基于Illumina RNA-Seq分析的三種內分泌干擾物對斑馬魚神經毒性效應與機制

郭子一,王偉偉,宋 杰,王慧利*

基于Illumina RNA-Seq分析的三種內分泌干擾物對斑馬魚神經毒性效應與機制

郭子一1,王偉偉2,宋 杰1,王慧利1*

(1.蘇州科技大學,江蘇 蘇州 215009；2.溫州醫科大學,浙江 溫州 325035)

三氯生、三氯卡班和雙酚A均具內分泌干擾作用,但從轉錄組學層面上揭示其靶分子及神經毒性機制鮮有報道,因此,本文借助RNA-Seq測序獲得它們暴露斑馬魚幼魚的轉錄組數據,基于生物信息分析證明:三種藥物暴毒組差異表達基因(DEGs)的GO功能和KEGG代謝途徑富集在生物過程、細胞組成和分子功能上,富集的DEGs數量和功能均不同,在神經相關途徑上均有富集,但具體信號通路和途徑不同.PPI網絡節點關聯度計算發現:富集在神經通路的Hub基因也不同,且與神經標志功能基因之間存在豐富間接的互作網絡.將DEGs與TCGA數據庫中膠質母細胞瘤GBM突變基因整合,證實其環境暴露均有誘發GBM風險,但發生途徑和調控信號通路不同,故從分子水平上解析了三種污染物誘導神經毒性機制的根源.

內分泌干擾物；斑馬魚；轉錄組測序；神經毒性；神經膠質母細胞瘤

環境內分泌干擾物(EDCs)是一類廣泛存在于環境中,可干預生物體內源激素的合成、分泌、轉運、降解過程,對生物體的生殖、免疫、內分泌和神經各大系統造成傷害的化學物質[1],其污染問題已經受全球重點關注.EDCs主要來自醫藥或農藥中,也用于塑料、洗滌劑、涂料及化妝品等.自然環境中EDCs含量較低,多數以10-12濃度或者10-15濃度為主,然而由于目前工業生產廢氣、生產生活廢水、農藥的殘留沉降、垃圾填埋物等污染,自然環境中EDCs含量逐漸增多[2].近期的體內、體外實驗和流行病學研究表明,EDCs暴露增加了精神退行性疾病、肥胖、代謝綜合征和2-型糖尿病的發生的風險[3].2022年5月,國務院辦公廳印發的《新污染物治理行動方案》中環境內分泌干擾物被列入需加強風險管理的新污染物范疇.這類化學物質污染的毒性效應已成為新的公共衛生問題,引起全世界高度關注.

三氯生(Triclosan, TCS)和三氯卡班(Triclocarban, TCC)均為高效廣譜性殺菌劑,廣泛應用于醫藥、精細化工等領域[1].其大量頻繁使用產生的“二次污染”對生態環境隱患已成不爭的事實[2-3].盡管2016～2017年美國FDA禁止二者在手皂和沐浴露中使用,2019年在臨床護理、洗手液和牙膏產品中禁用,但是,其仍被添加到各種家庭和工作場所的領先品牌產品中,在世界范圍內銷售.目前,全球TCS和TCC的年產量分別約為1.05×105t,7.5× 105t.TCC在中國的年產量超過6000t[3],經污水處理廠處理后的出水有3%以上的TCC殘留,其已被美國國家環境保護局列入最常見的十大水污染物之一[4].由于TCS (logow=5.46) 和TCC(logow=4.9)的親脂性比較強,故有較強的生物蓄積、生物放大作用.研究者在水藻、魚蝦,甚至80%婦女的乳汁和臍帶血中均檢出二者的存在[5].TCS和TCC的化學結構近似于非固醇類激素,與典型的內源激素干擾物雙酚A(BPA)、多氯聯苯和多溴聯苯醚等結構的相似性可預測其潛在的(抗)雄或雌激素效應.越來越多的體內外實驗也證實了它們作用于免疫、生殖、神經三大系統并會干擾人和動物的內分泌系統.雖然目前致代謝紊亂、免疫和生殖毒性研究已比較成熟,但對神經毒性效應及機制研究尚欠缺充足數據.

由于不同污染物作用受體、靶分子和致毒機制不同,給環境健康帶來不同的風險,尤其是誘發神經相關疾病和機制還不明了.斑馬魚作為繼小鼠之后的第二大脊椎模式動物,以其與人類基因超高相似度(87%)而被用于環境污染物的毒性研究模型[5].有研究表明,低劑量BPA暴露就會導致斑馬魚畸形率升高[6],神經元數量增多,導致斑馬魚過度活躍而出現多動癥[7].而TCS會干擾魚類的甲狀腺,其對神經發育有重要作用[8].TCC除了改變胚胎神經元細胞的表觀遺傳狀態,還會導致早期發育階段腦神經元自噬[9-11].但大多數研究依舊局限于個體、組織器官或功能評判層面,故本研究選擇斑馬魚為模式生物,以BPA、TCS、TCC為研究對象,利用轉錄組深度測序獲取了三者急性暴露斑馬魚幼魚的轉錄組數據,借助生物信息學分析,將其轉錄組數據與TCGA數據庫整合分析,從分子層面上評判三種內分泌干擾物對水生生物的神經毒性效應,分析比較其作用靶標、作用途徑、致毒機理及可能誘發神經相關疾病的異同,評判其誘發神經膠質瘤的潛在風險.為從分子水平上評判環境污染物健康風險與預警提供科學依據.

