哈茨木霉T-aloe防治小麥赤霉病潛能及發酵條件優化

龐麗 宋昊躍 王春迪 趙薛紅 安慧敏 庫園冉 王彩芳 張建夫 葛紅蓮 張福麗

摘要：對哈茨木霉T-aloe促進小麥生長和防治小麥赤霉病的潛能進行分析，并對其液體發酵條件進行優化。通過平板對峙試驗發現，T-aloe能夠抑制小麥赤霉病原菌PH-1生長，抑菌率為72.38%。通過溫室試驗發現，T-aloe可以促進小麥幼苗生長，提高小麥的抗病性。在無小麥赤霉病菌脅迫下，T-aloe提高小麥幼苗的株高、根長和葉片含水量，其中葉片含水量提高1.01倍，株高和根長分別提高16.7%和16.2%。在小麥赤霉病菌脅迫下，T-aloe提高小麥體內抗氧化酶POD和CAT活性28.17%和39.33%，同時降低了MDA和游離脯氨酸含量34.26%和25.71%。通過田間試驗發現，T-aloe對小麥赤霉病的防治效果達到了68.42%，且高于陽性對照[XCZ1.tif]霉靈。通過正交試驗發現，糖蜜-酵母膏培養基為T-aloe液體發酵產孢的最優培養基，最佳培養基條件為：培養溫度32 ℃、接種量5%、轉速 180 r/min，產孢量可達1.82×108 CFU/mL，比優化前提高64.91%。綜上所述，哈茨木霉T-aloe是1株既能促進小麥生長又能防治小麥赤霉病的優勢菌株。為了哈茨木霉T-aloe進一步商業化應用，對發酵條件進行優化，提高哈茨木霉T-aloe的產孢量，為哈茨木霉T-aloe的應用提供理論依據和奠定基礎。

關鍵詞：哈茨木霉；生物防治；小麥赤霉病；液體發酵；產孢量；培養基優化

中圖分類號：S435.121.4+5? 文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2023）23-0132-08

小麥（Triticum aestivum L.）是全球三大谷物之一，種植面積大且分面范圍最為廣泛，也是我國重要的經濟糧和儲藏糧，并在國民經濟中起著重要作用［1］。小麥赤霉病是由多種鐮刀菌引起的小麥重要病害，其中由禾谷鐮刀菌（Fusarium graminearum）引起的尤為嚴重。近年來，由于全球氣候變暖、氣溫升高，很多地方尤其是高溫、高濕地區的小麥赤霉病流行成災，危害程度不斷加深［2］。在我國，小麥赤霉病一般發生在長江中下游和淮河以南地區，這種病害一般可導致小麥產量損失10%～30%，重災時可達70%，甚至顆粒無收［3］。小麥赤霉病除造成小麥減產外，還會在小麥感病籽粒里產生多種鐮刀菌毒素，如脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（deoxynivalenol，DON）和玉米赤霉烯酮（zearalenone，ZEA）。人類和牲畜一旦誤食了含有這些毒素的小麥，就會產生一系列的中毒反應，嚴重時甚至死亡［4］。

目前，人們通常使用化學防治、生物防治和農業防治等手段防治小麥赤霉病，主要以化學防治為主。但是隨著化學農藥的過量使用，病原菌株的抗藥性不斷增強，使化學農藥防效逐漸降低［5］。近年來，生物制劑開始逐漸替代化學農藥，成為農作物病害管理的重要措施，同時解決了化學殺菌劑對其他非目標生物產生的不利影響［6］。木霉（Trichoderma spp.）作為重要的生防真菌，可以快速生長、產孢并在植物根系定殖，提高植物抵抗非生物和病原菌脅迫的能力，促進根系以及整個植株的生長發育［7］。另外，很多木霉菌也具有直接拮抗或抑制植物病原菌生長的功能。同時，由于木霉對人類、動物以及其他有益生物無不良影響，不會對自然環境產生威脅，也不會在食物鏈中積累，因此具有巨大的作為商業生防制劑的潛力［8］。

