土壤中鄰苯二甲酸酯的高效液相色譜檢測方法

林家寶,孫雨豪,王 建*,高彥征

土壤中鄰苯二甲酸酯的高效液相色譜檢測方法

林家寶1,2,孫雨豪1,王 建1*,高彥征1

(1.南京農(nóng)業(yè)大學資源與環(huán)境科學學院,土壤有機污染控制與修復研究所,江蘇 南京 210095；2.江蘇省環(huán)保集團有限公司,江蘇省環(huán)境工程技術有限公司,江蘇 南京 210019)

為了更加高效、快捷、經(jīng)濟地檢測土壤中的鄰苯二甲酸酯(PAEs),本文構建并優(yōu)化了超聲萃取-高效液相色譜(UE-HPLC)檢測方法.選取美國環(huán)保署優(yōu)先控制的鄰苯二甲酸二甲酯、鄰苯二甲酸二乙酯、鄰苯二甲酸二正丁酯、鄰苯二甲酸丁基芐基酯、鄰苯二甲酸二(2-乙基己基)酯、鄰苯二甲酸二正辛酯為實驗對象,通過對6種PAEs的最大紫外吸收波長值進行測定、優(yōu)化高效液相色譜運行條件,進而構建了土壤中6種PAEs的HPLC檢測方法,具體參數(shù)如下:檢測時間為30min;進樣量為20μL;分離系統(tǒng)以乙腈-UP水為流動相、初始流速為1.0mL/min,采用梯度洗脫的方式分離PAEs,柱溫為40℃;檢測系統(tǒng)采用紫外檢測器檢測、開啟波長切換模式,波長分別為205和290nm.采用線性回歸方程及相關系數(shù)、加標回收率、相對標準偏差和檢出限對方法進行評價.結果表明,該方法具有較寬的線性范圍,最大質量濃度范圍在0.1～100mg/L,相關系數(shù)均在0.999以上.1和5mg/kg的6種PAEs加標回收率范圍分別為73.03%～91.89%和72.59%～90.70%,相對標準偏差范圍分別為1.78%～12.46%和0.30%～7.56%.采用3倍噪音值法、液相色譜儀檢定規(guī)程所得的6種PAEs檢出限濃度范圍分別為0.99～19.80和9.49～25.11μg/kg.

高效液相色譜；鄰苯二甲酸酯；土壤；檢測方法；超聲萃取

鄰苯二甲酸酯(PAEs),廣泛應用于塑料制品的生產(chǎn)和加工環(huán)節(jié),也可以作為油漆、化妝品、潤滑劑、粘合劑和殺蟲劑的添加劑[1-2].據(jù)報道,全球PAEs年消耗量大約為600～800萬t,此外,全球固體塑料年產(chǎn)量約為3億t,其中大約50%會被拋棄,由于PAEs與塑料產(chǎn)品是通過非共價鍵形式結合,其穩(wěn)定性差,容易從塑料產(chǎn)品中釋放并遷移到環(huán)境中,造成環(huán)境污染[3-6].目前,PAEs在土壤[7]、水體[8]、大氣[9]、沉積物[10]和生物體[11-12]等環(huán)境介質中廣泛存在.

PAEs可以通過塑料薄膜、農(nóng)藥、化肥、污水灌溉、污泥資源化利用、大氣沉降等方式進入土壤,造成土壤污染[13].研究發(fā)現(xiàn),我國土壤及農(nóng)田土壤中PAEs濃度高達1232,157.62mg/kg,其中DEHP和DnBP是主要的PAEs污染物[14].PAEs是一類內分泌干擾物,即使在極低濃度下也存在致癌、致畸、致突變的可能性[15-17].鑒于PAEs對人類健康的潛在危害,美國環(huán)保署(US EPA)已將鄰苯二甲酸二甲酯(DMP)、鄰苯二甲酸二乙酯(DEP)、鄰苯二甲酸二正丁酯(DnBP)、鄰苯二甲酸丁基芐基酯(BBP)、鄰苯二甲酸二(2-乙基己基)酯(DEHP)、鄰苯二甲酸二正辛酯(DnOP)等6種PAEs列為優(yōu)先污染物,并制定了相應的控制及治理標準;我國也將DMP、DnBP、DnOP等PAEs列入優(yōu)先污染物控制黑名單[18].

