梨萼片脫落過程中木質素生物合成與活性氧代謝的關聯分析

潘琦 王浩 齊開杰 謝智華 崔艷波 包建平 張紹鈴 陶書田

摘要：利用DPI、H2O2、DPI+H2O2對梨幼果萼筒部位進行處理，隨后對離區細胞進行觀察，此外對樣品進行液氮速凍，通過測定萼片離區木質素和活性氧代謝相關指標，研究萼片離區內的木質素生物合成過程與活性氧代謝間是否存在協同作用。結果表明，離層對DPI的抑制效果始終敏感，DPI可以通過降低過氧化氫含量來減少木質素含量，外源過氧化氫在處理的早期沒有顯著作用，而在后期可以促進離層內源過氧化氫形成，從而減緩DPI的抑制效果。皮爾森相關系數表明，萼筒離層中活性氧代謝相關指標與木質素生物合成指標呈正比例關系，特別是過氧化氫在離層中的累積可以促進細胞壁增厚。

關鍵詞：萼片脫落；活性氧代謝；木質素合成；關聯分析

中圖分類號：S661.201? 文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2023）23-0157-08

梨是我國生產上的第3大果樹，屬于薔薇科蘋果亞科梨屬植物，其栽培面積、產量、出口量均占世界第一［1］。在通常情況下，植物經過花期，萼片會自然脫落，但也存在萼片宿存的情況［2］。果實的萼片脫落與宿存是衡量梨果實外觀品質的重要特征之一，宿萼果實的殘留萼片不僅會影響外觀，造成果面粗糙，而且還與梨的石細胞含量呈明顯正相關關系，而脫萼果果面光滑整潔，石細胞含量少，口感較好［3-6］。梨果實的萼片脫落屬于器官脫落的一種表現形式，其遵循器官脫落的發生規律，都需要在脫落部位形成離區。張俊超研究發現，老芒麥種子離區細胞緊湊排列，且這些細胞木質化程度高于周圍組織細胞［7］。Lee等研究報道，植物體實際分離后，在離層的遠端形成木質化保護層，這種木質化過程受到活性氧代謝的調控［8］。其中，過氧化氫作為重要的活性氧之一，也是活性氧相互轉化的關鍵樞紐［9］。在棉花纖維次生細胞壁分化過程中，過氧化氫起到關鍵促進作用，而抑制過氧化氫的產生會延緩細胞壁的發育過程［10］。Huang等研究發現細胞木質化過程經常伴隨著活性氧的暴發，水稻根結線蟲感染過程中，可以觀察到木質素和過氧化氫二者同時大量累積［11］。在逆境條件下，活性氧同樣參與木質素合成的累積過程。例如Donnini等研究發現，缺鐵環境會導致梨根系活性氧含量增加，并引起根系的木質化［12］；銅脅迫條件下，DPI顯著抑制水稻根系中過氧化物酶的活性及減少木質素的含量，而外源H2O2處理顯著增加了根中木質素含量，證明了過氧化氫在銅脅迫條件下木質素合成中的關鍵作用［13］。同時，木質素合成需要在過氧化物酶/漆酶的作用下，將不同的木質素單體聚合而形成木質素，這個過程中過氧化物酶主要以過氧化氫作為電子接受體來發生反應［14］。Shigeto等研究報道，在擬南芥中AtPrx2、AtPrx71和AtPrx25的單一或雙重突起會減少木質素的積累而不影響植物高度［15-16］。Fagerstedt等利用RNA干擾方法證明了不同的過氧化物酶對木質素含量的不同影響［17-18］。鑒于其他文獻報道中木質化和活性氧之間的關系，本研究將在離區形成過程中，通過活性氧抑制劑處理及回補試驗，來探明萼片脫落中活性氧代謝和木質素生物合成的關聯。