在木霉應用的過程中，生長速度、產孢量和產生的次級代謝產物都直接影響木霉的生防效率［9］。因此，在開發木霉生物制劑的過程中，必須考慮影響木霉生長和產孢的各種參數因素，如溫度、pH值、溶氧量和培養基等［10］。這些因素影響孢子萌發、菌絲生長、產孢以及木霉次級代謝產物的產量和質量［11］。目前，木霉的發酵方式主要有2種：液體發酵和固體發酵。較固體發酵而言，液體發酵被廣泛應用于木霉產孢、次級代謝產物以及多種水解酶的生產［12-13］。本研究將哈茨木霉菌株T-aloe在小麥上進行應用，分析其促進小麥生長和防治小麥赤霉病的潛能，并對T-aloe液體培養基發酵條件進行優化，以期為木霉T-aloe生防制劑開發和廣泛應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料和培養基

供試木霉菌株：哈茨木霉（T. harzianum） T-aloe，由周口師范學院微生物實驗室分離并保存，GenBank登錄號為KC753766。禾谷鐮刀菌 PH-1，由周口師范學院植物遺傳與分子育種重點實驗室羅奇博士提供。供試小麥品種為周麥36。

馬鈴薯葡萄糖培養基［14］：去皮馬鈴薯200 g/L，葡萄糖 20 g/L。綠豆培養基［20］：綠豆 60 g/L，煮沸過濾。葡萄糖發酵培養基［15］：葡萄糖20 g/L，KH2PO4? 1.2 g/L，MgSO4·H2O? 0.6 g/L，維生素B1 0.008 g/L。玉米粉-酵母膏培養基［16］：玉米粉1.01%，酵母膏0.47%，（NH4）2SO4? 0.05%，K2HPO4? 0.06%，MgSO4·7H2O? 0.05%，pH值5.79。糖蜜-酵母膏培養基［17］：糖蜜20 g/L，酵母膏 5 g/L，FeSO4·7H2O? 0.1 g/L，MgSO4·7H2O? 1.25 g/L，KH2PO4? 4.0 g/L，NaNO3? 7 g/L。

1.2 菌株活化和菌液制備

菌株活化：將-80 ℃保藏的木霉T-aloe和病原菌PH-1取出，吸取0.1 mL，用涂布器分別涂布于PDA培養基中，28 ℃恒溫培養7 d。木霉菌株 T-aloe 發酵液的制備：在平板上刮取少量已活化的木霉菌絲接種于含有PDA培養基中，28 ℃，180 r/min 搖床培養7 d。T-aloe種子液的制備：在超凈工作臺中，用4層無菌紗布將T-aloe發酵液進行過濾，過濾液即為種子液，將其放置4 ℃冰箱備用。病原菌PH-1孢子懸浮液的制備：在平板上刮取少量已活化的病原菌菌絲接種于綠豆培養基中，于28 ℃、220 r/min搖床上培養5 d。

1.3 木霉菌株T-aloe有益特性分析

1.3.1 哈茨木霉T-aloe與小麥病原禾谷鐮刀菌PH-1對峙培養 25 mL PDA培養基倒入直徑為90 mm的培養皿中，待凝固后，在PDA培養基的兩邊接種直徑為8 mm的木霉T-aloe菌餅和病原菌PH-1的菌餅，以只接種8 mm PH-1的PDA平板為對照，每組3個重復，于28 ℃恒溫培養7 d，每天觀察并測量木霉和病原菌的生長半徑并拍照記錄，計算抑菌率。

1.3.2 哈茨木霉T-aloe對小麥幼苗的促生作用 將哈茨木霉T-aloe發酵液，稀釋成孢子濃度為 1×107 CFU/mL的溶液。將小麥種子用45 ℃的溫水浸泡 3 h，然后均勻播種在花盆中，每盆20粒，在25 ℃的溫室中培養5 d后，用T-aloe發酵液灌根處理幼苗，同時對照用PDB處理，每盆30 mL。待 7 d 后測量小麥幼苗的株高、根長、根數、含水量以及小麥的葉綠素含量［18］。

