流體切應力對銅綠微囊藻細胞活性的影響

劉任靜,蔣文濤*,徐凱仁,李忠友,李 瀟,閔 磊,梁 英

流體切應力對銅綠微囊藻細胞活性的影響

劉任靜1,2,3,蔣文濤1,2,3*,徐凱仁1,2,3,李忠友1,2,李 瀟1,2,閔 磊1,2,梁 英1

(1.四川大學建筑與環境學院,四川 成都 610065；2.四川大學,生物力學工程四川省重點實驗室,四川 成都 610065；3.宜賓四川大學產業技術研究院,四川 宜賓 644000)

為討論流體切應力對銅綠微囊藻細胞活性的影響,本文研究了銅綠微囊藻在0.0,0.3,0.6,0.9Pa切應力作用下的生長情況,并分析了藻細胞生理指標以及藻液指標的變化情況.結果顯示,低于0.6Pa的切應力能使藻細胞密度和光合色素含量不斷增加,從而促進銅綠微囊藻的生長繁殖.其中0.6Pa對藻細胞生長最有利,此條件既能提高藻細胞光合作用強度和營養鹽利用率,又未過度破壞細胞結構.但0.9Pa高切應力將通過對藻細胞結構的破壞來影響膜滲透性,進而抑制銅綠微囊藻生長與代謝.研究表明,流體切應力對銅綠微囊藻細胞的影響體現為“低促高抑”,即適度切應力能夠增強銅綠微囊藻細胞的活性,而高切應力會抑制其生長.本文結果將為湖泊水庫等水體銅綠微囊藻水華的預防和治理提供了新的思路和方案.

水華；切應力；銅綠微囊藻；光合作用；細胞膜

水體富營養化導致的藍藻水華是世界性水環境問題[1].我國有三分之一湖泊處于富營養化狀態,其中太湖,巢湖,滇池仍為國家湖泊水華治理的重點[2].藍藻水華會消耗水中溶解氧并破壞水生生態系統平衡,還會產生劇毒藻毒素威脅飲用水安全,給社會和經濟的可持續發展帶來了不利影響[3-4].

水華的形成受環境因素和藻細胞生理結構的制約,其中環境因素包括水體營養鹽濃度,光照和水動力條件等[5-6].在環境因素中,水體營養鹽濃度的控制所需周期長,難度大而光照等氣候條件又難以實現人為調控,故探究水力擾動對藻類生長的影響已成為水華治理的重點[7].已有大量研究證實流動,流速和擾動等水力學條件對藻類生長具有顯著影響[8-10],適度的水體擾動能促進微囊藻的生長和菌落數的增加[11-13].然而,無論是哪種水力擾動,其本質都是水體中動力學環境的變化,即流體壓強或切應力的改變[14].研究發現藍藻在0.4MPa靜壓即水下40m處壓強才會被破壞,而藍藻水華多發生在水下5m和淺水湖泊中,由此可見切應力是影響藻類生長的主要因素[15].

圍繞切應力對藻類生長影響,已有研究發現螺旋藻和小球藻在相同剪切流中產氧率變化完全相反,表明不同種類的微藻對切應力響應與耐受力存在不同規律,這與Thomas等通過總結量化得出微藻對切應力的敏感程度為綠藻<藍藻<硅藻<甲藻的結論相符[16-17].此外,研究還發現流體切應力會改變真核細胞和原核細胞長度和形態,且長時間切應力作用能夠增加微藻產氧量[18-19].由此可見,微藻生長過程的確會受切應力影響.但近年來國內外針對切應力與藻細胞關系的研究主要集中于工業生產中需要大量繁殖的微藻種類,以獲得不同培養儀器中藻細胞達到高生長率的條件[20-21],而關于切應力對典型水華藻種生長影響的研究尚未得到足夠的關注.

因此本研究選取水華優勢藻種銅綠微囊藻為研究對象,將切應力作為唯一影響參數,通過對不同切應力狀態下銅綠微囊藻細胞生長情況和藻細胞內部生理指標變化以及藻細胞培養液(藻液)指標變化來探究切應力對銅綠微囊藻生長特性和活性的影響,從而為揭示富營養化水體中藍藻水華爆發原因及其預防和治理提供參考.