為了人群健康,精準測定土壤中PAEs的種類和濃度水平至關重要.氣相色譜(GC)和高效液相色譜(HPLC)由于具有良好的分離能力,被廣泛應用于PAEs的檢測[19].GC存在對樣品純度要求高、靈敏度偏差大、易受到待測組分干擾等不足,雖然將其與質譜(MS)聯(lián)用可以更好地進行分離和定性,但GC-MS成本昂貴,許多實驗室不具備使用該儀器的條件[20-21].HPLC具有準確度高、精密度高、測定快速、具有大批量測試能力、成本相對低的優(yōu)點,具有大規(guī)模應用的潛力.基于對PAEs污染土壤大批量檢測的需求,本文旨在建立一種經(jīng)濟、高效、精確的超聲萃取-高效液相色譜(UE-HPLC)檢測方法,以期為土壤中PAEs檢測提供技術支持.

1 材料與方法

1.1 儀器與設備

LC-20AT HPLC儀器、5μm×4.6mm×250mm Inertsil ODS-P液相色譜柱、萬分之一分析天平(島津,日本);5μm×4.6mm×250mm Venusil MP C18(2)色譜柱(博納艾杰爾,中國);冷凍干燥機(CHRIST,德國);759S紫外-可見分光光度計(棱光,中國);RV10旋轉蒸發(fā)儀(艾卡,中國);KQ-500DE超聲波清洗儀(超聲儀器,中國);TD5A-WS離心機(盧湘儀,中國); NUIII-20T超純水機(優(yōu)普,中國).

1.2 材料與試劑

DMP、DEP、DnBP、BBP、DEHP、DnOP標準品(百靈威,中國);無水硫酸鈉(南試,中國);300目硅膠(鼎康,中國);丙酮、正己烷、甲醇(國藥,中國),乙腈(TEDIA,美國),均為色譜級;實驗用水均為超純水(UP水).

1.3 溶液配制及標準曲線

標準儲備液的配制:分別稱取6種PAEs標準品,用甲醇溶解并定容到100mL棕色容量瓶中,配置成1000mg/L的標準儲備液,置于4℃冰箱中保存.

標準工作溶液的配制:使用甲醇將標準儲備液稀釋成0.1, 0.2, 0.5, 1, 2, 5, 10, 20, 50, 100mg/L梯度濃度標準工作溶液,分別以PAEs的峰高對濃度進行線性回歸分析,得到PAEs的標準工作曲線及線性范圍.

1.4 污染土壤的制備

供試土壤:采自南京市秦淮區(qū)南京農(nóng)業(yè)大學牌樓實驗基地某試驗田表層(0～20cm).將采集的土壤樣品平鋪于牛皮紙上,剔除礫石、動植物殘體等雜質,陰涼處風干2周以上.將風干后的土樣再次去除雜質,充分打散混勻,并研磨過20目篩.向制備好的土壤樣品中添加6種PAEs的丙酮溶液,并充分混勻,待丙酮揮發(fā)完全后,老化土壤3個月以上,保存?zhèn)溆?

1.5 樣品的前處理方法

樣品前處理方法:樣品的前處理方法包括提取、凈化和濃縮.(1)提取:取2g制備好的土壤樣品于20mL玻璃螺口瓶中,添加15mL體積比為1:1的正己烷-丙酮溶液,蓋緊瓶蓋后置于渦旋振蕩儀上渦旋混勻0.5～1min,充分振蕩后轉移至超聲波清洗儀中,在100Hz、常溫條件下水浴超聲萃取45min,隨后將樣品放置于離心機中,以2000r/min離心10min,取上清液.(2)凈化:將上清液傾倒入已活化(預先采用10mL正己烷分兩次淋洗層析柱)的層析柱中,層析柱上層為2g無水硫酸鈉,下層為2g硅膠(200～300目),層析柱下方放置100mL旋轉蒸發(fā)瓶,洗脫之后再分3次添加總體積為15mL的體積比為9:1的正己烷-丙酮溶液,萃取液和洗脫液收集至100mL旋轉蒸發(fā)瓶.(3)濃縮:在旋轉蒸發(fā)儀處于40℃、100r/min條件下濃縮至干,移取2mL甲醇潤洗定容,隨后倒入帶有0.22μm有機相濾頭(濾頭經(jīng)過甲醇浸泡處理并瀝干)的玻璃注射器,過濾進2mL液相小瓶,使用HPLC分析.

