氧(mtROS)增加，使電子傳遞鏈活性降低以及線粒體膜電位喪失[29]、線粒體動力學失調，并觸發線粒體DNA(mtDNA)釋放[21]，釋放的mtDNA對氧化劑應激敏感，被氧化后造成線粒體基因組中突變基因積累，進一步降低了電子傳遞鏈活性的效率，增加mtROS的產生，受損的線粒體也是mtROS的主要靶標，導致線粒體蛋白和mtDNA的進一步受損，形成惡性循環[29]。過度的氧化應激導致與DNA損傷反應相關的標記物增加，有助于持續炎癥[21]；大量的mtROS也通過多種機制引起肺部炎癥，破壞肺上皮細胞的結構和功能，促進慢阻肺的發展[29]。

Giordano等人發現，慢阻肺患者肺中RIPK3的上調以及CS暴露的小鼠肺中的RIPK1和RIPK3水平升高，可促進受控細胞膜裂解，也促進mtDNA釋放到細胞外空間，引起一系列炎癥反應發生。這說明壞死性凋亡參與調節mtDNA的釋放，促進線粒體功能障礙[21]；Mizumura等人發現，CS暴露細胞產生過量酸性鞘磷脂酶(ASM)和絲氨酸棕櫚酰神經酰胺(C16-Cer)，誘導線粒體自噬蛋白(PINK1)增加，促進線粒體自噬及細胞的壞死性凋亡，他們還發現，線粒體自噬抑制劑Mdivi-1可減少壞死性凋亡途徑中MLKL的磷酸化，并顯示出對CS誘導細胞死亡的保護作用[30]。另外，也有研究發現，線粒體自噬蛋白PINK1的遺傳耗竭減少了肺上皮細胞壞死性凋亡，改善了肺功能[12]，且抑制線粒體自噬可減輕線粒體功能障礙和細胞損傷[31]。這些結果表明，CS誘導的線粒體自噬可能導致細胞壞死性凋亡。

線粒體自噬是一種靶向自噬形式，有助于清除肺組織中暴露于CS后誘導的受損線粒體[32]。但線粒體自噬在CS誘導的慢阻肺發展中，是否起到保護作用或有害作用仍然存在爭議[33]。以上研究發現CS誘導線粒體自噬的激活可能促進壞死性凋亡發生，壞死性凋亡也可促進mtDNA釋放加重線粒體損傷，產生大量炎癥因子，引起持續的氣道炎癥。因此，壞死性凋亡可通過參與調節CS誘導的線粒體功能障礙及線粒體自噬，促進慢阻肺中的肺部炎癥及肺氣腫的進展。

四、結論與展望

綜上所述，慢性阻塞性肺疾病是一種慢性氣道炎性病變，目前關于慢阻肺的治療主要包括支氣管擴張劑、糖皮質激素、抗生素及祛痰藥，但這些治療措施不能有效緩解或預防肺功能衰減。壞死性凋亡引發的一系列炎癥反應參與了肺氣腫形成和氣道重塑。多項動物及體外研究表明，抑制壞死性凋亡可減輕香煙煙霧誘導的氣道炎癥、氣道重塑及肺氣腫的發展，壞死性凋亡通路的靶向抑制劑有望成為慢阻肺的一種潛在治療策略。因此，未來還需要更多的研究證明壞死性凋亡抑制劑在慢阻肺患者中的作用，這對慢阻肺的防治，尋找新的治療靶點有著重要的意義。