赤水烏骨雞PTGDS基因克隆、序列特征及組織表達分析

吳蕓 歐正淼 毆小嫚 陳粉粉 閆吉美 李盼盼

摘要：為研究赤水烏骨雞PTGDS基因的結構和功能，檢測其在赤水烏骨雞不同組織、胸肌和腿肌中的表達情況，探究PTGDS基因對赤水烏骨雞肉質性能的影響。運用RT-PCR獲得PTGDS基因CDS序列，對其氨基酸序列進行生物信息學分析，揭示其結構特征和親緣關系，同時通過qPCR檢測赤水烏骨雞PTGDS基因在同一時期不同組織中的表達特性。結果顯示，赤水烏骨雞PTGDS基因編碼區(qū)長558 bp，編碼186個氨基酸，保守性分析發(fā)現(xiàn)赤水烏骨雞PTGDS基因與原雞的同源性最高，核酸和氨基酸序列比對同源性分別為100%；系統(tǒng)進化分析發(fā)現(xiàn)，赤水烏骨雞與原雞的親緣關系最近，與黑天鵝和鴻雁的親緣關系最遠。PTGDS基因在各組織中均有表達，在腎中的表達量最高，顯著高于其他組織（P<0.05）；肌肉中腿肌的表達量高于胸肌，但差異不顯著（P>0.05）。研究結果可為進一步揭示PTGDS基因的功能和調控機制提供參考。

關鍵詞：赤水烏骨雞；PTGDS基因；生物信息學分析；組織mRNA表達

中圖分類號：S831.2? 文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2023）23-0022-06

前列腺素D合成酶（prostaglandin D synthase，PTGDS）是一種最早發(fā)現(xiàn)在人的腦脊液中大量表達的低分子量糖蛋白［1］，后來又相繼在大腦、肝臟、心臟、骨骼肌、肺、胰腺和脂肪等多種組織中檢測到PTGDS的存在。PTGDS是脂質運載蛋白超家族成員之一，是該家族中唯一具有酶功能的成員，具有前列腺素代謝和脂質轉運雙重功能，既可以合成前列腺素，又可以作為親脂性小分子的載體參與諸如視黃醇、視黃酸、膽紅素、膽綠素和類維生素A等一些小親脂性分子的運輸，還可以作為一種高度糖基化的蛋白質參與花生四稀酸的代謝，PTGDS在脂質代謝中起調節(jié)作用［2-4］。

赤水烏骨雞是貴州優(yōu)良的地方雞品種，屬于肉蛋兼用型雞，羽毛、皮膚和肌肉均呈現(xiàn)黑色，具有耐粗飼、肉質好、適應性強等特性，是優(yōu)良的育種素材。目前，對赤水烏骨雞肉質和風味方面的研究較少。本試驗以赤水烏骨雞為研究對象，通過RT-qPCR方法克隆得到PTGDS基因序列，進行生物信息學分析，同時采用qPCR檢測了PTGDS基因在不同組織和肌肉中的表達差異，為進一步探究PTGDS基因對赤水烏骨雞肉質風味相關的調控機制和雞機體上的生物學功能提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗樣品采集及總RNA提取

試驗選用的同批次孵化、體質量相近的35日齡赤水烏骨雞，由貴州竹香雞養(yǎng)殖合作社提供。所有試驗用雞均在相同飼養(yǎng)管理和營養(yǎng)水平條件下飼養(yǎng)。隨機選取10羽公雞，屠宰后采集各羽公雞的心臟、肝臟、脾臟、肺、腎臟、腿肌和胸肌7個組織樣品，將采集的組織樣品迅速置于組織RNA保存液中 4 ℃ 過夜，隨后置于-80 ℃超低溫冰箱中保存待用。采用TRIzol法提取各組織總RNA，超微量紫外分光光度計測定提取RNA的濃度和純度，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性。使用PrimeScriptTM RT試劑盒對檢測合格的RNA進行反轉錄，合成cDNA第1鏈。