1 材料與方法

1.1 實驗材料與裝置

銅綠微囊藻水華是最常見藍藻水華之一,BG11培養基為常用微藻培養基,因此選取銅綠微囊藻FACHB-905為實驗對象,BG11為實驗培養基[22-23],兩者均購自中科院水生生物研究所淡水藻種庫.

圖1 剪切流旋轉桶裝置與雙桶示意

實驗裝置為剪切流旋轉桶裝置,如圖1所示,雙桶為透明亞克力材質,外桶固定于地面,內桶由電機帶動旋轉,變頻器用于控制旋轉桶的速度,取樣口距外桶底部1cm.此裝置可產生穩定且均勻切應力場[24],桶間切應力表達式見式(1)[16]

式中:為剪切應力,Pa;為培養基動力粘性系數, Pa·s;為旋轉桶角速度(rad/s);1,2分別為旋轉桶內,外半徑;為旋轉桶內某質點距旋轉軸的距離(1￡￡2).其中:1=140mm,2=150mm,壁厚均為5mm,即的范圍為140～145mm.將實驗倉中心位置即=142.5mm處的切應力代表藻細胞所受切應力,此時切應力的變化不超過1.8%.

1.2 實驗方法

將購置的藻種與培養基1:2在無菌室內接種后置于光照培養箱中,按照中科院水生生物研究所的方法擴大培養后用于實驗.實驗開始時,向旋轉桶裝置中加入銅綠微囊藻懸浮液800mL,設置光照強度為 3500lx,室內平均溫度為28℃,藻液從培養箱中取出后靜置2h,以確保藻液的溫度與室溫一致,光暗比為 14:10,轉速分別為0,100,200,300r/min,其對應切應力約0.0,0.3,0.6,0.9Pa,將4種條件實驗組分別定義為靜止組和低,中,高切應力組.實驗周期為7d,每2d取樣15mL,用于測定其藻液指標和藻細胞指標.在裝置停止后1min內完成取樣,以保證取樣的均勻性和實驗的連續性.藻液指標包括pH值,營養鹽濃度(總氮濃度TN,總磷濃度TP)和核酸含量;藻細胞指標包括銅綠微囊藻密度,藻細胞增長率(藻比增長率),葉綠素a濃度(Chl-a),類胡蘿卜素濃度(car),藻藍蛋白濃度(PC),別藻藍蛋白濃度(APC)和丙二醛濃度(MDA).

1.3 分析測試方法

采用pH值,TNTP濃度和藻液核酸含量表征藻液指標的變化.其中,藻液pH值使用pH計(PHS-3C)進行測量;TNTP濃度使用總磷測定儀(5B-6P)和總氮測定儀(LH-3BN)進行測量;藻液核酸含量采用分光光度法即用260nm處吸光度來評估藻細胞滲出的核酸濃度[25].

采用藻密度和藻比增長率,Chl-a和car濃度,PC和APC濃度,MDA含量表征藻細胞指標變化.其中,銅綠微囊藻密度采用分光光度法即680nm處吸光度來代表藻細胞密度[26]; Chl-a和car濃度測定采用甲醇提取的紫外分光光度法[27-28]:取5mL藻液離心(4°C, 13500r/min, 5min),棄去上清液后將藻細胞重懸于5mL甲醇(90%)中,60°C水浴10min后再次離心,收集上清液并使用紫外可見分光光度計(UV- 4802)測量在 470,652,665nm處的吸光度并計算;PC, APC濃度按照孫曉筠等[29]的方法進行測量;MDA含量采用南京建成生物工程研究所的試劑盒測定.藻比增長率計算如下:

式中:X為當天細胞密度;X-1為前1d細胞密度;t為X對應培養時間;t-1為X-1對應培養時間.

數據處理和圖像繪制使用Origin 2023,對照組和實驗組密度,葉綠素a濃度等指標差異采用IBM SPSS Statistics 26單因素方差法(<0.05)進行統計分析.