1.3.3 哈茨木霉T-aloe誘導小麥抗病性生理指標的測定 試驗共設4個處理：對照組（CK）；病原菌組（F）；哈茨木霉T-aloe組（T）；哈茨木霉T-aloe加病原菌組（T+F）。挑選籽粒飽滿的小麥種子，45 ℃水浴3 h，然后將小麥種子放置在方形小盒（7 cm×7 cm）中，待小麥幼苗長至10 cm后，分別用30 mL PDB和濃度為3.1×107 CFU/mL的T-aloe 發酵液灌根處理，處理2 d后對幼苗進行病麥粒接種，接種方法參照王路瑤的方法［21］。病麥粒接種的第4、6天，對小麥幼苗的抗性酶活性及受損傷程度進行檢測，主要對POD活性、CAT活性、MDA含量和游離的脯氨酸含量進行測定，測定方法均采用李萍等的方法［19］。

1.3.4 哈茨木霉T-aloe對小麥大田赤霉病的防治效果 本試驗于2022年4月在河南省周口市周口師范學院試驗田（33°6′N，114°6′E）中進行，小區長10 m，寬 3 m，面積為30 m2。在小麥揚花初期，將清水、250 mg/L霉靈和1×107 CFU/mL哈茨木霉T-aloe發酵液分別等量均勻地噴灑在小麥麥穗部并套袋保濕，24 h后再噴灑病原菌PH-1（1×105 CFU/mL），PH-1連續噴3 d，頻率為1次/d，每次噴灑完后立即套袋保濕。其中清水為空白對照，霉靈為陽性對照。每種處理3組重復，每個重復取25個麥穗，分別在病原菌處理后的第10、20天統計小麥麥穗的發病情況，病情分級標準、病情指數和防效計算公式參考王路遙的方法［20］。

1.4 哈茨木霉T-aloe發酵條件優化

主要對不同培養基、溫度、接種量以及轉速進行篩選。

培養基：分別用PDB培養基、葡萄糖發酵培養基、玉米粉-酵母膏培養基、糖蜜-酵母膏培養基作為培養基。從4 ℃冰箱取出T-aloe種子液，用血球計數板計數，最后用無菌水將T-aloe種子液稀釋成濃度為 2×107 CFU/mL，按1%的接種量接種，每250 mL錐形瓶裝液量為100 mL，28 ℃、180 r/min培養8 d，每隔24 h進行計數，每種培養基3個重復。

溫度：設置25、28、31、34、37 ℃等5個溫度梯度。

接種量：設置2%、5%、8%、12%、15%等5個接種量。

轉速：設置120、150、180、210 r/min等4個轉速梯度。

1.5 正交試驗

前期試驗已經篩選出哈茨木霉T-aloe產孢的最適培養基為糖蜜-酵母膏培養基，在培養基確定的條件下對溫度、轉速和接種量進行3因素3水平的正交試驗，其中因素A為溫度，因素B為接種量，因素C為轉速，正交試驗設計如表1所示。

1.6 哈茨木霉T-aloe產孢量測定

用XB-K-25型血球計數板在顯微鏡下進行計數。菌懸液用蒸餾水適當稀釋后，4層紗布過濾，搖勻，取樣，加入到血球計數板內，靜置5 min，遵循“計上不計下，計左不計右”的原則，對計數池的左上、右上、左下、右下及中間進行計數。產孢量的計算公式如下：

1.7 數據分析

采用Microsoft Excel 2016進行數據分析和圖表制作。采用SPSS 25.0進行單因素方差分析。

2 結果與分析

2.1 哈茨木霉T-aloe防治小麥赤霉病的潛能分析

2.1.1 哈茨木霉T-aloe抑制了小麥病原禾谷鐮刀菌PH-1生長 哈茨木霉T-aloe與禾谷鐮刀菌PH-1對峙培養結果如圖1所示，培養后第7天，T-aloe 菌落已占據整個生存空間，覆蓋了整個病原菌落，并產生了大量的綠色孢子，T-aloe 抑制了病原菌PH-1的生長，抑制率為72.38%；同時還發現，對峙培養時，T-aloe 影響病原菌的色素分泌，這可能是因為T-aloe降低了病原菌PH-1的毒性。

2.1.2 哈茨木霉T-aloe對小麥幼苗生長的促進作用 哈茨木霉T-aloe促進了小麥幼苗的生長。T-aloe處理小麥幼苗7 d后，小麥幼苗長勢如圖 2-a 所示，株高明顯高于對照植株。另外，小麥幼苗葉部的含水量（圖2-b）、株高（圖2-e）以及根長（圖2-d）均顯著高于對照。與對照相比，葉部含水量提高1.01倍（圖2-a），株高和根長分別增加16.7%和16.2%。根部含水量（圖2-b）、葉綠素含量（圖2-c）和根數（圖2-e）與對照無明顯差異。