1 材料與方法

1.1 材料與樣本采集

試驗材料為種植于南京農業大學梨工程技術研究中心南京湖熟種質資源圃的庫爾勒香梨，在盛花期后0、5、15、20 d，用預先準備好的蒸餾水、150 μmol/L DPI、3 mmol/L H2O2和150 μmol/L DPI+3 mmol/L H2O2溶液處理庫爾勒香梨幼果萼筒。處理方法為用無菌微量注射器吸取不同的抑制劑，從果柄處沿著維管束向萼筒部位進行注射。處理后每7 d進行取樣，并置于液氮中速凍；取樣時應選取每株中10～15個發育良好且無病害的梨幼果萼筒部位，滿足3次生物學重復。樣品裝于凍存管中并放置于-80 ℃冰箱貯藏，用于后續指標測定。

1.2 測定指標與方法

1.2.1 木質素相關指標的測定

木質素含量：參照Tao等的方法［19］采用乙酰溴法進行測定。

石細胞含量：參照Tao等的方法［19］采用冷凍-鹽酸法進行測定。

間本三酚染色：將1%間本三酚（溶于80%乙醇）和30% HCl（v/v）混合，將樣品浸泡在混合液中染色5 min，滴加NaOH中和反應，用清水洗去表面液體，利用Canon相機拍照。

木質素染色：參照劉若南的方法［20］采用番紅固綠法進行染色。

細胞壁觀察：參照張虎平的方法［21］采用透射電鏡法進行觀察。

1.2.2 活性氧相關指標測定

POD活性：采用過氧化物酶活性測定試劑盒（北京索爾比奧科技有限公司）測定。

過氧化氫含量：采用過氧化氫檢測試劑盒（南京建成生物有限公司）測定。

1.3 數據處理

數據收集采用Excel 2010，統計分析與繪圖采用GraphPad Prism 8.0，切片圖片使用ImageJ統計分析，采用SPSS 25.0軟件分析差異、相關性和方差的顯著性。

2 結果與分析

2.1 脫萼果、宿萼果品質差異比較

為了揭示脫萼性狀產生的原因，對幼果早期中脫萼果和宿萼果進行組織部位觀察。在脫萼過程中，脫萼果萼筒部位的維管束縱切直徑顯著窄于宿萼果，且脫萼果離層細胞相比于宿萼果要更早木質化（圖1）。這是由于萼筒中直徑更小的維管束更不利于運輸營養物質，導致離層細胞的營養物質供應不充足，更容易產生木質化。然而，果實內部維管束的切片結果表明，脫萼果宿萼果幼果時期的維管束直徑大小間并沒有明顯差異（圖1）。因此，離層的木質化是影響脫萼的關鍵因素，且這種木質化與幼果萼筒基部至離層的維管束的發育密切關聯。研究表明，過氧化氫可以參與棉花纖維次生細胞壁分化過程，同時抑制過氧化氫的產生會延緩細胞壁的發育過程［10］。因此筆者初步推測活性氧代謝可能與離層木質化關系密切，隨即通過田間活性氧抑制劑回補試驗來探明其中關系。

2.2 活性氧相關處理早期離區的指標變化

2.2.1 處理早期離區的木質化

對4個處理的梨果實萼筒進行縱切，并進行番紅固綠染色。研究結果表明，在脫萼發生前期，離層細胞開始木質化，DPI、DPI+H2O2處理可以明顯縮小離層細胞的木質化范圍（圖2-B、圖2-D）。然而，對離層細胞進行透射電鏡觀察，僅在DPI處理發現離層細胞的細胞壁出現增厚緩慢的現象（圖3-B）。從木質素含量的測定結果來看，DPI處理下木質素含量極顯著降低，而H2O2和DPI+H2O2處理對木質素含量沒有產生顯著影響（圖4-A）。DPI處理對木質素的抑制效果，不僅是細胞水平上抑制細胞壁增厚，同時也減少萼筒離區的木質化細胞數量（圖5）。以上結果表明，DPI抑制早期離區木質素生物合成，而過氧化氫處理在這一時期對木質素合成的影響不顯著。