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1.6 質量控制與保證

為了降低實驗條件對實驗結果的干擾,實驗過程中,避免塑料制品的使用,玻璃器皿均在超聲波清洗儀中超聲1h,隨后使用超純水沖洗3遍,放置于烘箱中烘干24h.實驗過程中,每組實驗設置3個平行樣,同時設置空白組實驗,進而保證實驗結果的準確性.采用線性回歸方程、相關系數(shù)、準確度、精密度、檢出限評價建立的PAEs檢測方法.

1.7 6種PAEs的最大紫外吸收波長值測定

采用759S紫外-可見分光光度計分別對100mg/L的DMP、DEP、DnBP、BBP、DEHP、DnOP標準工作溶液進行紫外波長掃描,確定每種PAE的最大紫外吸收波長值.

1.8 6種PAEs的HPLC檢測方法條件優(yōu)化

采用LC-20AT HPLC儀器對10mg/L的6種PAEs混合標準工作溶液進行分離洗脫,HPLC檢測方法條件優(yōu)化過程包括:色譜柱優(yōu)選(5μm×4.6mm×250mm Inertsil ODS-P液相色譜柱、5μm×4.6mm×250mm Venusil MP C18(2)色譜柱);流動相類型優(yōu)選(甲醇/水、乙腈/水);流動相體積比例優(yōu)化(60/40、75/25、95/5、60/40～95/5、75/25～95/5);檢測波長切換等.

1.9 方法評價及程序

采用質量控制中各項指標衡量建立的6種PAEs的HPLC檢測分析方法程序的可靠性.采用前處理方法處理兩種污染土壤,隨后采用已建立的6種PAEs的HPLC檢測分析方法對其測定.6種PAEs的HPLC檢測分析方法程序:色譜柱為4.6mm× 250mm Inertsil ODS-P液相色譜柱,檢測時間為30min;進樣系統(tǒng)的進樣量為20μL;分離系統(tǒng)以乙腈-UP水為流動相、初始流速為1.0mL/min,采用梯度洗脫的方式分離PAEs,柱溫為40℃;檢測系統(tǒng)采用紫外檢測器檢測,開啟波長切換模式.

2 結果與討論

2.1 6種PAEs的最大紫外吸收波長值

最大紫外吸收波長值的優(yōu)選是HPLC檢測方法定量分析PAEs的重要基礎.采用紫外-可見分光光度計分別對100mg/L的DMP、DEP、DnBP、BBP、DEHP、DnOP標準工作溶液進行紫外波長掃描,如圖1所示,6種PAEs的最大紫外吸收波長處于200～ 205nm之間;其中,DMP、DEP和DnBP的最大紫外吸收波長值為202nm,BBP、DEHP和DnOP的最大紫外吸收波長值為203nm,如表1所示.由HPLC測定實驗得知,紫外波長值較低可能造成基線漂移的問題,因此,從PAEs的最大紫外吸收波長值選擇和控制基線漂移的角度考慮,選取205nm作為6種PAEs的HPLC檢測方法程序中的最大紫外吸收波長值.

表1 6種PAEs的最大紫外吸收波長(nm)

2.2 6種PAEs的HPLC檢測方法條件優(yōu)化

6種PAEs的HPLC檢測方法條件優(yōu)化包括挑選合適的色譜柱、優(yōu)選流動相及其比例、確定梯度洗脫的范圍、切換檢測波長等.

