整合應激反應在呼吸系統疾病中的作用

卓懷蜜 陳宋程 周向東,2 李琪,2

整合應激反應(integrated stress response,ISR)廣泛存在于真核細胞體內，是維護細胞內穩態和細胞生存的重要適應性機制，可被多種細胞應激和病理條件激活，如內質網應激、氧化應激、DNA損傷、營養物質缺乏等[1-2]。該過程主要通過磷酸化真核生物起始因子2(phosphorylation of eukaryotic translation initiationfactor 2，p-eIF2)α亞基中的絲氨酸-51位點，阻斷鳥嘌呤核苷酸交換因子(The guanine nucleotide exchange factor)eIF2B的作用，抑制細胞內翻譯，減少蛋白質的總體合成，并激活下游轉錄因子4(activating transcription factor 4，ATF4)調控相關應激基因，如CHOP、GADD34等的表達參與氨基酸代謝、未折疊蛋白反應、細胞凋亡等過程[3-4]。這一機制依賴于四種不同的eIF2α激酶：蛋白激酶R樣內質網激酶(PKR-like ER kinase，PERK)、一般控制非抑制因子2(general control non-depressible protein 2，GCN2)、RNA依賴性蛋白激酶(double-stranded RNA-dependent protein kinase，PKR)、血紅素調節的eIF2α激酶(heme-regulated eIF2a kinase，HRI)，每種激酶感知和響應不同的應激源[4]。PERK是位于內質網膜上的I型跨膜蛋白激酶，對內質網應激具有較高的敏感性。PERK可以通過整合內質網應激另兩條信號途徑：需肌醇酶1(inositol-requiring enzyme-1，IRE1)和轉錄因子6(activating transcription factor 6，ATF6)途徑，參與調控蛋白質合成、降解、細胞自噬與凋亡[5]；GCN2能使細胞對氨基酸缺乏做出反應，降低細胞對氨基酸的消耗，同時在營養不良的環境中將資源轉化為氨基酸的生物合成[6]；PKR主要參與細胞內抗病毒反應，阻斷胞內病毒的復制及蛋白合成[7]；HRI被認為主要存在于紅細胞體內，在血紅素濃度低下或鐵缺乏時被激活，調節血紅素與珠蛋白之間的平衡[8]。目前人們發現蛋白激酶并不僅僅只是被特定的一種應激源所激活，而是能感應不同應激誘發ISR，且不同蛋白激酶反應之間往往存在協同交互作用[9]。

近些年來，隨著對ISR研究的深入，人們發現ISR不僅僅只是細胞保護反應機制，其還參與了多種疾病的發生發展，研究發現，衰老及與年齡相關的疾病通常與ISR的激活有關[10]，且通過調節ISR可以逆轉蛋白質穩態缺陷導致的各種記憶、認知功能障礙和神經退行性變[11]。而在心肌梗死中，ISR激活可保護心肌細胞免受再灌注損傷[12]。但在慢性主動脈縮窄誘導的GCN2、PKR信號通路中，ISR的激活則會進一步加重心臟功能的衰竭[13]。此外，ISR還與肝脂肪變性和糖尿病等代謝性疾病密切相關[14]。隨著ISR在呼吸系統疾病中的作用被逐漸認識到，它在呼吸系統中顯示出更加重要的作用。故本文主要就ISR在呼吸系統疾病中的作用機制作一綜述，對象主要包括非小細胞肺癌(NSCLC)、肺結核(TB)、慢性阻塞性肺疾病(COPD)和哮喘、特發性肺纖維化(IPF)、阻塞性呼吸暫停綜合征(OSA)。

一、ISR在呼吸系統疾病中的作用

(一)非小細胞肺癌(NSCLC)

靶向治療已成為目前治療NSCLC的一種有效方法，但近年來人們發現，許多NSCLC患者開始出現耐藥性[15]，尋找新的靶向治療點成為必然。PD-L1/PD-1是體內重要的免疫調節因子，在肺癌細胞中可以檢測到PD-L1的高表達，PD-L1通過結合T細胞膜上PD-1受體，抑制T細胞增殖，從而使腫瘤細胞躲避宿主免疫系統攻擊[16]。Suresh[17]等人通過對人非小細胞肺癌 H358細胞進行全基因組CRISPR/Cas9篩選發現，在尿卟啉原脫羧酶(uroporphyrinogen decarboxylase，UROD)缺失的NSCLC細胞中PD-L1蛋白的表達增加，且UROD是血紅素合成的關鍵酶。實驗發現，血紅素缺乏通過活化HRI/eIF2α途徑激活ISR，ISR的激活促進了PD-L1的依賴性翻譯，從而抑制CD8+T細胞介導的宿主免疫反應，促進了肺癌細胞的生長。