2.2.2 處理早期離區的活性氧變化

內源過氧化氫含量測定結果表明，外源H2O2、DPI和DPI+H2O2處理在7 d后均沒有改變內源過氧化氫水平（圖4-B）。POD活性在DPI處理下極顯著降低，這直接導致了單體木質素聚合的過程受到顯著影響，才使得其在這個時間段木質素含量極顯著降低；而外源H2O2處理導致POD活性極顯著升高，DPI+H2O2處理導致POD活性極顯著降低，但這些變化并未改變木質素含量。這說明單體木質素聚合過程不僅僅受到POD活性的影響，還存在其他因素影響此聚合過程（圖4-C）。以上結果都說明，在萼片脫落的早期，DPI處理可以影響萼筒的活性氧代謝水平，尤其是POD活性，并影響木質素生物合成。

2.3 活性氧相關處理中期離區的指標變化

2.3.1 處理中期離區的木質化

縱切的梨果實萼

筒番紅固綠染色結果表明，在抑制劑處理后的中期，離層細胞木質化進一步加劇，DPI和DPI+H2O2處理可以明顯縮小離層細胞的木質化范圍（圖6-B、圖6-D）。離層細胞透射電鏡觀察結果表明，單獨DPI處理仍然抑制離層細胞的細胞壁增厚，H2O2和DPI+H2O2處理可以明顯增厚離層細胞壁（圖7）。細胞木質化數據統計結果表明，DPI處理可以減少木質化細胞數量和降低離層細胞細胞壁的厚度，而H2O2和DPI+H2O2處理的細胞壁厚度整體水平上與對照沒有顯著變化，說明外源過氧化氫的促進效果不夠明顯，具有一定局限性（圖8）。外源過氧化氫處理下木質素含量極顯著上升，而DPI+H2O2處理沒有顯著差異；DPI處理下木質素含量極顯著降低，同時過氧化氫含量在DPI處理下也受到極顯著抑制（圖9-A）。這是由于木質素單體的聚合需要以過氧化氫作為電子接受體，然后經由POD的催化作用，產生結構相對穩定的單體木質素。

2.3.2 處理中期離區的活性氧變化

如圖9所示，外源施加H2O2能夠間接提高內源過氧化氫水平，而DPI+H2O2處理下，則由于DPI的作用更加明顯，導致內源過氧化氫水平受到抑制， H2O2的外源促進并未對DPI的抑制作用產生顯著影響（圖9-B）。對POD活性進行測定發現DPI處理下POD活性極顯著下降，而H2O2和DPI+H2O2處理未產生顯著影響（圖9-C）。經DPI、H2O2和DPI+H2O2處理后14 d，外源過氧化氫在脫萼發生的中期開始起作用可以抵消DPI的抑制作用，但還并未有顯著效果。

2.4 活性氧相關處理后期離層的指標變化

2.4.1 處理后期離區的木質化

相對于之前2個時期，在活性氧相關處理后期，H2O2和DPI+H2O2處理可以明顯擴增離層細胞木質化范圍，DPI仍明顯縮小離層細胞的木質化范圍（圖10-A）。離層細胞透射電鏡觀察的結果表明，3個處理的離層細胞壁增厚沒有明顯差異（圖11）。細胞木質化數據統計結果表明，DPI處理可以減少木質化細胞數量但抑制效果不如前2個時期，而3種處理離層細胞的細胞壁厚度與對照沒有顯著差異（圖12）。這是因為這個時期離層細胞已經發育完全，各處理對萼筒細胞水平發育的影響已經不顯著。與染色分布結果一致，DPI處理下木質素含量極顯著降低，而H2O2和DPI+H2O2處理下木質素含量極顯著上升（圖13-A）。

2.4.2 處理后期離區的活性氧變化

隨后對內源過氧化氫水平進行了測定，發現了與前面2個時期不一樣的結果，DPI+H2O2處理下，內源過氧化氫水平極顯著提高；DPI處理降低內源過氧化氫含量，而外源H2O2處理提高內源過氧化氫含量，這與7 d和14 d結果一致（圖13-B）。POD的活性依然對于DPI的抑制效果較為敏感，當外源DPI處理21 d后，POD活性極顯著下調，而另外2種處理沒有顯著差異（圖13-C）。以上結果表明，外源過氧化氫在處理后期可以顯著促進內源過氧化氫的形成，導致木質素增加；而DPI處理對內源過氧化氫和POD活性的具有抑制作用，降低木質素含量，二者均證明了內源過氧化氫和POD活性的變化是影響木質素生物合成的關鍵。