2 結果與分析

2.1 流體切應力對銅綠微囊藻細胞培養液的影響

實驗開始時,各組藻液TN,TP,pH值無顯著性差異(圖2) (>0.05),隨著實驗進行 TN有不同程度降低(圖2a):靜止組和低,中切應力組表現為切應力越大,TN越小;而高切應力組對TN的利用率僅高于靜止組,到試驗結束時其各組TN分別下降13.6%, 24.3%,28.2%和16%.實驗各組TP在第5d才出現顯著性差異(圖2b) (<0.05),其中靜止組和低,中切應力組變化趨勢相同,而高切應力組的TP剩余量在實驗結束時仍高于其余組.實驗中,雖然各組藻液TN, TP不斷下降,但營養鹽濃度始終處于富營養化水平,足以維持藻細胞的正常生長.靜止組和低,中切應力組在實驗開始后pH值不斷增加(圖2c),而高切應力組的pH值在實驗第3d下降后才上升,但直至實驗結束其pH值仍低于其余組.

2.2 流體切應力對銅綠微囊藻細胞密度和光合色素的影響

通過銅綠微囊藻密度(圖3a)表征其總生物量,藻比增長率(圖3b)表征其增長速率.實驗開始后各組密度呈現出上升趨勢(圖3a),藻密度從第3d開始出現了明顯的區別,總體表現為切應力組密度高于靜止組但中,高切應力組生長曲線無明顯差異(>0.05).從比增長率來講,各組都呈現先上升后下降的趨勢,且最大比增長率出現在中切應力組(圖3b).

*代表<0.05;**代表<0.01

銅綠微囊藻細胞中的光合色素分為脂溶性色素(Chl-a,car)和水溶性蛋白(PC,APC),光能在藻膽體中傳遞的順序為PC-APC-Chl-a[30].實驗前各組銅綠微囊藻細胞的光合色素含量差異不顯著(圖4)(> 0.05).藻細胞的Chl-a,car濃度隨實驗時間的增加而增加(圖4a,圖4b),到實驗第5d后,靜止組和低,中切應力組Chl-a,car濃度存在顯著性差異(<0.05),實驗結束時切應力越大,Chl-a,car濃度越高.藻細胞PC,APC相對含量呈現先下降后上升的趨勢(圖4c,圖4d),到實驗結束時PC相對含量表現為切應力組高于靜止組,而APC相對含量在實驗第3d后呈現出隨切應力增加而增加并且隨著實驗時間的增加而增加的規律.

2.3 流體切應力對銅綠微囊藻細胞膜的影響

各組銅綠微囊藻藻液的核酸含量隨著實驗進行呈現出先下降后上升趨勢(圖5a),實驗進行中靜止組藻液核酸含量基本維持原來水平,而切應力組核酸含量隨切應力的增加而增加,且處理時間越長,核酸含量越高.實驗第3d切應力組藻液核酸含量無明顯差異(>0.05),但靜止組與切應力組之間存在明顯差異(<0.05).實驗第5d后各組差異顯著(< 0.05).MDA含量變化與核酸含量變化相似,靜止組MDA含量從第3d開始基本保持不變,而切應力組 MDA含量隨切應力的增加而上升且隨著處理時間的增長而增加(圖5b).

圖5 銅綠微囊藻細胞膜指標

*代表<0.05;**代表<0.01

3 討論

微囊藻水華是最常見的水華藻屬,研究證明水動力擾動對微囊藻生長有直接影響[22].本文以切應力為水動力擾動參數,在光照強度,營養鹽濃度等環境因素保持一致的前提下,利用剪切流旋轉桶裝置對銅綠微囊藻細胞施加不同強度切應力(0,0.3,0.6, 0.9Pa)來探究藻細胞在切應力作用下生長變化情況,為揭示流體力學應力對銅綠微囊藻水華的影響提供理論依據.