2.1.3 哈茨木霉T-aloe誘導了小麥幼苗抗病性提高 接種病原菌第6天，研究了哈茨木霉T-aloe對小麥幼苗抗病性提高的誘導作用（圖3）。接種病原菌第6天，T組的MDA含量與CK組無顯著差異，而T+F組的MDA含量比CK+F組低34.26%（圖3-a）。 說明小麥受到病原脅迫時， T-aloe 可以緩解膜脂過氧化造成的細胞損傷。脯氨酸是植物在逆境環境下產生的滲透調節物質。在病原菌處理的第6天，CK+F組比CK組的脯氨酸含量增加41.14%，T+F組、T組與CK組脯氨酸含量三者之間無明顯差異，但與CK+F組之間均差異顯著（P<0.05），其中T+F組脯氨酸含量比CK+F低25.71%（圖3-b）。說明在病原脅迫條件下T-aloe可以降低脯氨酸的含量，由此推測T-aloe可以保護植物使其免受病原菌的侵害。植物在逆境環境下，會產生大量的活性氧（ROS），而POD和CAT可以清除ROS，降低ROS引起的細胞損傷，提高植物的防御性。在無病原菌脅迫條件下，T組POD活性相比于CK組上升26.89%，而T組CAT活性與CK組無明顯差異。在病原菌脅迫條件下，T+F組POD和CAT活性分別比CK+F組上升28.17%和39.33%（圖3-c、圖3-d）。說明在病原菌脅迫條件下，T-aloe可以提高POD和CAT活性，清除過量的ROS，在提高小麥抗病性中起重要作用。綜上所述，哈茨木霉T-aloe可以通過清除ROS，在病原脅迫下降低膜脂過氧化來提高小麥幼苗的抗病性。

2.1.4 哈茨木霉T-aloe對小麥赤霉病的田間防治效果 與陰性對照清水和陽性對照霉靈相比，哈茨木霉T-aloe處理明顯減輕了小麥赤霉病的發生（表3、圖4）。接種病原菌后第10、20天，T-aloe處理過的小麥病情指數均低于陽性對照霉靈組，且二者之間具有顯著差異（P<0.05）。T-aloe 處理組的防效在接種病原菌后第10、20天分別為68.42%和32.65%，均高于霉靈組（分別為36.84%和17.35%），分別提高85.72%和88.18%。

2.2 哈茨木霉T-aloe發酵條件優化

2.2.1 不同培養基對哈茨木霉T-aloe產孢的影響

不同培養基對哈茨木霉T-aloe產孢的影響如圖5所示。T-aloe在4種培養基中均能產生孢子，其中以糖蜜-酵母膏培養基的產孢量最大，其次是PDB培養基、玉米粉-酵母膏培養基和葡萄糖發酵培養基。不同的培養基培養時，T-aloe最大產孢量出現的時間不同，在PDB培養基中培養96 h時產孢量最大，為8.19×107 CFU/mL（圖5-a），在糖蜜-酵母膏培養基中培養72 h時，產孢量最大，為 1.34×108 CFU/mL（圖5-d），而在葡萄糖發酵培養基和玉米粉-酵母膏培養基中培養24 h，產孢量最大，分別為9.67×104、3.83×106 CFU/mL（圖5-b、圖5-c），24 h后孢子數量呈下降趨勢。顯微鏡觀察發現部分孢子已經開始萌發產生菌絲，但是葡萄糖發酵培養基和玉米粉-酵母膏培養基卻無法誘導菌絲產生孢子，所以在72 h后產孢量基本沒有發生明顯的變化。綜合以上試驗結果，以培養時間 72 h、PDB培養基為基準，T-aloe在糖蜜-酵母膏培養基中的產孢量比PDB培養基提高109.70%；T-aloe 在葡萄糖發酵培養基、玉米粉-酵母膏培養基中的產孢量分別比PDB降低99.91%、99.45%。因此，本試驗選擇糖蜜-酵母膏作為培養基進一步研究不同溫度、接種量、轉速對哈茨木霉T-aloe產孢的影響，并于72 h分別進行取樣。