1 材料與方法

1.1 LC50的計算

在ChemDraw軟件中分別繪制三種內分泌干擾物的結構式,以mol格式導出至Ecosar Applcation 軟件,點擊Submit進行數據處理,得出BPA、TCS、TCC三種內分泌干擾物的LC50預測值.再根據軟件預測的LC50,選擇濃度對斑馬魚進行梯度濃度暴露.胚胎從6hpf開始在培養皿中進行暴毒處理,每組50顆胚胎,每24h更換藥液一次,其中BPA的梯度濃度分別為0, 5.5, 6.5, 7.0, 8.0, 9.0mg/L,TCS的梯度濃度分別為0, 0.20, 0.25, 0.30, 0.40, 0.50mg/L.TCC的梯度濃度分別為0, 100, 300, 350, 400, 500μg/L,分別統計在120hpf各暴露濃度對應的斑馬魚死亡率,獲得劑量-效應關系曲線,50%死亡率的對應暴露濃度即為LC50.

1.2 斑馬魚的飼養與暴露

使用的實驗動物為野生型斑馬魚AB品系,根據斑馬魚的養殖指南,雌雄母魚分開飼養在專用養殖系統中.調節水溫為(28.5±0.5)℃,pH值為6.8～7.5;設置為14h光照:10h黑暗循環周期,每d 08:00和18:00喂食兩次新鮮豐年蝦.

對照組、BPA組、TCS組、TCC組四組胚胎從6hpf開始在培養皿中進行暴毒處理,暴露濃度均為225μg/L每24h更換暴露藥液1次,持續暴露至實驗所需.

1.3 Illumina RNA-Seq測序

選取連續暴露在三種藥物5d的斑馬魚幼魚(5dpf),分別提取RNA,建立測序文庫,采用Illumina Hiseq4000進行測序,測序讀長為雙端2*150bp.測序原始數據(Raw data)進行過濾去雜和質控分析,獲得合格測序數據,測序數據以FPKM(Fragments Per Kilobase of exon model per Million mapped reads),即指在每百萬測序堿基中每千個轉錄本測序堿基中所包含的測序片斷數,表示基因在不同處理組中的表達豐度.將表達豐度不同的序列通過比對到Ensembl上最新的Zv9.0斑馬魚序列(ftp://ftp. ensembl.org/pub/release-66/fasta/danio rerio/dna/),獲得全面轉錄本信息,并進行基因表達定量,按∣log2 (fold change)∣31,-value <0.05的閾值選取所有陽性差異表達基因(DEGs)進行后續分析.

1.4 差異基因的GO功能分類和KEGG Pathway富集分析

將篩選出的DEGs及其差異變化倍數導入微生信在線分析網(https://www.bioinformatics.com.cn),根據基因標識以生物過程(Biological Process)、細胞組成(Cell Component)和分子功能(Molecular Function)進行GO功能分類及KEGG富集分析,GO功能分析作用是將篩選得到的差異表達基因進行GO功能條目富集,判斷其顯著相關的生物學功能,涉及生物過程(Biolo-gical Process)、細胞組成(Cell Component)和分子功能(Molecular Function)三方面.KEGG信號通路分析是對各處理組差異基因的代謝通路Pathway分析,尋找不同藥物暴露下的差異基因可能與哪些細胞通路的改變有關.最終確定差異基因主要參與的GO Term及信號通路.

1.5 差異表達基因的蛋白互作分析

將篩選出來的DEGs導入STRING 11.0 (http: //www.string-db.org/),在線進行候選DEGs能夠互作的蛋白分析,構建蛋白互作網絡(Protein-protein interaction, PPI),將蛋白互作網絡導入Cytoscape 3.9.1軟件進行可視化分析,使用Cytohub插件對DGEs進行模塊化分析,從DGEs中篩選出與蛋白互作積分較高的Hub基因以備其功能評判.

1.6 膠質母細胞瘤突變基因篩選與分析

cBioPortal(https://www.cbioportal.org/)是一個開源平臺,用于探索、可視化和分析多維癌癥基因組學和臨床數據.cBioPortal包含200多項癌癥基因組學研究[12],包括來自癌癥基因組圖譜(The Cancer Genome Atlas, TCGA) 的所有數據.通過cBioPortal平臺下載膠質母細胞瘤(Glioblastoma, GBM)的突變基因數據,共有14972個突變基因,篩選出其中976個致癌基因將其與三種藥物處理的轉錄組測序數據中候選DEGs在STRING轉化后進行比較分析,篩選出污染暴露差異基因與TCGA致癌基因的交集基因,評判污染物暴露誘發GBM的風險.

2 結果與分析

2.1 三種污染物對不同水生生物的LC50預測與對斑馬魚幼魚的LC50實驗值測定

經過Ecosar Applcation軟件分析得出BPA、TCS和TCC對不同生物的半致死濃度(表1),由表1可知三種污染物對魚類、水蚤和綠藻的毒性大小排序均為TCC>TCS>BPA.表明TCC對水生動物的毒性最高.盡管三種環境雌激素結構相似(圖1),但對水生生物的毒性效應卻不同.

表1 三種典型環境雌激素污染物的LC50預測

圖1 三種污染物化學結構式及其對120hpf斑馬魚幼魚LC50模擬

參考三種污染物魚類對應的LC50預測值,分別在其上下各設定2～3個濃度梯度暴露處理6hpf的斑馬魚胚胎(hpf為受精幾小時后的縮寫),放置6孔板中持續暴毒至120hpf,模擬出BPA、TCS、TCC對斑馬魚幼魚(120hpf)LC50分別為9.06,0.51和0.46mg/L.擬合回歸曲線2值分別為0.91,0.99和0.99,BPA,TCS和TCC劑量-效應回歸方程的2值均超過90%(圖1).因此,后續轉錄組測序實驗選取半致死劑量的約1/2作為亞致死處理劑量(225μg/L).