結果顯示,藻細胞在經過短暫適應期后便迅速繁殖進入對數增長期,流體切應力對銅綠微囊藻生長有顯著影響,小于0.6Pa的切應力組較靜止組表現為促生長作用.究其原因,首先在實驗中光合色素含量均較靜止組顯著上升,而脂溶性色素Chl-a,水溶性蛋白PC,APC含量的增加能強化藻細胞對光能的捕獲,吸收與傳遞,car又能起到防止葉綠素分子被破壞,維持光合機能的運作[31],兩個方面共同作用進而增強光合作用促進藻細胞生長.其次,實驗設置的光照強度為3500lx,小于銅綠微囊藻的光飽和點40000lx[32].當光照強度低于光飽和點時,切應力可通過改變藻細胞的光照機制來增強細胞的分裂過程[33-34],這可能是切應力通過光合作用促進藻細胞生長的另一種方式.故切應力條件可以從兩個不同的角度促進藻細胞光合作用的進行,這是出現促進作用的原因之一.

從另外一方面來看,在0～0.6Pa范圍內,藻細胞對TN,TP吸收利用率隨切應力的增加而增加,這一實驗結果與其他研究中切應力能提高營養鹽傳遞速率的結果一致[35],銅綠微囊藻需要這些外源性氮來維持生長代謝及產毒,并利用水體中的外源性磷來用于胞內核酸,ATP和細胞膜上磷脂等生理組織的合成及生理代謝[36-37].因此,切應力條件還能通過提高營養物質吸收利用率來促進藻細胞的生長.

最后,銅綠微囊藻是一種自養型生物,二氧化碳是其主要碳源,而切應力造成的水體流動混合既可使水中二氧化碳梯度隨著水體混合強度的增高(即切應力的增大)而減小[38],促進藻細胞對二氧化碳的吸收;又可降低藻細胞周圍分泌和代謝產物濃度,減少其對藻細胞生長的抑制作用,進而提高藻細胞的生長速率[39].

但是在高切應力組(>0.9Pa),并未出現與低/中切應力組一致的生長情況.因為已有研究證實藻細胞受損后會釋放大量胞內酸性物質和內源性營養物質[40],同時降低藻細胞對營養鹽的利用率[35],因此核酸外滲量和MDA的累積量可用于表征藻細胞損傷水平和細胞膜脂質過氧化的程度[41].高切應力組結果顯示這兩個指標含量與切應力成正相關且在高切應力條件下顯著增大,表明高切應力會導致細胞膜遭受不可逆損傷而抑制藻細胞的生長代謝.其他學者的研究也表明銅綠微囊藻在高混合培養環境中所積累的MDA是銅綠微囊藻生長減慢的原因[42-44].此外,高切應力組pH值和營養鹽(TN,TP)的變化規律與藻細胞損傷后的結果規律也一致,進一步證實藻細胞在高切應力作用下將產生不可逆損傷.

綜上所述,切應力在較低范圍內(本文<0.6Pa)能通過改善藻細胞光照機制和提高二氧化碳利用率來增強光合作用,通過均衡營養鹽分布來促進總磷,總氮吸收,適當的水體流動混合還能降低藻細胞周圍代謝物濃度,最終起到促進藻細胞生長的作用.而在高切應力(本文>0.9Pa)條件下,切應力將對藻細胞的結構產生破壞,影響細胞膜滲透性和生理功能,進而抑制藻細胞生長.由此趨勢可判斷,切應力的持續增加將進一步對藻細胞膜產生更嚴重的損傷,會更顯著的抑制藻細胞生長甚至直接導致藻細胞的機械破碎,這與已有的高速流動和強水力擾動對水華具有抑制和消亡作用等研究結果相吻合[8,45].事實上流體切應力對細胞的影響在很多領域均已被證實:醫學研究發現低的壁面切應力(<0.6Pa)對內皮細胞的作用是發生動脈粥樣硬化的重要原因[46-47];植物學研究也表明,高剪切力會使得植物細胞生長率,產量和細胞聚集體的大小都有所下降,當切應力高達100Pa時,會直接使植物細胞分散[48-49];微生物學研究也同樣發現在10.9～14.5Pa高切應力下大腸桿菌細胞會發生長度變化和不對稱分裂[19].以上證據表明切應力是一個影響動植物和微生物細胞生長的重要因素.由此可見,已有的水力擾動研究中無論是最佳轉速,最佳水力強度還是最佳生長流速等均是在一定切應力作用下產生的結果.