圖2為6種PAEs的HPLC檢測方法條件優(yōu)化,當流動相為甲醇-UP水(60/40)時,Venusil MP C18(2)色譜柱可以洗脫出2種PAEs,而Inertsil ODS-P色譜柱可以洗脫出3種PAEs;當流動相為乙腈-UP水(60/40)時,兩種色譜柱均可以洗脫出4種PAEs,但Inertsil ODS-P色譜柱分離出的PAEs吸收峰高于Venusil MP C18(2)色譜柱.因此,優(yōu)選Inertsil ODS-P色譜柱作為6種PAEs的分析色譜柱.

圖2 6種PAEs的HPLC檢測條件優(yōu)化

1DMP; 2DEP; 3DnBP; 4BBP; 5DEHP; 6DnOP.色譜柱:(a)、(b)為Venusil MP C18(2),其余均為Inertsil ODS-P.流動相:(a)、(c)、(e)、(f)、(g)為甲醇-UP水,體積比(v/v)分別為:60/40、60/40、45/55、75/25、95/5;(b)、(d)、(h)、(i)、(j)、(k)、(l)為乙腈-UP水,體積比(v/v)分別為:60/40、60/40、45/55、75/25、95/5、60/40～95/5、75/25～95/5

利用HPLC分析PAEs時,流動相中有機相的比例影響著PAEs的洗脫及分離.如圖2所示,隨著甲醇比例由45%上升至95%,PAEs的洗脫數(shù)量由2個上升至4個,但無法完全洗脫出6種PAEs;隨著乙腈比例由45%上升至95%,PAEs的洗脫數(shù)量由2個上升至6個,但前4種PAEs無法完全分離,仍需要進一步優(yōu)化方法.通過對比不同濃度的甲醇-UP水和乙腈-UP水對6種PAEs的洗脫情況可以得知,乙腈-UP水可以洗脫6種PAEs,明顯優(yōu)于甲醇-UP水,此外,乙腈-UP水作為流動相時,HPLC具有壓力低的優(yōu)點.因此,優(yōu)選乙腈-UP水作為6種PAEs的HPLC檢測方法的流動相.

利用梯度洗脫的方法可以有效分離6種PAEs.由圖2(d)、2(i)和2(j)可以發(fā)現(xiàn),當乙腈比例為60%和75%時,可以有效洗脫并分離前4種PAEs,當乙腈比例為95%時,可以洗脫6種PAEs.因此,采用梯度洗脫的方式可以洗脫并分離6種PAEs,圖2(k)和2(l)中乙腈比例分別從60%和75%上升至95%,之后乙腈以95%的比例運行至6種PAEs全部洗脫,由圖可知,兩種條件下均可以有效分離6種PAEs,但在乙腈初始比例為75%時,6種PAEs都出峰所需時間更短,因此,優(yōu)選乙腈-UP水初始比例為75/25.

表2 6種PAEs的HPLC/UV檢測方法程序

采用梯度洗脫的方式分離6種PAEs有可能造成基線漂移,如圖2(k)和2(l),此時,可以通過更改6種PAEs出峰時間段之外區(qū)域的紫外吸收波長解決此問題.

優(yōu)化之后的6種PAEs的HPLC檢測方法程序如表2所示,該方法采取梯度洗脫和紫外檢測器串聯(lián)的方式分離檢測6種PAEs,檢測時間為30min,進樣系統(tǒng)的進樣量為20μL;分離系統(tǒng)以乙腈-UP水為流動相、初始流速為1.0mL/min,柱溫為40℃;檢測系統(tǒng)采用紫外檢測器檢測、開啟波長切換模式,波長分別為205和290nm.

采用表2中6種PAEs的HPLC檢測方法對10mg/L的6種PAEs進行分離檢測.如圖3所示, DMP、DEP、DnBP、BBP、DEHP、DnOP的出峰時間分別為3.197, 4.038, 7.638, 8.942, 23.777, 24.865min. 6種PAEs在30min內完全出峰,峰形對稱、尖銳,分離效果好,該檢測方法具有較好的應用性.