1.2 主要儀器和試劑

全自動快速研磨儀（JXFSTPRP-64，上海凈信實業(yè)發(fā)展有限公司），高速冷凍離心機（TGL-16G，上海安亭科學儀器廠），多功能成像系統(tǒng)［ChemiDOC MP，伯樂生命醫(yī)學產品（上海）有限公司］，熒光定量PCR儀［CFXconnect，伯樂生命醫(yī)學產品（上海）有限公司］，微量核酸蛋白檢測儀（UVS-99，艾文思生物技術公司）；RNAiso Plus、TB Green Premix Ex TaqTM Ⅱ和PrimeScriptTM RT試劑盒，均購自寶日醫(yī)生物技術（北京）有限公司；質粒小提試劑盒、膠回收試劑盒，購自Omega Bio-Tek公司；DH5α感受態(tài)細胞、T 載體 PCR 產物克隆試劑盒，購自生工生物工程（上海）股份有限公司；RNAwait購自北京索萊寶科技有限公司。

1.3 赤水烏骨雞PTGDS基因克隆

參照GenBank原雞PTGDS基因序列（NM_204259.2），采用Primer Premier 6.0軟件設計擴增赤水烏骨雞 PTGDS基因CDS序列的特異性引物（表1），引物由生工生物工程（上海）有限公司合成。以赤水烏骨雞胸肌組織的cDNA為模板進行PCR擴增。擴增體系為：cDNA 3 μL，上、下游引物各2 μL，2×TransStar FastPfu PCR Super Mix 20 μL，ddH2O 13 μL。反應條件為：94 ℃預變性 5 min；94 ℃變性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸 1 min，共35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，10 ℃保存。擴增產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，將檢測正確的條帶切膠回收產物連接到T載體，轉化感受態(tài)細胞，挑陽性克隆提質粒送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1.4 生物信息學分析

通過使用DNAMAN 9.0軟件對測序得到的赤水烏骨雞PTGDS基因CDS區(qū)序列與原雞序列進行序列比對，采用NCBI的 BLAST在線軟件對其進行同源性搜索，將搜索得到的原雞、日本鵪鶉、雉雞、盔珠雞、艾草松雞等的PTGDS基因用MegAlign軟件進行同源和變異分析。采用MEGA 11.0軟件構建PTGDS基因的遺傳進化樹。采用STRING在線軟件（https：//string-db.org/）預測可能與PTGDS蛋白發(fā)生相互作用的蛋白。采用ProtParam 在線軟件（http：//web. expasy. org/protparam/）分析PTGDS蛋白質的理化性質。采用ProtScale（https：//web.expasy.org/protscale/）在線軟件計算PTGDS蛋白的疏水性。TMHMM在線軟件（http：//www. cbs. dtu. dk/services/TMHMM/）預測PTGDS蛋白質的跨膜結構域。采用Signal P 5.0（https：//services.healthtech.dtu.dk/service.php？SignalP-5.0）預測PTGDS蛋白的信號肽。用Phyre2（http：//www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi？id=index）和SWISS-MODEL在線軟件（https：//www.expasy.org/resources/swiss-model）分別預測分析PTGDS蛋白的二級結構和三級結構。運用Net-Phos 3.1（https：//services.healthtech.dtu.dk/service.php）預測PTGDS蛋白的磷酸化位點。用在線軟件PSORT（https：//www.genscript.com/tools/psort）進行蛋白的亞細胞定位。

1.5 赤水烏骨雞PTGDS基因在不同組織的表達分析

以赤水烏骨雞的心臟、肝臟、脾臟、肺、腎、腿肌和胸肌7種組織的cDNA為模板，GAPDH為內參，進行RT qPCR檢測目的基因表達量，并分析 PTGDS基因在各組織的表達量。RT-qPCR反應體系：TB Green Premix Ex TaqTM Ⅱ（2×）12.5 μL，模板 2.0 μL，上下游引物各1.0 μL，ddH2O 8.5 μL。RT-qPCR 的擴增條件為：95 ℃預變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s并采集熒光信號，72 ℃延伸30 s，40個循環(huán)。每個樣品3次重復，擴增反應完成后分析熔解曲線。

1.6 生物統(tǒng)計學分析

利用Excel對試驗數(shù)據(jù)進行整理，采用2-ΔΔCT 法計算 PTGDS基因相對內參基因GAPDH的表達差異量，ΔCT=CT PTGDS-CtGAPDH，ΔΔCT=Δ組織-ΔCT心臟。采用SPSS 26.0軟件對計算數(shù)據(jù)進行單因素方差分析及顯著性檢驗。用GraphPad Prism 6.0繪制圖表。結果以“平均值±標準誤”表示，P<0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 PTGDS基因CDS特征及序列比對