此外，腫瘤微環境一般被認為處于營養物質缺乏狀態。為了抑制營養物質缺乏激活的細胞應激反應誘導的細胞凋亡，腫瘤細胞必須利用不同的適應性反應來躲避[18]。那么腫瘤細胞是如何逃避的呢？研究發現，在氨基酸缺乏時，KRAS基因突變的NSCLC細胞通過激活轉錄因子ATF4通路靶向調控天冬酰胺合成酶(asparaginesynthetase，ASNS)，ASNS通過調控細胞周期調節蛋白cycling B1促進腫瘤細胞的增殖,GCN2-eIF2α信號途徑協同參與此過程[19-20]。Ghaddar[21]等人近來的研究則進一步明確了ISR在KRAS突變的肺腺癌細胞中的作用。實驗表明，PERK/p-eIF2α臂通過抑制細胞內雙特異性磷酸酶6(dual specificity phosphatase 6，DUSP6)的翻譯，增加細胞外信號調節激酶(the extracellular signal-regulated kinase，ERK)的磷酸化表達以促進應激反應下腫瘤細胞的存活和生長。DUSP6在人類肺腺癌細胞(lung adenocarcinoma cell,LUAD)中表現出抗腫瘤作用，其低表達與LUAD對絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)抑制的敏感性增加和預后不良有關,這是KRAS突變腫瘤發生的重要機制。而該研究結果與臨床收集到的928例原發性肺腺癌患者的數據分析結果一致。與p-eIF2α陰性的患者相比，p-eIF2α陽性患者的預后更差，且p-eIF2α的表達增加與腫瘤局部侵襲性、腫瘤亞型和腫瘤細胞增殖相關。在腫瘤浸潤區域，p-eIF2α表達更高。因此，通過使用PERK抑制劑或ISR抑制劑阻斷p-eIF2α翻譯，可增加DUSP6的表達，降低ERK磷酸化，同時下調ATF4來抑制腫瘤細胞增殖。

(二)肺結核

結核肉芽腫是結核病主要的病理特征表現，它的形成使得結核桿菌得以逃避機體免疫清除，從而進一步傳播[22]。目前已證實，腫瘤壞死因子(TNF)是結核肉芽腫形成和維持以及結核耐藥性的重要細胞因子，且研究發現，結核分枝桿菌毒力的增強和宿主對結核分枝桿菌的高易感性都與I型干擾素刺激基因(IFN-I-stimulated genes，ISG)的表達增加有關[23]。在結核病臨床診斷前18個月，感染結核分枝桿菌的潛伏結核病患者外周血中，可檢測到ISG表達上調，這表明ISG可能是活動性結核的預測因子，且IFN-I途徑可能與活動性結核的發病和疾病的嚴重程度密切相關[24-25]。此外，研究發現，在肺結核患者的壞死性肉芽腫中，可檢測到ISR標記物表達強烈上調，特別是在靠近結核肉芽腫壞死中心的細胞層[26]。

近來，Bhattacharya[27]等人發現攜帶sst1易感(sst1S)基因型的小鼠在結核分枝桿菌感染后易出現壞死性結核肉芽腫，這與巨噬細胞對TNF的異常反應和持續升高的應激反應有關。sst1S巨噬細胞在TNF的持續性刺激下，早期反復誘導IFN-I途徑激活、疊加，在中晚期，結合內源性胞質PKR配體活化PKR信號通路，誘導eIF2α磷酸化觸發ISR而后續激活ISR相關轉錄因子的表達，如ATF3、CHOP、TRB3和DDIT4，從而引起巨噬細胞死亡和組織壞死，導致機體免疫功能受損，這可能與結核病活動性進展有關。因此，通過特異性阻斷TNF介導的IFN-I和ISR反應，將有可能成為治療結核病中壞死性肉芽腫的有效手段。