2.2.2 溫度、接種量和轉速對哈茨木霉T-aloe產孢的影響 在糖蜜-酵母膏培養基中，不同溫度對哈茨木霉T-aloe產孢量的影響如圖6-a所示。T-aloe 在不同溫度下均可生長，其產孢量隨著溫度的升高呈現先增加后降低的趨勢。其中，31 ℃時，T-aloe 的產孢量最大，可達1.747×108 CFU/mL。在糖蜜-酵母膏培養基中，不同接種量對哈茨木霉T-aloe產孢的結果如圖6-b所示，接種量對T-aloe的產孢量有顯著影響（P<0.05）。當接種量為5%時，T-aloe的產孢量最高，可達1.623×108 CFU/mL。在糖蜜-酵母膏培養基中，不同轉速對哈茨木霉T-aloe產孢量仍具有顯著性影響（P<0.05）（圖6-c），隨著轉速的增加，T-aloe的產孢量呈現先增加后降低的趨勢。當轉速為180 r/min時，T-aloe的產孢量最高，可達1.32×108 CFU/mL。總之，培養溫度31 ℃、接種量5%、轉速180 r/min是哈茨木霉發酵培養產孢的較優條件。

2.3 正交試驗優化各因素對哈茨木霉T-aloe發酵產孢的影響

由單因素試驗結果可知，溫度、接種量、轉速對哈茨木霉T-aloe的產孢量均具有顯著性影響，為篩選出T-aloe發酵的最佳培養條件，對溫度、接種量、轉速進行3因素3水平的正交試驗（表2）。正交試驗結果如表4所示，由極差R的大小可知，溫度、接種量、轉速對T-aloe產孢量的影響從大到小依次為轉速>溫度>接種量，即C>A>B，3個因素的最佳組合為A3B2C2，由此得到T-aloe最佳培養條件為：溫度32 ℃、接種量5%、轉速180 r/min。在此條件下培養哈茨木霉 T-aloe，產孢量達到1.82×108 CFU/mL，比糖蜜-酵母膏培養基（培養72 h、溫度28 ℃、接種量1%、轉速180 r/min）產孢量提高35.82%；比PDB培養基（培養72 h、溫度28 ℃、接種量1%、轉速 180 r/min）產孢量提高184.99%。

3 結論與討論

木霉是重要的植物生防菌之一，它可以通過競爭、重寄生和分泌抗生性的次級代謝產物來拮抗多種植物病原菌［21］。競爭作用是木霉的一種重要的拮抗機制，木霉在與病原微生物的對峙過程中，可以迅速生長產孢占領營養和生存空間［22］。本研究發現哈茨木霉T-aloe可以通過迅速占領空間的競爭作用來抑制小麥赤霉病菌禾谷鐮刀菌PH-1的生長，抑菌率可達72.38%（圖1）。

另外，木霉可以和植物建立共生關系，定殖在植物根系表皮細胞，刺激植物激素和防御化合物的產生，進而促進多種農作物的生長，如大豆、小麥、番茄和蘿卜等［23］。Joshi等發現，哈茨木霉可以提高辣椒和黃瓜幼苗的生長，株高、葉面積、植株干質量以及葉綠素含量均有所提高［24］。本研究中哈茨木霉T-aloe提高了小麥幼苗的株高、根長及葉片含水量（圖2），說明T-aloe可以促進小麥幼苗生長。

