CA-NHEJ系統對大腸桿菌鏈霉素耐藥基因rpsL的編輯效率及其耐藥性研究

謝鈺珍 覃鴻妮 吳凡 胡楊曉然 薛高旭 趙雪 張勇

摘要：以控制質粒拷貝數的pcnB基因與鏈霉素耐藥性rpsL基因為靶標基因，研究CA-NHEJ系統對大腸桿菌的基因編輯效率，及rpsL相關基因與鏈霉素耐藥性的關系。通過CA-NHEJ系統成功實現了對大腸桿菌MG1655的pcnB和rpsL基因編輯，其中，pcnB基因編輯效率達100%，rpsL基因僅有1個克隆缺失第22～24位3個氨基酸，其他4個克隆未編輯成功但具有鏈霉素抗性；進一步利用CA-HR系統敲除大腸桿菌MG1655的rpsL基因CCTGCGCTG序列（第22～24位氨基酸），編輯效率達100%，驗證了CA-HR的高效性，抗性鑒定表明，該序列是影響鏈霉素抗性的關鍵序列，是一個未曾報道的新突變；對于未編輯成功但具有鏈霉素抗性的4個克隆進行基因測序及比對，找出了rhsC和gadB等6個可能與鏈霉素抗性相關的其他基因。

關鍵詞：CA-NHEJ系統；CA-HR系統；rpsL基因；耐藥性

中圖分類號：S188? 文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2023）23-0017-05

CRISPR/Cas9系統因其具有精確識別及特異剪切DNA序列的功能而被開發成為一種高效的基因編輯技術［1-2］。CRISPER系統中的Cas9核酸酶可由sgRNA根據堿基配對定向到任何靶基因組位點，并刺激位點特異性雙鏈DNA斷裂（DBS），斷裂的DNA鏈可通過非同源末端連接（NHEJ）和同源性末端連接（HR）2種機制進行修復［3］。其中，NHEJ不僅不依賴于同源臂的設計與合成，而且能實現外源DNA片段隨機整合到不同的染色體位點，在基因編輯中顯示出顯著的優勢［4-6］。在真核生物中普遍存在非同源末端連接系統，而大部分的原核生物（如大腸桿菌）缺乏NHEJ修復［7］，僅能通過同源重組（HR）和外源引入的人工設計供體DNA來實現基因敲除，編輯不同基因除了構建CRISPR位點外，還需要構建相應的DNA修復模板，操作繁瑣，極大限制了該技術應用于基因組規模的基因編輯。現有學者借鑒真核CRISPR-Cas9基因編輯策略，將CRISPR-Cas9介導的DSB與NHEJ引發的易錯DSB修復結合起來，在大腸桿菌中開發了一種新型的不依賴于DNA修復模板的基因突變技術CA-NHEJ（CRISPR-Cas9 assisted Non-Homologous? End Joining），該技術的應用還在進一步探索當中［8］。

本研究以控制質粒拷貝數的基因pcnB和鏈霉素耐藥性相關基因rpsL為靶標，研究 CA-NHEJ系統對2個基因的編輯效率。同時，采用CA-HR系統編輯rpsL基因，并對編輯后菌株的鏈霉素耐藥性進行研究，以期為CA-NHEJ系統在大腸桿菌中的應用提供參考，同時為細菌耐藥性研究提供新思路。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與地點

MG1655菌株購于ATCC公司，所有質粒由蘇州金唯智生物科技有限公司構建；試驗用到的抗性平板、緩沖液、測序引物、TaqDNA聚合酶、大腸感受態等均由蘇州金唯智生物科技有限公司生產。試驗于2021年在蘇州金唯智生物科技有限公司開展。

1.2 試驗方法

1.2.1 sgRNA設計

利用http：//www.rgenome.net/網站設計sgRNA引物，“PAM Type”使用默認選項“spCas9 from Streptococcus pyogenes：5′-NGG-3′”，“Target Genome”選擇“Others”，“Genomes”選擇“Escherichia coli（K-12，MG1655）”，“Target Sequence”下文本框中輸入DNA序列，“crRNA length”默認“20”，設計結果出來后，選擇“Out-of-frame-Score”，得出分值最高的sgRNA序列（表1）。