(三)慢性阻塞性肺疾病(COPD)和哮喘

慢阻肺特征性病理表現為肺氣腫和慢性氣道炎癥。目前已知香煙暴露(cigarette smoking exposure，CSE)和由此產生的氧化應激是COPD發展的主要因素之一，相關研究已經證明氧化應激通?？梢哉T導內質網應激，兩者相互作用促進疾病進展[28]。香煙煙霧所致的氧化應激可抑制內質網相關蛋白降解途徑(endoplasmic-reticulum-associated protein degradation，ERAD)中蛋白酶的活性及細胞自噬，導致錯誤折疊蛋白與未折疊蛋白大量積累，加劇了侵襲性小體形成，是導致COPD肺氣腫形成和進展的重要機制之一，而該過程與eIF2α磷酸化水平變化有關[29]。與未暴露于香煙煙霧的小鼠相比，暴露于香煙煙霧的小鼠肺裂解物中磷酸化eIF2α的表達增加了4倍[30]。在小鼠CSE誘導的急性模型中可檢測到PERK/eIF2α信號通路的表達，而在COPD嚴重肺氣腫患者中也發現磷酸化eIF2α的表達上調[31]。支氣管氣道上皮細胞的基因表達譜研究表明，在患有和不患有COPD的目前和以前的吸煙者中，ATF4介導的COPD相關病理改變的基因表達顯著增加[32]。因此，阻斷ATF4介導的細胞凋亡通路可能是降低氣道疾病發病的方法。

Emily及其同事發現一個有趣的現象，在利用銅綠假單胞菌感染支氣管上皮細胞時發現，銅綠假單胞菌分泌的綠膿桿菌素和堿性蛋白酶除了介導內質網應激反應之外，這兩種毒素還對鐵具有高敏感性，鐵缺乏，將平行獨立于內質網應激途徑激活HRI激酶觸發ISR，ISR通過翻譯轉錄因子ATF4誘導GADD34蛋白合成增加，GADD34的表達降低了細胞毒性并提高了細胞存活率，保護宿主免受銅綠假單胞菌的毒性作用，這意味著在慢性肺部疾病細菌感染期間，獨立于內質網應激反應的ISR可能會提供一個潛在的治療靶點[33]。

關于ISR在哮喘中的研究極少，目前研究發現哮喘患者，血單核細胞和肺泡巨噬細胞中發現CHOP的誘導，而小鼠和細胞內磷酸化eIF2α的表達增加，這提示ISR可能參與了哮喘的發病，但具體機制仍不清楚[34]。

(四)特發性肺纖維化(IPF)

IPF是一種病因未明、病死率較高的間質性肺疾病，目前認為IPF的發病與肺泡上皮細胞發生反復損傷后的異常修復及持續的成纖維細胞活化、膠原和基質沉積有關。研究發現，長期暴露在高危因素，如吸煙、粉塵、生物燃料等刺激下可激活ISR。ISR通過活化PERK/eIF2α/ATF4信號誘導CHOP蛋白表達，介導Ⅱ型肺泡上皮細胞凋亡，導致上皮屏障再生修復不足，殘存細胞發生上皮-間充質樣轉化，大量促纖維化因子的分泌，使成纖維細胞向肌成纖維細胞分化，引起細胞外大量基質沉積[34]。Burman[35]等人建立博來霉素誘導的肺纖維化小鼠模型，通過模擬局部缺氧環境并通過敲除小鼠CHOP基因證實，在缺氧的環境下，CHOP蛋白的表達能促進Ⅱ型肺泡上皮細胞(alveolar type 2 pneumocytes，AT2)的凋亡而加重肺纖維化。此外，CHOP可誘導巨噬細胞向M2型亞群分化，進一步促進肺纖維化形成。Anthea[36]等人在肺損傷后修復期，發現了一種肥大、多倍體的AT2細胞。這種AT2細胞是AT2干細胞向AT1細胞分化過程中由于胞質分裂失敗產生的一種雙核型細胞。過多的多倍體AT2細胞將導致AT2干細胞子代的缺失，減弱其再生能力，影響肺損傷后修復。通過對受損的肺組織進行單細胞RNA測序分析顯示，AT2細胞向AT1細胞分化過程中表達與ISR相關的基因，且肺損傷在AT2細胞分裂、擴大和分化修復肺泡上皮時持續激活ISR，增加了多倍體AT2細胞胞質分裂失敗的易感性。在SARS-CoV-2肺炎引起的嚴重肺損傷患者當中，一些患者會發展為持續性、進行性的肺纖維化，在他們的肺組織中也發現了類似的細胞。因此，通過減弱肥大、多倍體肺泡上皮細胞的形成或持續時間有利于維持AT2細胞的再生能力及促進肺修復。

(五)阻塞性睡眠呼吸暫停綜合征(OSA)