禾谷鐮刀菌引起的小麥赤霉病是我國重要的小麥流行性病害之一［25］。在病原菌脅迫條件下，木霉可以降低病原菌的侵染能力，提高植物的防御酶活性，進而提高植物的抗病能力［26］。植物在受到病原侵害時，會產生大量的O-2·和H2O2等活性氧（ROS）來抵御和殺死病原菌，但是過量的ROS會引發細胞的膜脂過氧化，加重植物的受損傷程度［27］。其中，MDA含量是反映細胞膜脂過氧化和細胞損傷程度的重要指標，植物受損傷程度越大，MDA含量就越高［28］。除此之外，脯氨酸的積累量也可以反映植物的受脅迫程度，脯氨酸作為主要的滲透調節物質，既可以降低細胞的酸性，也可以調節細胞的內滲透，在植物逆境脅迫下起著關鍵作用［29］。研究發現，在病原菌脅迫條件下，脯氨酸含量會升高。當施加木霉后，木霉調控脯氨酸的方式有2種。第1種是木霉先增加脯氨酸的含量，通過脯氨酸來調節細胞的內滲透，降低細胞的損傷［30］；第2種是木霉可以直接降低病原菌對植物的脅迫，從而使脯氨酸含量降低［31］。如王欣玉等的研究表明，在擬南芥中，單獨用病原菌處理的脯氨酸含量高于木霉和病原菌共同處理的脯氨酸含量［31］，本研究結果與之一致，推測哈茨木霉T-aloe可能是通過第2種方式來調控小麥幼苗內的脯氨酸含量。一些抗氧化防御酶也可以清除植物體內的O-2·和H2O2，維持氧化自由基的平衡，減輕植物的病害程度，比如過氧化物酶（POD）和過氧化氫酶（CAT）［32］。POD和CAT可以清除植物體內過量的H2O2，將H2O2轉化為H2O和O2，避免細胞受到侵害［33］。本研究表明，在病原菌PH-1的脅迫下，小麥細胞膜的受損傷程度增強，幼苗內的MDA含量以及脯氨酸含量升高，隨著病原菌脅迫時間的延長，POD和CAT活性下降，推測可能是防御酶系統遭到破壞。而先用木霉處理過的小麥，其MDA含量以及脯氨酸含量降低，POD和CAT活性升高（圖3），說明哈茨木霉T-aloe可以降低小麥細胞的膜脂過氧化，提高小麥的防御酶活性，清除過量的ROS，阻止病原菌侵害小麥幼苗，從而提高小麥的抗病能力。在本研究中，病原菌PH-1侵染的第10、20天，大田防治效果分別為68.42%、32.65%，均高于陽性對照。說明哈茨木霉T-aloe對田間小麥赤霉病的防治有明顯的作用（圖4和表3）。

哈茨木霉T-aloe作為一株既促生又抗病的優勢菌株，具有開發成商業生物菌劑的巨大潛力。為了降低生物菌劑的生產和運輸成本，研究T-aloe的液體發酵產孢條件是很有必要的。在實際應用中，木霉的孢子必須達到一定的數量，才會在競爭中發揮優勢［34］。本研究分析了培養基、溫度、接種量和轉速4個因素對T-aloe產孢的影響。液體發酵時，糖蜜、酵母膏以及其他農用廢棄原料常作為木霉發酵的原料。Lewis等發現，用發酵罐發酵木霉時，以糖蜜和酵母粉為培養基可以提高產孢量［35］。本研究發現，T-aloe產孢量最大的培養基是糖蜜-酵母膏培養基，與Lewis的研究結果［35］一致。溫度也是木霉生長繁殖的重要因素之一，木霉生長的最適溫度是20～28 ℃。溫度過高會破壞木霉胞內的酶活性，抑制木霉生長，還會使木霉中的蛋白質降解或變性，嚴重時導致木霉死亡，而溫度過低也會抑制木霉的生長［36］。由于木霉屬菌株種類較多，不同種生長的最適溫度也不盡相同。尤佳琪等發現，擬康寧木霉T-51在PDA培養基上的最大產孢溫度是20 ℃，而本研究中T-aloe的最大產孢溫度是31 ℃。接種量也是木霉發酵過程中的重要參數［37］，若接種量過大，培養基的消耗加快，造成木霉菌的營養缺乏，菌體快速進入穩定期和衰亡期，不利于發酵產物的生成；若接種量過低，則會延長菌體到達對數生長期的時間，延長發酵周期，不利于酶產物的生成［38］。洪亮等從枇杷中分離出1株內生木霉P3.9，它在液體發酵過程中的最適接種量是1.5%，而本研究中T-aloe的最適接種量為5%。溶解氧是優化次級代謝產物的重要參數，在產孢過程中起著關鍵作用［39-40］。Felse等發現，通過攪拌增加的溶氧量可以影響木霉的生長，并推斷極端攪拌條件不利于木霉菌的產孢［41］。T-aloe發酵產孢的最適轉速是180 r/min。目前，木霉的液體發酵常用于發酵各種酶及其次級代謝產物，對液體產孢條件優化的報道甚少，本研究將為木霉液體發酵產孢提供有用的實踐經驗。

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