需要注意的是,本文的結果是在平均溫度28℃,光強3500lx,光暗比為14:10且營養鹽充分等有利于銅綠微囊藻生長的條件下獲得的,而在湖泊水庫中水華的休眠與復蘇與其水質氣候等環境因素緊密相關[50-51].因此,若要將切應力對藻細胞的影響規律應用到治理水華實例中,還應考慮其所處環境條件“因地制宜”.以溫度為例,低溫(15℃)比適宜溫度(25℃)對藻類帶來的抑制作用會更為顯著[52],即在相對低溫的環境下,所需的可產生抑制效果的臨界切應力可能會更小,反之,酷暑高溫環境下,所需的臨界切應力可能會更大.因此,還需要根據不同湖泊富營養化程度和溫度變化情況等環境因素綜合考慮后分析切應力的最優抑制效果.同樣也提示,不同水質,溫度和富營養等條件下切應力對藻細胞的影響規律還需要更加深入的研究.

4 結語

本文以銅綠微囊藻為研究對象,在光照和溫度等外部環境因素保持一致的前提下,對藻細胞施加不同強度的均勻切應力,旨在探究流體切應力對銅綠微囊藻細胞生長的影響.結果清晰的展示了銅綠微囊藻在不同切應力作用下生長變化情況,驗證了流體切應力是影響藻細胞活性的直接因素,獲得了實驗室條件下銅綠微囊藻細胞對切應力的耐受范圍,同時發現切應力對銅綠微囊藻細胞的影響體現為“低促高抑”,即低切應力能提高藻細胞活性而高切應力會抑制藻細胞生長與代謝.

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Effect of fluid shear stress on activity ofcells.

LIU Ren-jing1,2,3, JIANG Wen-tao1,2,3*, XU Kai-ren1,2,3, LI Zhong-you1,2, LI Xiao1,2, MIN Lei1,2, LIANG Ying1

(1.College of Architecture and Environment, Sichuan University, Chengdu 610065, China；2.Key Laboratory for Biomechanical Engineering of Sichuan University, Chengdu 610065, China；3.Yibin Industrial Technology Research Institute of Sichuan University, Yibin 644000, China)., 2023,43(2)：896～903

To study the effect of the shear stress on the cell activity of, its growth under shear stresses, 0.0, 0.3, 0.6 and 0.9 Pa, was investigated accordingly, and the changes of the algal-cell physiological indicator and the algal-fluid indicator were analyzed. The results indicated that the shear stress below 0.6 Pa can cause the density and photosynthetic pigment content of Microcystis aeruginosa cells increase, promoting their growth and reproduction.The photosynthetic intensity and the nutrient utilization were enhanced by the most favorable shear-stress condition (0.6Pa) for growth, while the cell structure was not excessively damaged. However, the high shear stress, 0.9Pa, would affect the membrane permeability of the algal cells by breaking their structure, thereby inhibiting their growth and metabolism.The results demonstrated that the growth ofcells was affected by the fluid shear stress, manifested as “low promotion and high inhibition”, where their activity was enhanced by moderate shear stress, and their growth was inhibited by the high shear stress. The findings provided a hint or an approach for preventing and managingblooms in water bodies, such as lakes and reservoirs.

water bloom；shear stress；Microcystis aeruginosa；photosynthesis；cell membrane

X172

A

1000-6923(2023)02-0896-08

劉任靜(1998–),女,四川樂山人,四川大學建筑與環境學院環境系碩士研究生,主要從事湖泊富營養化水體研究.

2022-07-18

國家自然科學基金資助項目(11972239;12102281),四川省自然科學基金(2022NSFSC1967)

* 責任作者, 教授, scubme_jwt@outlook.com