支氣管哮喘急性發作期患者呼吸道菌群特征及血清MD-2水平、EOS%變化

王菲，錢萌，歐陽怡，薛曉婕

支氣管哮喘急性發作(acute exacerbation of bronchial asthma，AEBA)在世界范圍內影響了0.3%～9.2%的人群，且發病人數仍以較高速率增長[1]。研究證實，細菌感染是繼呼吸道合胞病毒感染之后誘發AEBA的第二大因素，且細菌感染誘發的AEBA患者存在更高復發率[2]。臨床評估細菌感染類型對指導早期經驗性選擇抗生素有積極作用。臨床研究證實，以髓樣分化蛋白-2(myeloid differentiation protein-2，MD-2)為靶點治療脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)誘導的相關疾病效果明顯，而LPS則主要存在于革蘭陰性菌細胞壁[3]。嗜酸性粒細胞(eosinophilia，EOS)同樣對LPS有調控作用，其水平變化與LPS直接相關[4]。現分析不同細菌感染類型AEBA患者血清MD-2、EOS%表達水平變化，以尋找兩者鑒別細菌感染類型的臨界點，為臨床早期用藥提供指導，報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2020年8月—2022年2月鄂東醫療集團市中心醫院/湖北理工學院附屬醫院呼吸內科收治的AEBA患者94例為觀察組，男53例，女41例，年齡45～68(56.63±5.27)歲。另選取同期醫院健康體檢者94例為健康對照組，男50例，女44例，年齡43～69(55.39±5.44)歲。2組性別、年齡比較差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經醫院倫理委員會批準(KY202007-32)，受試者及家屬知情同意并簽署知情同意書。

1.2 選擇標準 (1)納入標準：觀察組患者均符合支氣管哮喘診斷標準[5]，急性發作期，且誘因為呼吸道細菌感染；健康對照組體檢結果無異常，無支氣管哮喘史及家族遺傳史；年齡>18歲，<70歲；近1個月未服用抗生素、激素等影響呼吸道生態環境的藥物。(2)排除標準：合并結核病、急性心力衰竭；肝腎功能異常；病毒感染、肺炎支原體感染；呼吸道畸形；妊娠期、哺乳期女性；合并自身免疫性疾病；合并其他肺部疾病；肺部發育不良。

1.3 觀測指標與方法

1.3.1 檢測呼吸道菌群分布特征：受試人員清晨以生理鹽水漱口，用力咯出深部痰送檢；標本接種于巧克力平板、血平板、中國藍平板，其中中國藍平板置于培養箱(35℃)培養，巧克力平板、血平板置于二氧化碳孵箱(35℃)培養，48 h后觀察，挑取單個菌落進行革蘭染色，以細菌生化鑒定管(杭州天和微生物試劑有限公司)進行鑒定。質控菌株：大腸埃希菌ATCC25922，金黃色葡萄球菌ATCC25923，銅綠假單胞菌ATCC27853。

1.3.2 臨床資料收集：通過問卷調查方式收集AEBA患者臨床資料，包括性別、年齡、哮喘病程、病情程度、合并癥、吸煙史、鼻炎史等，記錄是否存在侵入性操作；檢測第1秒用力呼氣容積(forced expiratory volume in one second，FEV1)、呼出氣一氧化氮(fractional exhaled nitric oxide，FeNO)；檢測血清降鈣素原(procalcitonin，PCT)、C反應蛋白(C-reactive protein，CRP)、血總免疫球蛋白E(total immunoglobulin E，TIgE)、白細胞計數(white blood cell count，WBC)水平；以急性發作期哮喘感知控制力問卷評估其控制力，共11個條目，每項1～5分，分值越高表明控制力越好。

1.3.3 血清MD-2及EOS%檢測：觀察組入院時、健康對照組體檢時抽取受試人員晨起空腹肘靜脈血6 ml分為2份，每份3 ml，1份離心提取上層血清，另1份血液樣本肝素抗凝。取血清樣本根據酶聯免疫法試劑盒(上海康朗生物科技有限公司)順序每孔加入50 μl終止反應，于Aurora-600型酶標儀(杭州海沛儀器有限公司)調至450 nm處，5 min后測量光密度，繪制標準曲線，計算濃度值。采用全自動貝克曼五分類血細胞分析儀檢測EOS，計算EOS%。

1.4 病情程度判定標準[6]輕度：步行或上樓時氣短，呼吸頻率稍微增加，肺通氣功能、血氣檢查正常；中度：稍微活動偶感氣促，講話有中斷，呼吸頻率增加明顯，可聞及哮鳴音，有三凹征，血氧飽和度91%～95%，呼氣峰值流速障礙預計值60%～80%；重度：休息時氣短，端坐呼吸，呼吸頻率>30次/min，有三凹征，可聞及哮鳴音，心率>124次/min，血氧飽和度≤90%，血氣pH降低。