關于ISR在OSA中的研究甚少，目前研究發現ISR與OSA導致的代謝功能障礙有關。OSA以慢性間歇性缺氧(intermittent hypoxia，IH)為特征，一方面，IH不僅可誘導氧化應激激活ISR，觸發大量炎癥因子釋放，如IL-1、IL-6、IL-13等，導致炎癥反應，且可誘導體內白色脂肪組織(WAT)分解產生游離脂肪酸(free fatty acid，FFA)，FFA可激活PERK依賴性轉錄因子IKK(inhibitor of nuclear factor kappa-B kinase)加重細胞炎癥反應。另一方面，FFA大量產生，進一步激活PERK信號通路，誘導CHOP蛋白表達，介導胰島B細胞凋亡，并通過整合IRE1/XBP1s通路，激活c-Jun氨基末端激酶(JNK)、NF-κB等，共同導致胰島素信號通路受損，引起胰島素抵抗[37-38]。Khalyfa[39]等人發現，OSA小鼠體內，IH可持續性激活并延長ISR周期。慢性ISR持續性激活PERK信號，加重脂肪炎癥反應和胰島素抵抗，引起糖尿病、血脂異常等并發癥的發生。

二、ISR藥物

目前已有針對ISR的藥物，包括激動劑和抑制劑。ISR抑制劑包括eIF2α激酶抑制劑和ISRIB(Integrated stress response inhibitor)，是治療神經退行性病變、腫瘤及代謝性疾病的重要手段。相關研究顯示，ISR抑制劑在治療與應激顆粒(Stress Granuals，SGs)形成有關的神經退行性病變方面具有神經保護作用[40]。在呼吸系統方面，目前已明確選擇性PERK抑制劑GSK2606414和ISRIB能有效抑制小鼠肺腺癌細胞的增殖，具有抗腫瘤活性，且ISRIB在長期治療中，能持續性抑制ISR，并無明顯毒性副作用[21]。而選擇性PERK抑制劑GSK2656157似乎能通過阻斷血管生成來抑制體內癌癥的生長[42]。ISRIB還可抑制小鼠體內結核分枝桿菌增殖和肉芽腫形成，改善小鼠肺部炎癥和壞死程度[27]。此外，ISRIB能減少多倍體AT2細胞的形成或持續時間，促進肺纖維化小鼠AT2細胞向AT1細胞正確分化，加速上皮修復，減少促纖維化巨噬細胞的募集，改善肺纖維化[11,37]。

ISR激動劑主要是通過激活eIF2α激酶或抑制eIF2α去磷酸化來實現，包括eIF2α激酶激動劑及磷酸酶抑制劑。eIF2α激酶激動劑可應用于抗耐藥癌癥的治療，如選擇性PERK激活劑CCT020312，其可通過激活G1/S細胞周期點，增加腫瘤細胞對化療的敏感性[43]。而磷酸酶抑制劑，如沙魯布林，研究發現其在缺血性疾病中具有保護作用[44]。此外，沙魯布林可保護氣道上皮細胞免受香煙誘導的凋亡和抑制氣道上皮內質網應激，保護小鼠免受肺氣腫的發展，是治療COPD的潛在新方法[45]。Sephin1是胍那芐衍生物，可選擇性抑制GADD34蛋白。研究顯示，Sephin1可抑制呼吸道合胞病毒(RSV)和人類腸道病毒(EV-D68)復制，但治療所需劑量過高，較易產生嚴重毒性反應，當前尚未進入臨床研究[42]。奈非那韋是臨床使用的一種抗HIV藥物，目前尚未明確其介導eIF2a磷酸化增加，從而激活ISR的確切作用機制[1]。

三、結語與展望

自David Ron[46]等人首次提出“整合應激反應(ISR)”這一概念以來，人們對于ISR在細胞內的作用及與人類疾病關系的研究從未停止。目前許多研究已明確ISR與肺部疾病的相關性，大量實驗結果也凸顯了ISR在肺部疾病中的重要性。因此，以ISR激酶及其下游信號為靶點進行干預，可能有助于延緩疾病進展和改善臨床結果。但在此之前需要解決一些問題，我們需要考慮這些靶點和信號通路的穩態活性，并在使用時進行觀察和不斷調整，以便更明確地掌握它們對治療發展的影響。此外，細胞在不同應激源刺激下針對不同ISR激酶作用進行反應調整，ISR信號在不同類型細胞之間的交叉、重疊，可能影響疾病的發病過程，這些需要進一步的研究來闡明并確定。