2.2 污染物暴露斑馬魚轉錄組測序差異表達基因篩選和功能分析

為了分析比較三種環境內分泌干擾物的毒性效應的分子靶標,以225μg/L相同濃度的三種不同污染物暴露斑馬魚胚胎,暴露第5天時進行轉錄組測序.對表達豐度不同的測序進行差異分析,設定顯著差異的閾值標準為|log2fold change|31且<0.05,篩選出三種污染物處理組與對照組之間的差異基因,繪制如圖2(A)的火山圖,由圖可見TCC處理組發生顯著變化的基因明顯多于BPA和TCS暴露組,且TCC處理組的差異基因變化幅度明顯高于其它兩個藥物暴露組.由圖2(B)發現,與對照組相比,BPA、TCS、TCC、分別產生99、581、740個DEGs,其中BPA處理組有37個上調和62個下調DEGs. TCS處理組約272個差異基因表達上調和309個表達下調,TCC處理組存在174個上調基因和564個下調基因.圖2(C)顯示三種污染物處理組中存在9個重疊的顯著差異基因,說明這3種環境污染物致斑馬魚幼魚差異變化的基因大多數不同,預示其作用靶分子或毒性效應機制不同.

圖2 各處理組差異基因火山圖(A)、統計圖(B)、韋恩圖(C)

2.3 三種污染物差異表達基因GO富集分類

為了進一步分析比較三種內分泌干擾物差異表達基因的分布功能以及作用途徑,我們對差異表達基因進行了GO和KEGG富集分析,以了解三種EDCs暴露組中所有差異表達基因所富集的生物學功能和涉及的代謝調控Pathway,以深入闡明EDCs暴露作用的相關分子機制.圖3展示了各處理組所富集到的排名前10的GOterms(<0.05),氣泡圖的左側為相應的基因富集的生物過程、通路、部位等名稱,氣泡的大小代表所富集到的DEGs的數量.

GO分析顯示,TCS處理組在生物過程(Biological Process)方面,有大部分差異基因富集在“對外來刺激的反應(Response to xenobiotic stimulus)”、“藥物反應(Response to drug)”以及“藥物代謝過程(Drug metabolic process)”等生物過程.而在細胞組成(Cell Component)方面,差異基因主要富集在“質膜區(Plasma membrane region )”部位.在分子功能(Molecular Function)方面,大部分差異基因富集在“鐵離子絡合(Iron ion binding)”和“氧化還原酶活性(Oxidoreductase activity)”.GO分析表明TCS主要生物影響藥物代謝過程以及氧化還原功能.TCC處理組差異基因在生物過程方面主要富集到 “細胞外基質組織(Extracellular matrix organization)”和“補體激活(Complement activation)”.而在細胞組成方面,差異基因大部分富集在“細胞外基質(Extracellular matrix)”組成.TCC處理組在分子功能上所富集到的最顯著的是“內肽酶活性(Endopeptidase activity)”功能.GO分析顯示與TCS相比TCC主要影響細胞外基質形成的過程以及補體和內肽酶活性.

BPA處理組的差異基因在生物過程(Biological Process)方面大部分富集在“物種間相互作用(Interspecies interaction between organisms)”以及“對激素的反應(Response to hormone)”等兩個生物過程.在細胞組成(Cell Component)方面,差異基因主要富集在“突觸后密集區(Supramolecular fiber)”、“神經元間突觸(Neuron to neuron synapse)”以及“不對稱突觸(Asymmetric synapse)”.在分子功能(Molecular Function)方面,BPA處理組差異基因富集到分子功能項與TCS相似,分別是“鐵離子結合(Iron ion binding)”和“氧化還原酶活性(Oxidoreductase activity)”等相關功能 (圖3).GO分析顯示與TCC不同BPA主要影響生物間的相互作用以及生物氧化還原的分子功能.

由此可知,三種污染物差異基因的GO功能富集存在一定的差異,尤其是TCC的GO功能與BPA和TCS差異較大.

圖3 不同EDCs干擾物處理下差異表達基因(DEGs)GO功能分析

2.4 三種污染物差異表達基因KEGG Pathway富集分析

各處理組差異基因的KEGG途徑富集如圖4A所示,TCS處理組主要富集的KEGG代謝途徑 (<0.05),主要包括“細胞色素P450對外源性物質的代謝(Metabolism of xenobiotics by cytochrome P450)”、“輔助因子的生物合成(Biosynthesis of cofactors)”、“藥物代謝-細胞色素P450(Drug metabolism cytochrome P450)”三個通路.TCC處理組顯著富集的KEGG途徑 (<0.05)包括 “附著斑(Focal adhesion)”、“肌動蛋白細胞骨架的調節(Regulation of actin cytoskeleton)”以及“光轉導(Phototransduction)”等通路.而BPA處理組主要富集的KEGG途徑 (<0.05),分別是“精氨酸和脯氨酸代謝(Arginine and proline metabolism)”與“甘油脂代謝(Glycerolipid metabolism)”通路.由此可知,三種污染物盡管均具有內分泌干擾作用或雌激素作用,但是他們靶向的差異基因富集在不同的代謝途徑,表明由不同的信號通路介導.