圖3 6種PAEs的HPLC圖

1DMP; 2DEP; 3DnBP; 4BBP; 5DEHP; 6DnOP

2.3 方法評價

2.3.1 線性回歸方程 采用檢測方法對濃度范圍為0.1～100mg/L的6種PAEs進行測定,以峰高對濃度進行定量分析,得到6種PAEs的線性回歸方程,相關系數(shù)均大于0.999,如表3所示.

2.3.2 準確度和精密度 為了分析檢測方法的準確度及精密度,分別向兩份未污染土壤中添加6種PAEs混合標準工作溶液,使得土壤中6種PAEs的理論濃度分別達到1和5mg/kg,測定其加標回收率及相對標準偏差.

表3 6種PAEs的線性回歸方程及相關系數(shù)

表4 土壤中6種PAEs的加標回收率

如表4所示,1mg/kg的6種PAEs的加標回收率處于73.03%～91.89%,相對標準偏差處于1.78%～ 12.46%;5mg/kg的6種PAEs的加標回收率處于72.59%～90.70%,相對標準偏差處于0.30%～7.56%.由GB/T 39234-2020[22]可知,土壤樣品加標回收率范圍應處于60%～130%,相對標準偏差應低于15%,本研究6種PAEs加標回收率均滿足要求,具有較好的準確度,相對標準偏差均滿足要求,具有良好的精密度.

GB/T 39234-2020中1mg/kg紅壤樣品的DMP和DEP加標回收率為70%和76%,本研究為91.89%和78.43%,加標回收率比其更高.孫文閃等[23]采用改良QuEChERS-GC-MS測定土壤中PAEs含量,6種PAEs加標回收率處于72.5%～92.4%,盡管與本研究相近,但該方法步驟繁瑣、檢測成本較高.郭文建等[24]采用快速溶劑萃取(ASE)-凝膠凈化(GPC)-HPLC測定土壤中6種PAEs含量,其加標回收率處于66.5%～ 102%,其中3種不同濃度DMP的加標回收率均在70%以下,遠低于本研究的90.70%～ 91.89%.

2.3.3 檢出限 采用3倍噪音值法和液相色譜儀檢定規(guī)程兩種方法對檢測方法的檢出限進行計算.3倍噪音值法是HPLC儀器中估算檢出限常用的方法之一[25-27].即測定信號等于空白溶液測定信號標準偏差3倍時的樣品濃度為檢出限(LOD)[28].

LOD=(3-)/(1)

式中:代表多次測定的空白響應信號的標準偏差;代表低濃度范圍標準曲線的截距;代表低濃度范圍標準曲線的斜率.

液相色譜儀檢定規(guī)程[29]中的檢出限公式如下:

LOD=(2××)/(20×)(2)

式中:為基線噪聲峰高;為標準溶液濃度;為進樣體積,μL;20為標準進樣體積,μL;為標準物質峰高.

表5 6種PAEs的檢出限

如表5所示,由3倍噪音值法和液相色譜儀檢定規(guī)程計算所得,本方法對6種PAEs的檢出限范圍分別為:0.99～19.80, 9.49～25.11μg/kg,而GB/T 39234- 2020中6種PAEs的檢出限為20～70μg/kg,其檢出限明顯高于本方法,該方法的建立為檢測土壤中較低濃度的PAEs提供技術支持.Laturnus等[30]采用GC-MS測定土壤中PAEs含量,其中DEP、DnBP、DEHP的檢出限分別為4.3, 9.3, 43.0μg/kg,均高于本研究中3倍噪音值法所得的檢出限,且GC-MS檢測價格高于HPLC.王興磊等[31]采用GC-MS檢測土壤中PAEs,該方法對6種PAEs的檢出限分別為30, 30, 20, 30, 30, 30μg/kg,明顯高于本方法6種PAEs的檢出限.綜上所述,本方法對土壤中US EPA優(yōu)先控制6種PAEs的檢出限較低、回收率較高、精密度及穩(wěn)定性較好,同時還具有周期短、操作簡便等優(yōu)勢,具備一定的推廣應用潛力.