1.2.2 質粒制備

本研究采用CRISPR-Cas9介導的DSB與NHEJ引發的易錯DSB修復結合（CA-NHEJ）的系統對pcnB、rpsL基因進行基因編輯。構建表達載體pCas9-Mno-Ku+Mfo-ligD質粒（kan抗性）和靶向目的基因載體sgRNA-NHEJ質粒（Spe抗性），后續采用CRISPR-Cas系統結合CA-HR系統對rpsL基因進行基因編輯，構建表達載體pCas9-Red質粒（Kan抗性）和靶向目的基因載體pTarget質粒（Spe抗性）。4個質粒結構（圖1）均交由蘇州金唯智生物科技有限公司構建，將酶切測序驗證正確的目的質粒菌液取回制備質粒。

1.2.3 CA-NHEJ系統對大腸桿菌基因編輯

將pCas9-Mno-Ku+Mfo-ligD質粒電轉至大腸桿菌電轉感受態細胞MG1655中，復蘇1 h后將菌液離心全涂布至Kan抗性的LB平板，將平板放置烘箱30 ℃培養24 h；挑單克隆并制備相應的電轉感受態細胞pMG1655；將sgRNA-NHEJ質粒電轉置感受態細胞pMG1655中，復蘇1 h后將菌液離心涂布至含Kan+Spe抗性的LB平板，30 ℃培養24 h；從Kan+Spe抗性的LB平板上挑取8～24個單克隆至含200 μL LB的96孔深孔板，將96孔深孔板置于30 ℃搖床培養16 h；通過菌落PCR及Sanger測序鑒定基因編輯情況。

1.2.4 CA-HR系統對大腸桿菌基因編輯

將pCas9-Red質粒電轉至大腸桿菌電轉感受態細胞MG1655中，復蘇1 h后將菌液離心全涂布至Kan抗性的LB平板，將平板放置烘箱30 ℃培養24 h；將pTarget質粒電轉置感受態細胞pMG1655中，復蘇 1 h 后將菌液離心涂布至含Kan+Spe抗性的LB平板，30 ℃培養24 h；從Kan+Spe抗性的LB平板上挑取8～24個單克隆至含200 μL LB 96孔深孔板，于30 ℃培養16～24 h；通過菌落PCR及Sanger測序鑒定基因編輯情況。

2 結果與分析

2.1 CA-NHEJ系統對pcnB基因的編輯

使用pCas9-Mno-Ku+Mfo-ligD和sgRNA-pcnB-NHEJ質粒，通過CA-NHEJ系統對大腸桿菌pcnB基因進行基因編輯，電轉涂布含Kan、Sep抗性平板。從生長良好的平板上挑取16個單克隆，以pcnB-F和pcnB-R為引物進行菌落PCR鑒定結果，由圖2可知，所有克隆均顯示條帶，條帶大小不一表明基因序列缺失的大小具有隨機性。將PCR產物進行Sanger測序，測序結果顯示所有克隆的pcnB均發生基因編輯，其中，15個克隆在Cas9切割位點附近發生不同長度的序列缺失，1個克隆（clone-3）在切割位點附近發生序列缺失，同時插入27 bp序列（ACTGGAAAATGTGCAGCCAAACTCGGC），基因編輯效率達100%，表明CA-NHEJ系統對大腸桿菌pcnB基因編輯效率高。

2.2 CA-NHEJ系統對rpsL基因的編輯

使用pCas9-Mno-Ku+Mfo-ligD和sgRNA-rpsL-NHEJ質粒，通過CA-NHEJ系統對大腸桿菌rpsL基因進行基因編輯，電轉化后涂布含卡那霉素、壯觀霉素、鏈霉素LB平板，烘箱過夜培養最終平板形成5個單克隆。從平板挑取這5個單克隆，以rpsL-F和rpsL-R為引物進行菌落PCR鑒定，由圖3可知，所有克隆皆顯示大小一致的條帶，將PCR產物進行Sanger測序，測序結果顯示僅有1個克隆的rpsL基因成功編輯，在Cas9切割位點附近發生 9 bp 序列（CCTGCGCTG）缺失導致rpsL蛋白缺失第22～24位氨基酸，即Pro（脯氨酸）、Ala（丙氨酸）、Leu（亮氨酸）3個氨基酸，但序列缺失未引起基因的移碼突變；另外4個克隆的rpsL基因未發生編輯，為何沒未被編輯的4個克隆具有抗性，后續進一步做測序分析（見“2.4”節）。這里的編輯效率低可能是一種假象，因為rpsL基因為大腸桿菌必需基因，基因編輯導致缺失的片段具有隨機性，編輯成功的克隆大部分致死。