圖4 不同EDCs處理下差異表達基因(DEGs)KEGG功能分析

將各自富集出的前20個通路及其基因導入Cytoscape v3.9.1軟件進行可視化展示,分析其基因的表達模式聚類(圖4B).棱形代表KEGG信號通路,藍色小球代表下調的DEGs,紅色小球代表上調的DEGs.TCS顯著富集的通路大致可以劃分為三大類:藥物相關代謝途徑(紅色圈內),包括細胞色素P450對異生素的代謝、藥物代謝-細胞色素P450、藥物代謝-其他酶類、輔因子的生物合成;糖類和脂質代謝相關途徑(黃色圈內),包括類固醇激素生物合成、氨基糖和核苷酸糖代謝、淀粉和蔗糖代謝、脂肪酸代謝等途徑;神經發育相關途徑(紫色圈內),包括谷胱甘肽代謝、視黃醇代謝、抗壞血酸和醛糖代謝.TCC顯著富集的通路大致可以劃分為免疫相關途徑(紅色圈內),包括胰島素信號通路、C型凝集素受體信號通路、粘著斑等途徑;神經發育相關途徑(紫色圈內),包括光轉導、葉酸生物合成、葉酸的一個碳庫、ErbB信號通路;其他途徑例如PPAR信號通路等(綠色圈內).

BPA顯著富集的四條通路劃分為精氨酸和脯氨酸代謝途徑(紅色圈內),包括精氨酸生物合成、各種類型的N-聚糖生物合成等途徑;免疫相關途徑(黃色圈內),包括鐵死亡、RIG-I樣受體信號通路、Toll樣受體信號通路等途徑;神經相關途徑(紫色圈內),包括Notch信號通路、Apelin信號通路;其他途徑例如甘油脂代謝等途徑(綠色圈內).上述分析表明,三種污染物差異表達基因的KEGG通路在神經相關途徑均有富集,但是,作用于神經通路是不同的.TCS富集的神經作用途徑主要是周圍神經系統生長分化相關的通路,TCC富集的神經作用途徑主要是葉酸合成和ErbB信號通路;而BPA的神經富集途徑關于Notch信號通路、Apelin信號通路.從富集的基因數量來看,TCS和TCC富集的差異基因比較多,然而而TCS主要是上調的基因參與神經相關通路,TCC主要是下調的差異基因參與(圖4B).

Cytohubba軟件可對PPI網絡節點關聯度進行計算,計算出PPI網絡中最密集的區域,篩選出基因組合中的關鍵基因(Hub基因).為比較和探索三種污染物對神經毒性的機制,選取富集在神經發育相關途徑的基因進行Hub基因的篩選.如圖4C,TCS組中前10的Hub基因為、、、、、、、、、.其中有研究報道癲癇持續狀態(SE)后大鼠海馬體中GPx1蛋白時空分布表達發生了改變[13],并表明谷胱甘肽介導GPx1的調節可能影響SE誘導的神經元死亡和自噬性星形膠質細胞變性.TCC處理組中前10Hub基因為、、、、、、、、、;其中Rho家族GTP酶是小G蛋白,充當在活性和非活性形式之間穿梭的分子開關[13].Rho GTPases調節多種細胞過程,例如生長、遷移、粘附和分化[14].Rho GTPases也在調節神經元形態和功能方面發揮著重要作用[15].劉曉楠等[16]發現了Gstp可以通過JNK信號調節神經元軸突形成,表明了Gstp蛋白在皮質發育過程中在神經突起始中的新功能.BPA組中的前6個Hub基因為、、、、、,其中在維持果蠅幼蟲大腦中的神經干細胞命運和神經節母細胞分化中起關鍵作用.Elena Butturini等[17]已證明氧化應激誘導STAT1的S-谷胱甘肽化并過度激活其在小膠質細胞BV2中的信號傳導,并指出這種轉錄因子在神經炎癥中的重要性.

為證明上述篩選的Hub基因與神經標志功能基因蛋白之間的互作網絡及Hub基因調控神經毒性的作用模式,即為比較三種污染物的神經毒性效應機制.如圖4D所示,BPA組篩選出的Hub基因與腦源性神經營養因子之間存在相互作用;TCS組篩選的Hub基因與神經遞質乙酰膽堿酯酶ache具有互作關系;TCC組篩選的Hub基因中與神經營養因子4有相互作用,Hub基因、和與配對盒蛋白、Elav樣蛋白、膠質纖維酸性蛋白有相互作用.綜上所述,TCS、TCC、BPA均能直接靶向于神經相關的Hub基因誘導不同的神經毒性,也可通過Hub基因間接地與神經標志基因的互作而誘導神經毒性.就像BPA在神經毒性通路上富集KEGG pathway和Hub基因較少,但是Hub基因與神經標志功能基因之間存在豐富而間接的蛋白互作網絡.這些發現使我們在分子水平上了解了三種污染物誘導神經發育毒性效應不同、作用的分子機制與途徑不同.