2.4 污染土壤樣品的測定

對老化3個月以上的兩種PAEs污染土壤進行測定,測定結果如表6所示.土壤樣品1中DMP、DEP、DnBP、DEHP、DnOP均超過美國土壤中PAEs的治理標準,土壤樣品2中的6種PAEs均超過美國土壤治理標準.

表6 污染土壤中PAEs濃度檢測(mg/kg)

3 結論

3.1 本研究建立了檢測土壤中US EPA優(yōu)先控制6種PAEs的超聲萃取-高效液相色譜法.該方法具有較寬的線性范圍,最大質量濃度范圍在0.1～100mg/L之間,相關系數(shù)均在0.999以上;1和5mg/kg的6種PAEs加標回收率分別處于73.03%～91.89%和72.59%～90.70%之間,相對標準偏差分別處于1.78%～12.46%和0.30%～7.56%之間;采用三倍噪音值法及液相色譜儀檢定規(guī)程計算所得的本方法對6種PAEs的檢出限濃度范圍為0.99～19.80和9.49～ 25.11μg/kg.

3.2 超聲萃取-高效液相色譜法具備較好的準確度及精密度,較低的檢出限.該方法成本較低,檢測周期短,操作簡便,可以快速、大批量測定土壤中6種PAEs.

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Study on the high-performance liquid chromatography detection method of phthalic acid esters in soils.

LIN Jia-bao1,2, SUN Yu-hao1, WANG Jian1*, GAO Yan-zheng1

(1.Institute of Organic Contaminant Control and Soil Remediation, College of Resources and Environment Science, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China；2.Jiangsu Environmental Engineering Technology Co., Ltd., Jiangsu Environmental Protection Group Co., Ltd., Nanjing 210019, China)., 2023,43(2)：756～763

In order to detect phthalic acid esters (PAEs) in soils more efficiently, quickly and economically, an ultrasonic extraction-high-performance liquid chromatography (UE-HPLC) method was established and optimized. Dimethyl phthalate, diethyl phthalate, di-n-butyl phthalate, butyl benzyl phthalate, bis (2-ethylhexyl) phthalate, di-n-octyl phthalate were selected as experimental subjects, which were under the priority control of US Environmental Protection Agency. By measuring the maximum ultraviolet absorption wavelength of six types of PAEs and optimizing the operating conditions of high-performance liquid chromatography, the high-performance liquid chromatography detection method of six types of PAEs in soils was established. The specific parameters of the method are as follows: the detection time was 30min; the injection volume of the injection system was 20 μL; the separation system used acetonitrile and ultrapure water as mobile phases, and the initial flow rate was 1.0mL/min. PAEs was separated by gradient elution, and the column temperature was 40℃. The detection system used ultraviolet detector to detect, and the wavelength switching mode was switched on, and the wavelength was 205 and 290nm respectively. The method was evaluated by linear regression equation, correlation coefficient, recovery rate, relative standard deviation and detection limit. The results showed that the method had a wide linear range, with the maximum mass concentration ranging from 0.1 to 100mg/L, and the correlation coefficients were above 0.999. The spiked recoveries of 1 and 5mg/kg were 73.03%～91.89% and 72.59%～90.70%, respectively, and the relative standard deviations were 1.78%～12.46% and 0.30%～7.56%. The detection limits of six types of PAEs were calculated by triple signal-to-noise ratio method and verification regulation of liquid chromatographs. The detection limits of PAEs were 0.99～19.80 and 9.49～25.11μg/kg, respectively.

HPLC；phthalic acid esters (PAEs)；soil；detection method；ultrasonic extraction (UE)

X830.2

A

1000-6923(2023)02-0756-08

林家寶(1996-),男,安徽阜陽人,南京農(nóng)業(yè)大學碩士研究生,主要研究方向為土壤有機污染控制與修復.

2022-06-29

國家自然科學基金資助項目(42007104,22161132011);江蘇省碳達峰碳中和科技創(chuàng)新專項資金資助項目(20220013)

* 責任作者, 講師, wj308119@njau.edu.cn