2.5 脫萼過程中木質素生物合成和活性氧代謝的相關性分析

為了探明脫萼過程中木質素生物合成和活性氧的關聯，分別使用抑制劑處理后前中后3個時期的各項活性氧代謝和木質素合成相關指標進行相關性分析，并繪制出皮爾森相關系數相關性熱圖。由圖14可以看出， 活性氧相關處理后前期， 超氧陰離

子含量分別與細胞壁厚度（r=0.917**）和木質素含量（r=0.917**）呈極顯著正相關；活性氧相關處理后中期，木質素含量分別與過氧化氫含量（r=0.678*）和POD活性（r=0.864**）呈顯著或極顯著正相關，且染色分布范圍分別與過氧化氫含量（r=0.509）和POD活性（r=0.781**）呈正相關；活性氧相關處理后后期，染色分布分別與過氧化氫含量（r=0.632*）和POD活性（r=0.668*）呈顯著正相關，且木質素含量分別與過氧化氫含量（r=0.921**）和POD活性（r=0.920**）呈極顯著正相關，而與羥基自由基含量呈極顯著負相關（r=-0.900**）（圖14）。綜上所述，萼筒離層中中木質素生物合成和活性氧代謝整體上呈正比例關系。其中，離區過氧化氫含量和POD活性與木質素含量呈正比例關系，從而促進了離層細胞壁增厚。

3 討論與結論

本研究中，觀察到脫萼果離層維管束直徑顯著小于宿萼果，且離層細胞壁開始木質化增厚（圖1）。Ma等研究報道，更大的萼筒維管束平均面積可以為萼片提供足夠營養和水分，防止離層的形成［22］。在擬南芥花瓣脫落中，DPI可以抑制離層NADPH氧化酶活性，影響木質素單體的聚合過程，阻止花瓣脫落層中木質素的積累［8］。脫萼過程可能也受到活性氧代謝和木質素生物合成兩者的協同作用。因此，在本研究中篩選了參與活性氧代謝的抑制劑DPI來進行試驗。有研究報道，DPI可以與血紅素修復基團反應形成穩定的化合物，特異性地抑制NADPH氧化酶活性影響活性氧代謝［23］。Hoffmann等研究表明，在木質素聚合過程中，過氧化物酶可以利用H2O2催化單木酚氧化［24］。在脫萼關鍵形成時期，對梨幼果果實萼筒進行DPI、H2O2以及DPI+H2O2處理的微量注射，每次間隔5 d進行處理的抑制劑的補充注射。研究結果表明，處理后7 d，DPI處理能夠降低過氧化氫含量，減少木質素含量，而外源過氧化氫早期不影響木質素含量（圖2至圖5）。Liu等在水稻中發現外源H2O2可以增加水稻根部的木質素含量，而DPI處理可以抑制這一現象［25］。中期萼筒離層在DPI處理下，仍可以通過降低離層過氧化氫的含量，抑制木質素生物合成，而這個時期離層開始對過氧化氫促進效果敏感，可以促進內源過氧化氫合成，但不影響木質素含量（圖6至圖9）。Heng等報道已經證明多胺代謝產生的H2O2影響了梨外皮組織的木質化［26］。在處理后期，萼筒離層外源處理過氧化氫可以彌補DPI的抑制效果（圖10～圖13）。LAC啟動氧化聚合后，POD在木質素、半纖維素和擴展素之間形成剛性交聯，進而影響木質化［27］。脫萼過程中木質素生物合成和活性氧代謝之間存在顯著正相關關系，離區中過氧化氫和POD活性水平的升高可以增加離區木質化染色分布，并提高木質素的含量。

綜上結果表明，處理后全時期萼筒離層對DPI的抑制效果敏感，DPI可以抑制梨果實萼筒的細胞壁木質化，過氧化氫可以在一定程度上彌補這一抑制過程，從而促進木質素的生物合成過程。

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