2.5 三種污染物差異基因與膠質母細胞瘤突變癌基因的比較分析

膠質母細胞瘤是成人最常見、最具侵襲性的原發腦腫瘤,占原發惡性腦腫瘤的45.6%[18].膠質母細胞瘤的年發病率隨著年齡增長而增加,從兒童的0.15/10萬增加到75～84歲患者的峰值15.03/10萬[19].一些環境的致癌因素也可影響膠質瘤的發生.與神經外器官的腫瘤相比,膠質母細胞瘤和原發腦腫瘤的發生率普遍較低,可能是由于血腦屏障的對大腦的保護,血腦屏障的三磷酸腺苷結合盒(ABC)家族轉運體限制化學誘變劑向大腦擴散,使其免受毒性應激的影響.有研究表明妊娠期暴露于EDCs可能會干擾兒童正常大腦發育,并容易導致以后行為功能障礙[20],且由于這三種環境內分泌干擾物都是脂溶性物質,都具有神經毒性相關的報道.因此我們進行了這些藥物暴露誘發腦膠質瘤的潛在風險的分析,通過cBioPortal(https://www.cbioportal.org/)下載了TCGA中膠質母細胞瘤的突變基因數據,共有14972個突變基因,其中有976個致癌基因與三種藥物處理的轉錄組測序數據中候選DEGs在STRING轉化后進行比較分析.如圖5所示,BPA暴露組差異表達基因在轉化后與976個癌基因共有2個交集基因,為NOTCH3、ARAF;TCS暴露組與其有10個交集基因,為TET3、NOTCH3、SOCS2、AFF4、PMAIP1、ARID1B、ARID3A、ARNT、PTPRT、PIK3R2;TCC暴露組與其有27個交集基因,為DDX6、FAT4、ARAF、AXIN1、EML4、MIB1、ZNF750、HDAC7、IRF8、PRSS1、STAT3、CDKN1A、ABL2、PALB2、MST1、CBL、STAT4、DUSP4、S1PR2、SAMHD1、SCG5、ROS1、REL、SHOC2、TP63、RPTOR、PPARG.

BPA暴露組的交集基因中,NOTCH3是一個高度保守的基因,是一種跨膜的發育信號受體,它在細胞發育模式、細胞命運、細胞存活和增殖的調節中起許多關鍵作用[21].最近的研究已經發型了NOTCH3在神經元干細胞和神經元分化中有重要作用,NOTCH3能調節室管膜下區的靜止干細胞群[22-23].穆罕默德·艾爾庫達等[24]發現NOTCH3基因是17%的膠質瘤組織活檢中最顯著的擴增之一, NOTCH3在許多惡性腫瘤中經常被異常調控,可能在膠質瘤發生中起主要作用.ARAF是絲氨酸/蘇氨酸特異性蛋白激酶Raf家族的成員.在絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路中,Raf激酶被認為是Ras和MEK之間的重要節點[25].在典型的受體酪氨酸激酶(RTK)-Ras-Raf-MEK-MAPK信號轉導過程中,Raf在RTK刺激下直接與GTP結合的RAS轉位到質膜,然后Raf通過磷酸化激活雙特異性激酶MEK1和MEK2,進而激活ERK2,從而構成經典的三級MAPK激酶級聯.Ras-Raf-MEK-MAPK通路的異常激活常見于各種類型的癌癥[26,27].BPA暴露可能會通過影響NOTCH3的表達以及Raf信號通路導致神經膠質細胞發生癌變繼而引起神經膠質瘤.

圖5 不同EDCs處理下差異表達基因(DEGs)與GBM突變基因的交集

TCS暴露組中,細胞因子信號(SOCS)蛋白抑制劑是細胞因子和生長因子信號的調節劑,其異常調節與多種炎癥和腫瘤疾病有關[28].細胞因子信號抑制因子(SOCS)家族成員最為人知的是JAK/STAT途徑的信號負調節因子.該家族的一些成員,尤其是SOCS2,在神經系統中具有促進神經元分化和軸突生長等神經營養素的作用[29-30].SOCS2還可影響膠質母細胞瘤(GBM)對甲基環己氯乙亞硝脲化療敏感性的核心基因.磷酸肌醇3激酶調節亞基2(PIK3R2)是一種腫瘤驅動因子.有研究表明XLOC可以募集特異性蛋白1(Sp1)轉錄因子,并促進Sp1與PIK3R2啟動子的結合[31],從而提高PIK3R2在mRNA和蛋白水平的表達.PIK3R2介導的PI3K/ AKT信號通路的激活促進了替莫唑胺(TMZ)耐藥和膠質瘤細胞增殖[32].由此分析可知,TCS暴露可能會通過影響SOCS2的表達以及PIK3/AKT信號通路影響腦膠質瘤的發生及其預后.

TCC暴露組與GBM突變基因交集中,信號轉導和轉錄激活因子3(STAT3)是參與調節細胞生長、分化和存活的7個STAT家族成員之一.研究表明[33],膠質瘤細胞中STAT3及其下游基因,如細胞周期蛋白D1(cyc-linD1)、c-Myc、Bcl-2、Bcl-xl和VEGF等,常顯示異常表達或活性增強,從而使細胞生長失控,抑制腫瘤細胞凋亡,促進腫瘤細胞增殖,誘導腫瘤血管生成,參與腫瘤免疫逃逸.PPARG系統可以快速感知細胞壓力,并以多種抗炎和神經保護方式在神經膠質細胞、神經元和腦血管內皮細胞的中樞神經系統中發揮作用.有研究說明了PPARG的異常表達可能與GBM患者的存活時間有關[34].CDKN1A是一個細胞生長調節因子,其能降低細胞生長速度,且CDKN1A與腫瘤發生有關,有研究發現CDKN1A參與AKT介導的膠質瘤細胞的TMZ抗性[35].此外,CDKN1A可能參與GBM中的補體和凝血級聯通路[36].TCC暴露可能會通過影響STAT3、PPARG、CDKN1A等癌基因的表達導致腦膠質瘤的發生.

綜上所述,BPA、TCS、TCC三種內分泌干擾物環境暴露均在一定程度上有誘導腦膠質瘤發生的風險,但三者誘導腦膠質瘤發生的途徑和介導的信號通路不同,其中TCC的風險遠大于另外兩種污染物.