以cDNA為模板進行PCR擴增PTGDS基因，用1%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，結果見圖1。由圖1可知，擴增產物條帶單一，與目的片段618 bp大小一致。膠回收產物克隆轉化，菌液PCR檢測得到的片段大小與預期相符，結果見圖2。

2.2 PTGDS基因的生物信息學分析

測序獲得的赤水烏骨雞的PTGDS基因的編碼區(qū)長558 bp，編碼185個氨基酸。測序序列與原雞序列比對顯示，CDS的第105位發(fā)生A>G突變，不過編碼的氨基酸未發(fā)生改變。測序結果與NCBI發(fā)表的基因序列的氨基酸同源性比對分析結果見圖3。由圖3可知，赤水烏骨雞的PTGDS基因與原雞氨基酸序列同源性是100%，與火的同源性為973%，與雞日本鵪鶉的同源性為96.8%，雉雞、艾草松雞和盔珠雞同源性均為96.2%，與巖雷鳥、白尾雷鳥和穴小鸮的同源性分別為95.7%、95.1%和876%，與黑天鵝和鴻雁的同源性為86.5%。用鄰接（neighbor joining，NJ）法構建PTGDS蛋白的系統(tǒng)進化樹，由圖4可知，赤水烏骨雞與原雞聚為一類，與雉雞、火雞、艾草松雞、雷鳥同在一個分支。赤水烏骨雞與原雞的親緣關系最近，與黑天鵝和鴻雁的親緣關系最遠。

采用Protparam在線軟件對赤水烏骨雞PTGDS基因編碼區(qū)的氨基酸序列進行分析，預測蛋白分子式是C914H1 448N254O285S9，分子量為20 843.62 u，理論等電點為6.3，脂溶性指數(shù)為79.68，不穩(wěn)定指數(shù)為35.86，提示此蛋白為穩(wěn)定蛋白。用ExPASy的ProtScale在線軟件計算PTGDS的編碼氨基酸序列的疏水性，結果見圖5。由圖5可知，其計算結果推測該蛋白是親水性蛋白。運用TMHMM-2.0對PTGDS蛋白的跨膜區(qū)進行預測分析，結果見圖6。結果（圖6）顯示，該蛋白不屬于跨膜蛋白，無跨膜結構。使用在線軟件SignalP 5.0預測，結果見圖7，PTGDS蛋白潛在信號肽及切割位點，經分析，其存在Sec/SPI類型信號肽的概率為99.738%，說明PTGDS蛋白存在Sec信號肽，切割位點為19～20之間的LHA-QN，切割概率為 75.400%，其信號肽序列為MQATLLSILGLALLGALHA。

Phyre2在線軟件對赤水烏骨雞PTGDS蛋白的二級結構分析結果顯示，PTGDS蛋白中無規(guī)則卷曲、α-螺旋和β-折疊結構分別占20%、12%和49%。采用在線軟件SWISS-MODEL的自動建模功能預測赤水烏骨雞PTGDS蛋白的三級結構，由圖8可知，用于建立三維模型的氨基酸殘基范圍為 24～181位，模型以4orw.1.A蛋白為模板，序列同源性為43.17%。

經NetPhos 3.1 在線軟件預測PTGDS蛋白可能的磷酸化位點，結果見圖9。由圖9可知，PTGDS蛋白含有絲氨酸（ser）磷酸化位點16個，蘇氨酸（thr）磷酸化位點8個，酪氨酸（tyr）磷酸化位點7個，無N-糖基化位點。在線軟件PSORT亞細胞定位分析顯示，PTGDS蛋白主要定位于包括細胞壁的細胞外（77.8%），其他定位于細胞核（11.1%）和線粒體（11.1%）上。由圖10可知，根據(jù)STING在線軟件預測到PTGDS蛋白與APOD、PNAT3、TBXAS1、PTGES、AMH及HPGDS等共10個蛋白質之間可能存在相互作用，推測這些蛋白可能會影響PTGDS的表達水平。