2 結 果

2.1 AEBA患者呼吸道菌群分布特征 AEBA患者94例共分離細菌102株，其中革蘭陰性菌74株(72.55%)，包括流感嗜血菌22株(21.57%)、卡他莫拉菌17株(16.67%)、感染大腸埃希菌13株(12.75%)、肺炎克雷伯菌11株(10.78%)、銅綠假單胞菌6株(5.88%)、陰溝腸桿菌3株(2.94%)、鮑曼不動桿菌2株(1.96%)；革蘭陽性菌28株(27.45%)，包括肺炎鏈球菌18株(17.65%)、金黃色葡萄球菌6株(5.88%)、表皮葡萄球菌3株(2.94%)、腸球菌1株(0.98%)。單純感染革蘭陰性菌患者63例，單純感染革蘭陽性菌患者26例，同時感染革蘭陰性菌、革蘭陽性菌患者5例(流感嗜血菌與肺炎鏈球菌3例，卡他莫拉菌與金黃色葡萄球菌1例，卡他莫拉菌與肺炎鏈球菌1例)。

2.2 不同類型細菌感染患者臨床資料比較 剔除同時感染革蘭陰性菌、革蘭陽性菌的患者5例。革蘭陰性菌感染者病情程度重度比例及血清MD-2、EOS%、PCT水平高于革蘭陽性菌感染者，控制力評分低于革蘭陽性菌感染者(P<0.05)，見表1。

表1 革蘭陰性菌與革蘭陽性菌感染AEBA患者臨床資料比較

2.3 2組血清MD-2、EOS%比較 觀察組血清MD-2、EOS%均高于健康對照組，差異有統計學意義(P<0.01)，見表2。

表2 健康對照組與觀察組血清MD-2、EOS%水平比較

2.4 不同病情程度AEBA患者血清MD-2、EOS%比較 觀察組94例患者輕度35例，中度37例，重度22例，血清MD-2、EOS%水平隨病情程度加重而升高(P均<0.01)，見表3。

表3 不同病情程度AEBA患者血清MD-2、EOS%比較

2.5 AEBA患者血清MD-2、EOS%與病情程度的相關性 Spearman相關性分析結果顯示，血清MD-2、EOS%與AEBA患者病情程度均呈正相關(r=0.842、0.846，P均<0.001)。

2.6 不同細菌感染類型危險因素分析 將病情程度、血清MD-2、EOS%、控制力評分、PCT進行多重共線性檢驗，發現MD-2、EOS%水平與病情程度存在多重共線性(VIF>5)，手動移除病情程度。以不同細菌感染類型為因變量(賦值：革蘭陰性菌=1，革蘭陽性菌=0)，以血清MD-2、EOS%、控制力評分、PCT為自變量(均以實際值進行賦值)，多因素Logistic回歸分析結果顯示，EOS%高、血清MD-2高是AEBA患者感染革蘭陰性菌的危險因素(P<0.05)，見表4。

表4 不同細菌感染類型危險因素分析

2.7 血清MD-2、EOS%鑒別AEBA患者細菌感染類型的價值 繪制ROC曲線結果顯示，血清MD-2、EOS%及二者聯合鑒別AEBA患者細菌感染類型的曲線下面積(AUC)分別為0.778、0.772、0.877，二者聯合鑒別效能大于單項指標(Z/P=2.118/0.034、2.366/0.018)，見表5、圖1。

表5 血清MD-2、EOS%鑒別AEBA患者細菌感染類型的價值

圖1 血清MD-2、EOS%鑒別AEBA患者細菌感染類型的ROC曲線

3 討 論

AEBA在世界范圍內均較常見，有數據顯示[7]，2018年我國≤19歲支氣管哮喘患者病死率為2.3%。相關研究認為[8]，哮喘發作次數、住院史、鼻部結構異常、家里養動物是支氣管哮喘患者合并感染的危險因素，細菌感染是導致AEBA發生及病情進展的重要誘因。一項研究顯示[9]，64例AEBA患者中有29例為細菌感染所致，而檢測到最多的病原微生物為流感嗜血菌。本研究細菌培養結果顯示，分離最多的菌株同樣為流感嗜血菌，其次為肺炎鏈球菌、卡他莫拉菌，其中革蘭陰性菌明顯更多。支氣管哮喘合并細菌感染患者多存在黏液分泌增加、支氣管黏膜腫脹癥狀，進一步造成氣道狹窄，促使呼吸困難加重。支氣管黏膜感染細菌后通過輔助T淋巴細胞及相關因子增加氣道高反應性，可直接導致哮喘再次發作；同時細菌還可通過神經調節機制、免疫機制誘發哮喘。另外，細菌感染會產生黏膜變應性炎性反應，分泌大量白介素，形成細胞因子風暴現象，提高免疫性疾病發生風險。因此，對細菌感染誘發的AEBA患者應積極控制呼吸道微生態平衡，而及早明確細菌類型對指導臨床經驗性用藥有一定幫助。既往主要采用細菌培養明確細菌感染類型，但該檢測方法具有明顯滯后性，主要用于后續治療中將早期經驗性抗生素更換為敏感度更高的抗生素，而對早期經驗性用藥無直接幫助，選擇可及早鑒別細菌類型的客觀指標具有臨床價值。