2.3 CA-HR系統敲除MG1655大腸桿菌rpsL后的抗性分析

使用pCas9-Red和pTarget-rpsL質粒，通過CA-HR系統敲除MG1655大腸桿菌rpsL基因CCTGCGCTG序列（第22～24位氨基酸），涂布卡那霉素、壯觀霉素LB平板，平板克隆形態正常。從平板挑取24個單克隆，以rpsL-F和rpsL-R為引物進行菌落PCR鑒定，由圖4可知，所有克隆均顯示大小一致的條帶，進一步將PCR產物進行Sanger測序，測序結果顯示所有克隆rpsL的第22～24位氨基酸序列發生缺失，驗證了CA-HR系統的編輯效率高，而且由于編輯位置固定，不致死。

將rpsL基因編輯成功的菌液及野生型MG1655菌液分別涂布含鏈霉素抗性平板，于37 ℃培養 18 h，次日檢查，由圖5可知，涂布rpsL基因編輯菌液的平板正常形成菌落，涂布野生型MG1655菌液的平板沒有形成菌落，表明大腸桿菌rpsL缺失第 22～24位3個氨基酸會產生鏈霉素抗性。

2.4 rpsL未編輯的克隆全基因組測序分析

為探究4個rpsL基因未編輯的克隆耐受鏈霉素抗性的原因，通過二代（Hiseq）和三代（Pacbio）高通量測序平臺，將1個編輯成功的克隆和4個未編輯成功的克隆及野生型MG1655大腸桿菌進行全基因組測序，將測序結果與NCBI公布的MG1655基因組序列進行比對，分析序列差異，考慮到轉座子等可移動元件基因和鏈霉素抗性關聯度較低，部分RNA基因有序列缺失，但是缺失序列較短，本研究優先探究編碼蛋白基因和鏈霉素抗性的相關性，由測序結果（表2）可知，與NCBI公布的MG1655參考序列比對發現，野生型MG1655部分編碼蛋白基因（folD等）發生突變，由于野生型MG1655菌株沒有鏈霉素抗性，因此推測這些基因和鏈霉素抗性關聯性極低；MG1655（rpsLΔ22～24）大腸桿菌rpsL基因有 9 bp 序列缺失，與Sanger測序結果一致；rhsC、gadB、ydfK、pinQ、tfaQ、gadA基因在野生型MG1655菌株均未發生突變，但它們中的1個或多個基因在其他有鏈霉素康抗性的菌株中發生了突變，推測這些基因中可能存在與鏈霉素抗性有關的基因。

3 討論

鏈霉素是一種廣譜氨基糖苷類抗生素，通過提高核糖體和非同源tRNA親和力、干擾核糖體矯正功能，導致細菌蛋白翻譯錯誤率水平提升［9］，細菌有缺陷的突變蛋白的積累會導致細菌死亡，達到殺菌效果［10］。此外，鏈霉素還會引起氨酰-tRNA從核糖體解離，影響蛋白翻譯。rpsL基因編碼核糖體蛋白S12，該蛋白對維持翻譯水平的精確性有著極為重要的作用，已經有報道表明rpsL基因第43位氨基酸或第88位氨基酸發生突變會產生鏈霉素抗性，進一步研究發現rpsL更多的突變位點會導致鏈霉素抗性，這些突變分散在2個區域：第40～43位氨基酸和第87～93位氨基酸［11-13］。本研究使用 pCas9-Mno-Ku+Mfo-ligD和sgRNA-rpsL-NHEJ質粒，通過CA-NHEJ系統對大腸桿菌rpsL基因進行基因編輯，發現1個未有報道的新突變，rpsL缺失CCTGCGCTG（第21～23位氨基酸），即Pro（脯氨酸）、Ala（丙氨酸）、Leu（亮氨酸）3個氨基酸，該突變類型能夠產生鏈霉素抗性。同時，通過對rpsL未編輯但有抗性的4個克隆進行測序和比對，發現了6個可能與鏈霉素抗性相關的其他基因（rhsC、gadB、ydfK、pinQ、tfaQ、gadA），其作用機理有待進一步研究。