3 結語

基于多數內分泌干擾物對斑馬魚神經毒性效應與機制的研究依舊局限于個體、組織器官或功能評判層面,故本研究從分子層面上評判三種EDCs對水生生物的神經毒性效應,分析比較其作用靶標、作用途徑、致毒機理及可能誘發神經相關疾病的異同,評判其誘發神經膠質瘤的潛在風險.

1)基于轉錄組測序和生物信息學的系統分析,揭示了BPA、TCS、TCC差異基因的GO功能富集存在差異.此外,盡管三種污染物差異表達基因的KEGG通路在神經發育相關途徑均有富集,但是其作用于神經通路是不同的.

TCS富集的神經發育相關途徑主要是周圍神經系統生長分化相關的通路, 例如視黃醇代謝、抗壞血酸代謝.抗壞血酸已被證明在周圍神經系統 (PNS) 中具有重要功能.抗壞血酸可以通過形成含有膠原蛋白和層粘連蛋白的細胞外基質在體外促進髓鞘形成[37].視黃酸可以促進分化的視網膜神經節細胞和外周感覺神經元的軸突再生.在發育過程中內源性視黃酸能夠促進神經膠質和神經元分化以及體外實驗中視黃酸可以促進分化的視網膜神經節細胞和外周感覺神經元的軸突再生[38].

TCC富集的神經發育作用途徑主要是葉酸合成和ErbB信號通路,髓磷脂對于中樞和外周神經系統(PNS)中軸突快速準確地傳導電脈沖至關重要.PNS中的髓鞘發育依賴于Nrg1/ErbB受體提供的軸突信號.有證據表明,大腦中有一個最佳的NRG/ ERBB信號水平,偏離它會損害大腦功能[39]. NRGs/ERBBs和下游信號通路可能為特定的神經精神癥狀提供治療靶點.葉酸可調節神經系統中不同細胞的行為包括對神經膠質細胞產生趨化反應,誘導神經營養因子釋放,以及刺激細胞系統的神經元分化.

BPA富集于Notch信號通路、Apelin信號通路.Notch信號通路是多細胞生物進化上保守的信號通路,其已被證明可調節突觸分化和傳遞[40].有研究證明Notch信號是神經形成過程中神經周圍遷移和分化所必需的,神經周圍細胞中Notch信號的丟失會導致雪旺細胞分化失敗[41].Apelin/APJ受體系統已被證明在下丘腦調節功能中發揮作用,例如食物攝入、體液穩態、神經內分泌控制,以及心血管、胃腸運動和呼吸功能等自主神經/內臟運動信號的調控[42].

2)三種內分泌干擾物差異基因表達和富集的通路存在差異,并且TCC的差異更為顯著,可能是由于三種藥物結構不同,構效關系不同導致其作用的靶分子也不同.由于TCC分子結構中含有的脲鍵可以作為調節藥物分子理化性質的功能基團,調節分子間的氫鍵作用.而氫鍵是藥物與蛋白之間最主要的相互作用,其中脲鍵的羰基可作為氫鍵受體,-NH-既可為氫鍵供體也可為受體.故TCC中形成的氫鍵較多,所作用的靶蛋白可能較其他兩種藥物多,以及與靶蛋白作用的作用力可能強于其他兩種藥物[43].

3)通過進行Hub基因篩選,發現TCS、TCC、BPA均能直接靶向于神經相關的Hub基因誘導不同的神經毒性,也可通過Hub基因間接地與神經標志功能基因的互作而誘導神經毒性.

4)最后,我們評估了這三種內分泌干擾物引起腦膠質瘤的可能風險,BPA暴露可能會通過影響NOTCH3的表達以及Raf信號通路導致神經膠質細胞發生癌變繼而引起神經膠質瘤.TCS暴露可能會通過影響SOCS2的表達以及PIK3/AKT信號通路影響腦膠質瘤的發生及其預后.TCC暴露可能會通過影響STAT3、PPARG、CDKN1A等癌基因的表達導致腦膠質瘤的發生.

5)總而言之,這些發現使我們在分子水平上了解了三種污染物誘導神經毒性效應的靶基因不同、作用的分子機制與途徑不同,為從分子水平上評判環境內分泌干擾物的健康風險與預警提供科學依據.然而,還需要進一步的實驗來證明其如何通過Hub基因與神經標志基因的互作而誘導神經毒性,以及通過經典的通路抑制劑和激動劑的使用證明具體信號通路的介導作用.另外對于內分泌干擾物的暴露是否會增加腦膠質瘤形成的風險、易感性及其預后,以及內分泌干擾物暴露的時間和劑量與誘發風險的關系均需要進一步實驗研究來證實.

[1] 王 楊,吳國輝,錢秋慧,等.三氯生對斑馬魚發育和脂質代謝的影響[J]. 中國環境科學, 2022,(3):1394-1400.

Wang Y, Wu G G, Qian Q H, et al. Effects of triclosan environmental exposure on zebrafish development and lipid metabolism [J]. China Environmental Science, 2022,(3):1394-1400.

[2] 趙晨曦,王 楊,錢秋慧,等.三氯卡班環境暴露對斑馬魚神經行為的影響 [J]. 中國環境科學, 2022,(1):456-464.

Zhao C X, Wang Y, Qian Q H, et al. Effects of environmental exposure to triclocarban on the neurobehavior of zebrafish(Danio rerio) [J]. China Environmental Science, 2022,(1):456-464.