MD-2與哮喘常見過敏原塵螨具有結構、功能同源性，可通過與Toll樣受體4(Toll like receptor 4，TLR4)復合物直接作用而介導信號轉導，相關研究證實[10]，MD-2可調節氣道上皮細胞、樹突狀細胞炎性因子，對塵螨誘導的過敏性哮喘有保護作用，是臨床治療哮喘的新靶點。已有臨床研究證實[11]，抑制MD-2可通過抑制TLR4信號通路減輕氧化應激及炎性反應。本研究發現，觀察組血清MD-2水平明顯較健康對照組高，且隨病情程度加重其水平呈上升趨勢，提示血清MD-2對AEBA發生、進展有促進作用。進一步分析發現，感染革蘭陰性菌的患者血清MD-2水平明顯更高，這可能與革蘭陰性菌細胞壁中含有較多LPS有關。既往研究認為[12]，LPS可與其結合蛋白相結合，在MD-2輔助下傳遞信號至TLR4，誘導TLR4低聚化，形成LPS信號細胞內傳導。但近年來相關報道指出[13]，MD-2不僅能增強TLR4識別LPS，其本身作為LPS聯系TLR4的橋梁還具有重要調控作用。MD-2分子結構含有LPS及TLR4的獨立結合區，分別為N末端TLR4結合區、C末端LPS結合區，其既能直接結合LPS形成LPS/MD-2復合體再與TLR4結合，也能先和TLR4結合形成TLR4/MD-2復合體再與LPS結合，但其最終結果均為LPS/TLR4/MD-2復合體，而TLR4真正意義上的配基并非單獨的LPS，而是LPS/MD-2復合體[14]。臨床研究證實[15]，MD-2是識別LPS的重要靶點，通過抑制MD-2治療LPS誘導相關疾病已成為靶向治療研究重點。因此，通過檢測血清MD-2鑒別細菌感染類型具有較高敏感度、特異度，本研究發現其水平高于634.08 ng/L時提示患者可能為革蘭陰性菌感染。

EOS是參與AEBA慢性炎性反應的重要細胞，具有釋放細胞因子及顆粒蛋白功能，可產生炎性介質及細胞因子與自身相互作用，從而促進哮喘進展[16-18]。相關研究證實，EOS浸潤深度與肺功能、氣道重塑關系密切，且與胸腔氣體容量、肺總量存在相關性[19-20]。本研究發現，AEBA患者EOS%存在異常高表達，且與病情程度呈正相關，證實EOS參與AEBA發生、進展過程。另外，感染革蘭陰性菌AEBA患者的EOS%水平較感染革蘭陽性菌患者更高，提示檢測EOS%對鑒別細菌感染類型有積極作用，其原因在于EOS具有調控LPS作用。EOS可通過PPARγ信號通路降低炎性介質表達，機體感染革蘭陰性菌后LPS水平提高，通過激活TLR4信號通路產生炎性介質，促使炎性反應加重，該過程中EOS%代償性升高以減輕LPS誘導的炎性反應[21-22]。Logistic回歸分析發現，血清MD-2、EOS%水平升高均是革蘭陰性菌感染的獨立危險因素，進一步ROC分析二者聯合鑒別革蘭陰性菌感染的AUC值達0.877，具有較高鑒別效能。

綜上，血清MD-2、EOS%在AEBA患者體內均呈高水平表達，且與患者病情程度存在正相關關系，其中血清MD-2>634.08 ng/L、EOS%>6.24%可作為臨床鑒別細菌感染類型的臨界值，超過該水平提示患者為革蘭陰性菌感染，便于指導臨床早期經驗用藥。本研究不足之處在于未深入探究MD-2、EOS之間的機制關系，二者作用機制均與TLR4明顯相關，在患者感染革蘭陰性菌后二者是否存在相互作用可作為下一步的研究方向。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明

王菲：設計研究方案，實施研究過程，課題設計，論文撰寫；錢萌：提出研究思路，分析試驗數據，論文審核;歐陽怡：實施研究過程，資料搜集整理;薛曉婕：進行統計學分析