4 結論

通過CA-NHEJ系統成功實現了對大腸桿菌MG1655的pcnB和rpsL的基因編輯，其中，pcnB基因編輯效率達100%，rpsL基因僅有1個克隆rpsL缺失第22～24位3 個氨基酸，其他4個克隆未編輯成功但具有鏈霉素抗性，編輯效率低可能是因為rpsL基因為必需基因，隨機缺失導致大部分編輯成功的克隆致死；進一步利用CA-HR系統敲除大腸桿菌MG1655的rpsL基因CCTGCGCTG序列（第 22～24位氨基酸），編輯效率達100%，驗證了CA-HR的高效性，抗性鑒定結果表明該序列是影響鏈霉素抗性的關鍵序列；對于未編輯成功但具有鏈霉素抗性的4個克隆進行基因測序及比對，找出了rhsC和gadB等6個可能與鏈霉素抗性相關的其他基因，本研究對鏈霉素抗性機理，核糖體參與的蛋白翻譯機制提供新的研究思路。

參考文獻：

［1］Mans R，van Rossum H M，Wijsman M，et al. CRISPR/Cas9：a molecular Swiss army knife for simultaneous introduction of multiple genetic modifications in Saccharomyces cerevisiae［J］. FEMS Yeast Research，2015，15（2）：fov004.

［2］Ledford H. CRISPR，the disruptor［J］. Nature，2015，522（7554）：20-24.

［3］楊麗蕓，陳麗嬌，李善剛. CRISPR/Cas9系統誘導DNA斷裂的修復機制研究進展［J］. 中國細胞生物學學報，2022，44（3）：500-511.

［4］李瑞娟，趙曉雨，楊潤雨，等. 噬菌體重組酶介導的DNA同源重組工程［J］. 微生物學通報，2021，48（9）：3230-3248.

［5］嚴振鑫，徐冬一. DNA雙鏈斷裂的非同源末端連接修復［J］. 生命科學，2014，26（11）：1157-1165.[HJ2.15mm]

［6］Burma S，Chen B P C，Chen D J. Role of non-homologous end joining （NHEJ） in maintaining genomic integrity［J］. DNA Repair，2006，5（9/10）：1042-1048.

［7］Waters C A，Strande N T，Wyatt D W，et al. Nonhomologousend joining：good solution for bad ends［J］. DNA Repair，2014，17：39-51.

［8］靳海迎. 基于CRISPR-Cas9系統的谷氨酸棒狀桿菌基因組編輯技術的研究［D］. 濟南：山東大學，2017：24-62.

［9］Ruiz P，Rodríguez-Cano F，Zerolo F J，et al. Investigation of the in vitro activity of streptomycin against Mycobacterium tuberculosis［J］. Microbial Drug Resistance，2002，8（2）：147-149.

［10］陳 伊，翁瓊琳，孟繁榮. 結核分枝桿菌鏈霉素耐藥基因突變特征分析［J］. 中國熱帶醫學，2018，18（6）：534-537，542.

［11］王婉蓉，代 科，馬小雨，等. 副豬嗜血桿菌鏈霉素耐藥基因rpsL、rrs分析和關鍵位點的鑒定［J］. 中國預防獸醫學報，2018，40（11）：1061-1065.

［12］申秀麗，王兆芬，李 斌，等. 青海地區結核分枝桿菌鏈霉素耐藥基因rpsL和gidB突變特征［J］. 國際藥學研究雜志，2018，45（3）：205-210.

［13］楊彩虹，曹旭東，史靜雪，等. 結核分枝桿菌臨床分離株鏈霉素耐藥性的檢測及耐藥基因突變位點分析［J］. 石河子大學學報（自然科學版），2017，35（2）：169-175.