2.3 赤水烏骨雞PTGDS基因在不同組織中的表達

PTGDS基因在赤水烏骨雞不同組織中的表達情況，由圖11可知，PTGDS基因在各赤水烏骨雞的心臟、肝臟、脾臟、肺、腎臟、腿肌及胸肌中均有表達。PTGDS在腎臟中的相對表達量最高，顯著高于其他各組織中的表達量（P<0.05），其次是肺，接下來分別是肝臟、心臟、脾臟和腿肌，胸肌中PTGDS的表達量最低。PTGDS在各組織中的表達量均達顯著差異（P<0.05），但在肝臟和肺中這2個組織中的表達量無顯著差異（P>0.05），胸肌和腿肌中兩者間PTGDS的表達量也無顯著差異（P>0.05）。

3 討論與結論

克隆得到的赤水烏骨雞PTGDS基因的CDS區(qū)序列經生物信息學分析，得到PTGDS基因CDS區(qū)片段長度為558 bp，編碼186個氨基酸，結果與Fujimori等從雞腦組織中提取的總RNA反轉后克隆得到的PTGDS基因部分序列［5］高度相似。與火雞的同源性為97.3%，與日本鵪鶉的同源性為968%，說明該基因在鳥類中應該是高度保守的，可能具有相似的生物學功能。穆松銀等對PTGDS基因在犏牛各組織和睪丸不同發(fā)育階段的表達檢測發(fā)現(xiàn)，PTGDS基因在犏牛睪丸、胃、肝和肺中均有表達［6］，而PTGDS基因在鼠的胰腺、心臟、骨骼、肌肉、腎臟和肺中均有檢測到［7-12］，本試驗在赤水烏骨雞的心臟、肝、脾、肺、腎和肌肉中PTGDS基因mRNA均有表達。推測可能是由于物種不同導致PTGDS基因在不同組織中的表達情況存在差異。李欣對肉雞脛骨軟骨發(fā)育不良模型中前列腺素合成相關基因的表達進行研究，提出前列腺素E2和或其他類型的前列腺素可能參與了生長板細胞增殖、分化過程［13］。肌肉收縮是一個能量的消耗過程，骨骼肌中的代謝無疑需要大量的能量，除了由提供能量速度較慢的長鏈脂肪酸的β氧化外，還有速度快速的葡萄糖氧化來供能［14］。有研究表明，采用L-PGDS處理對胰島素敏感的大鼠大腿骨骼肌細胞，可使葡萄糖轉運增加約2倍［15］。L-PGDS在機體內調節(jié)葡萄糖利用中起重要作用［15］。本試驗腿肌中的PTGDS基因表達量比胸肌中的高，可能在雞運動中腿肌需要大量的能量，PTGDS的多表達可能會增加葡萄糖的利用，為肌肉收縮提供更多的能量。Virtue等對PTGDS在棕色脂肪組織中的研究顯示，L-PGDS可以調控脂質和碳水化合物利用之間的平衡［2］。

脂肪形成是一個復雜的過程，已經證實 C/EBPs、PPARγ、SREBP-1c等許多的轉錄因子通過調節(jié)多種脂肪形成蛋白基因的表達參與調控［16-17］。前列腺素作為脂質介質參與脂肪生成的一些調節(jié)［18］。PGD2促進脂肪及其代謝產物的生成，PGD2是由L-PGDS催化PGH2轉化的，PGD2再進一步代謝得到Δ12-PGJ2，而Δ12-PGJ2是PPARγ的激動劑［19-21］。脂肪細胞的基本功能之一是以甘油三酯形式合成和儲存游離脂肪酸，脂肪細胞中PPARγ可誘導分泌脂聯(lián)素，脂聯(lián)素通過增加胰島素敏感性和脂肪酸氧化來影響脂質的攝取、脂肪組織的分化［21］。敲除L-PGDS導致脂聯(lián)素表達降低，AMPK磷酸化降低，導致脂肪生成增加，L-PGDS可能是脂肪細胞中脂聯(lián)素分泌的上游調節(jié)因子［8］。同時，將PPARγ2和L-PGDS等2個基因都敲除小鼠（DKO小鼠）皮下及腹腔內白色脂肪組織產熱基因、脂酶和蛋白標記物等的研究發(fā)現(xiàn)，皮下白色脂肪功能的維持需要L-PGDS，DKO小鼠可能更加依賴腹腔內白色脂肪組織供應脂肪進行氧化［2］，提示L-PGDS和PPARγ2可能協(xié)同調節(jié)脂質代謝。因此，結合PTGDS基因在赤水烏骨雞腿肌、胸肌上的表達，推測PTGDS基因可能參與雞肌肉和脂肪的發(fā)育及能量代謝。

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