[3] Gomes M F, de Paula V C S, Martins L R R, et al. Sublethal effects of triclosan and triclocarban at environmental concentrations in silver catfish (Rhamdia quelen) embryos [J]. Chemosphere, 2021,263: 127985.

[4] Yun H, Liang B, Kong D, et al. Fate, risk and removal of triclocarban: A critical review [J]. Journal of hazardous materials, 2020,387: 121944.

[5] Gao C J, Kannan K. Phthalates, bisphenols, parabens, and triclocarban in feminine hygiene products from the United States and their implications for human exposure [J]. Environment international, 2020, 136:105465.

[6] 宋靜文,靳亞茹,劉紅玲.典型酚類污染物內分泌干擾效應研究—對斑馬魚發育及核受體介導基因調控的分子影響[J]. 中國環境科學, 2020,(9):4065-4076.

Song J W, Jin Y R, Liu H L. Research on the endocrine disruption effect of typical phenolic pollutants: The embryonic development effects and molecule effects of gene regulation mediated by nuclear receptor on Zebrafish [J]. China Environmental Science, 2020,(9): 4065-4076.

[7] Kim S S, Hwang K S, Yang J Y, et al. Neurochemical and behavioral analysis by acute exposure to bisphenol A in zebrafish larvae model [J]. Chemosphere, 2020,239:124751-124752.

[8] Lee J, Moon K W, Ji K. Systematic review of exposure to bisphenol A alternatives and its effects on reproduction and thyroid endocrine system in zebrafish [J]. Applied Sciences, 2021,11(4):1832-1837.

[9] Coumailleau P, Trempont S, Pellegrini E, et al. Impacts of bisphenol A analogues on zebrafish post-embryonic brain [J]. Journal of Neuroendocrinology, 2020,32(8):e12879.

[10] Qiu W, Liu S, Chen H, et al. The comparative toxicities of BPA, BPB, BPS, BPF, and BPAF on the reproductive neuroendocrine system of zebrafish embryos and its mechanisms [J]. Journal of hazardous materials, 2021,406:124300-124304.

[11] Gyimah E, Xu H, Dong X, et al. Developmental neurotoxicity of low concentrations of bisphenol A and S exposure in zebrafish [J]. Chemosphere, 2021,262:128043-128046.

[12] Buechner P, Hinderer M, Unberath P, et al. Requirements analysis and specification for a molecular tumor board platform based on cBioPortal [J]. Diagnostics, 2020,10(2):92-93.

[13] Kim J E, Lee D S, Kim T H, et al. Glutathione regulates GPx1expression during CA1neuronal death and clasmatodendrosis in the rat hippocampus following status epilepticus [J]. Antioxidants, 2022,11(4):744-756.

[14] Humphries B, Wang Z, Yang C. Rho GTPases: big players in breast cancer initiation, metastasis and therapeutic responses [J]. Cells, 2020, 9(10):2166-2167.

[15] Kalpachidou T, Spiecker L, Kress M, et al. Rho GTPases in the physiology and pathophysiology of peripheral sensory neurons [J]. Cells, 2019,8(6):591-598.

[16] Liu X, Blazejewski S M, Bennison S A, Toyo-Oka K. Glutathione S-transferase Pi (Gstp) proteins regulate neuritogenesis in the developing cerebral cortex [J]. Hum. Mol. Genet., 2021,30(1):30-45.

[17] Butturini E, Carcereri de Prati A, Mariotto S. Redox regulation of STAT1 and STAT3 signaling [J]. International Journal of Molecular Sciences, 2020,21(19):7033-7037.

[18] Tan A C, Ashley D M, López G Y, et al. Management of glioblastoma: State of the art and future directions [J]. CA: a cancer journal for clinicians, 2020,70(4):299-312.

[19] Alexander B M, Cloughesy T F. Adult glioblastoma [J]. Journal of Clinical Oncology, 2017,35(21):2402-2409.

[20] Braun J M. Early-life exposure to EDCs: Role in childhood obesity and neurodevelopment [J]. Nature Reviews Endocrinology, 2017,13(3): 161-173.

[21] Aburjania Z, Jang S, Whitt J, et al. The role of Notch3 in cancer [J]. The oncologist, 2018,23(8):900-911.

[22] Hosseini-Alghaderi S, Baron M. Notch3in development, health and disease [J]. Biomolecules, 2020,10(3):484-489.

[23] Hevia C F, Engel-Pizcueta C, Udina F, et al. The neurogenic fate of the hindbrain boundaries relies on Notch3-dependent asymmetric cell divisions [J]. Cell Reports, 2022,39(10):110915.

[24] Alqudah MA, Agarwal S, Al-Keilani MS, et al. NOTCH3is a prognostic factor that promotes glioma cell proliferation, migration and invasion via activation of CCND1and EGFR. PLoS One. 2013, 8(10):e77299

[25] An S, Yang Y, Ward R, et al. A-Raf: A new star of the family of raf kinases [J]. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology, 2015,50(6):520-531.

[26] Zhou Z W, Ambrogio C, Bera A K, et al. KRASQ61H preferentially signals through MAPK in a RAF dimer-dependent manner in non–small cell lung Cancer KRASQ61H signals in a RAF dimer- dependent manner [J]. Cancer research, 2020,80(17):3719-3731.

[27] Meng L D, Shi G D, Ge W L, et al. Linc01232 promotes the metastasis of pancreatic cancer by suppressing the ubiquitin-mediated degradation of HNRNPA2B1and activating the A-Raf-induced MAPK/ERK signaling pathway [J]. Cancer Letters, 2020,494:107- 120.

[28] Trengove M C, Ward A C. SOCS proteins in development and disease [J]. American journal of clinical and experimental immunology, 2013, 2(1):1-6.

[29] Beldi-Ferchiou A, Skouri N, Ben Ali C, et al. Abnormal repression of SHP-1, SHP-2and SOCS-1transcription sustains the activation of the JAK/STAT3 pathway and the progression of the disease in multiple myeloma [J]. PloS one, 2017,12(4):e0174835.

[30] Nguyen C H, Glüxam T, Schlerka A, et al. SOCS2is part of a highly prognostic 4-gene signature in AML and promotes disease aggressiveness [J]. Scientific Reports, 2019,9(1):1-13.

[31] Hermawan A, Putri H. Bioinformatics studies provide insight into possible target and mechanisms of action of nobiletin against cancer stem cells [J]. Asian Pacific Journal of Cancer Prevention: APJCP, 2020,21(3):611-616.

[32] Tomar V S, Patil V, Somasundaram K. Temozolomide induces activation of Wnt/β-catenin signaling in glioma cells via PI3K/Akt pathway: implications in glioma therapy [J]. Cell Biology and Toxicology, 2020,36(3):273-278.

[33] Dan L U. Anticancer mechanism of scutellarin [J]. Journal of International Oncology, 2015,42(8):682-686.

[34] Wang Q, Cai J, Fang C, et al. Mesenchymal glioblastoma constitutes a major ceRNA signature in the TGF-β pathway [J]. Theranostics, 2018,8(17):4721-4733.

[35] Ohta K, Hoshino H, Wang J, et al. Micro RNA-93 activates c-Met/PI3K/Akt pathway activity in hepatocellular carcinoma by directly inhibiting PTEN and CDKN1A [J]. Oncotarget, 2015,6(5): 3211-3217.

[36] Hu K, Li J, Wu G, et al. The novel roles of virus infection-associated gene CDKN1A in chemoresistance and immune infiltration of glioblastoma [J]. Aging (Albany NY), 2021,13(5):6662.

[37] Gess B, R?hr D, Young P. Ascorbic acid and sodium-dependent vitamin C transporters in the peripheral nervous system: from basic science to clinical trials [J]. Antioxidants & redox signaling, 2013, 19(17):2105-2114.

[38] Mey J. Retinoic acid as a regulator of cytokine signaling after nerve injury [J]. Zeitschrift für Naturforschung C, 2001,56(3/4):163-176.

[39] Ho B L, Goh Q, Nikolaou S, et al. NRG/ErbB signaling regulates neonatal muscle growth but not neuromuscular contractures in neonatal brachial plexus injury [J]. FEBS letters, 2021,595(5):655- 666.

[40] Hayashi Y, Nishimune H, Hozumi K, et al. A novel non-canonical Notch signaling regulates expression of synaptic vesicle proteins in excitatory neurons [J]. Sci Rep. 2016;6:23969.Published 2016Apr 4.

[41] Binari L A, Lewis G M, Kucenas S. Perineurial glia require Notch signaling during motor nerve development but not regeneration. J Neurosci. 2013,33(10):4241-4252.

[42] Travagli M B A. “Novel transmitters in brain stem vagal neurocircuitry: New players on the pitch [J].” American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology, 2018,315(1): G20-G26.

[43] Ghosh A K, Brindisi M. Urea derivatives in modern drug discovery and medicinal chemistry [J]. Journal of medicinal chemistry, 2019, 63(6):2751-2788.

Neurotoxicity effects of the three endocrine disruptors on zebrafish and the underlying molecular mechanisms by using the Illumina RNA-seq technique.

GUO Zi-yi1, WANG Wei-wei2, SONG Jie1, WANG Hui-li1*

(1.Suzhou University of Science and Technology, Suzhou 215009, China；2.Wenzhou Medical University, Wenzhou 325035, China)., 2023,43(2)：946～956

Triclosan (TCS), triclocarban (TCC), and bispenol A (BPA) are all proved to possess endocrine disrupting effects; however, little data are available on their neurotoxicity effects on zebrafish () and the underlying molecular mechanisms. Herein, zebrafish transcriptomic data was obtained with the aid of RNA-Seq after exposure to the aforementioned three pollutants. By means of bioinformatics analysis, nine common positively differential expression genes (DEGs) were screened in the three exposure treatments. The GO functions and KEGG pathways of nine DEGs were mainly attributable to biological process, cellular component, and molecular function, in which the number and function were different with varying chemical exposure. Notably, most of the DEGs were found to be enriched in the nerve-related pathways, but their detailed pathways were different for three chemicals. The computation of node-correlation degree of PPI network showed that the hub genes enriched in neural pathways were different in the three treatments, which had rich and indirect interaction networks with neural marker genes. By integrating DEGs with GBM mutant gene of glioblastoma in the TCGA database, we confirmed that chemical exposure induced GBM risk, but the related occurrence pathway and regulatory signaling pathway were different. Therefore, the underlying neurotoxicity mechanisms induced by the three pollutants were disclosed at the molecular level.

endocrine disruptors；zebrafish；transcriptome sequencing；neurotoxicity；glioblastoma

X171

A

1000-6923(2023)02-0946-11

郭子一(2000-),女,山東棗莊人,蘇州科技大學碩士研究生,主要從事風險評價與生態安全方面的研究.

2022-07-04

國家自然科學基金資助項目(32071617)

* 責任作者, 教授, whuili@163.com