薯蕷皂苷通過ERα/miR503/RANK信號通路抑制破骨細胞生成

蔣太平 關智宇 劉志倫 李成蹊 劉昭明

1.貴州中醫(yī)藥大學，貴州 貴陽 550000

2.貴州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院骨傷科，貴州 貴陽 550001

骨質(zhì)疏松癥是一種代謝性骨骼疾病，好發(fā)群體為中老年人，其特點是骨量減少、骨組織微結(jié)構(gòu)被破壞，從而導致骨組織承受載荷的能力下降，骨組織的脆性增加[1]。骨質(zhì)疏松是骨折的主要危險因素，其帶來的后果嚴重影響著中老年人的生命健康和生活質(zhì)量[2-3]。臨床上治療骨質(zhì)流失的方法較多，但多數(shù)效果不佳或存在嚴重不良反應[4-5]。因此，筆者期望從中醫(yī)藥寶庫中探尋更安全、有效的治療骨質(zhì)疏松癥的方法。

薯蕷皂苷同時廣泛存在于薯蕷科、百合科、石竹科和薔薇科等藥用植物中，前期的研究發(fā)現(xiàn)，薯蕷皂苷可能是山藥(Dioscoreae Rhizoma)、黃精(Polygonatum sibiricum Delar.ex Redoute)等補腎健脾類中藥發(fā)揮抗骨質(zhì)疏松作用的主要有效成分之一[6-7]。通過生物信息學研究顯示ER通路可能是薯蕷皂苷抗骨質(zhì)疏松作用的重要調(diào)控途徑之一，且薯蕷皂苷具有雌激素樣活性，可通過多途徑調(diào)控骨吸收和骨形成的平衡，具有良好的抗骨質(zhì)疏松作用[8-9]。

ERα/miR-503/RANK是參與破骨細胞形成和骨吸收功能的通路之一，ERα通過上調(diào)miR-503-5p的表達，靶向抑制RANK的表達，對下游的TRAP、CTSK、MMP-9等破骨標志性基因的表達產(chǎn)生調(diào)控，介導破骨細胞的分化形成和功能[10]。因此，本研究利用RANKL誘導小鼠破骨細胞前體細胞(RAW264.7)分化成破骨細胞的模型，從ERα/miR-503/RANK通路探討薯蕷皂苷抑制破骨分化的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗細胞和試劑

Raw264.7細胞(BNCC354753，北納生物)，完全DMEM培養(yǎng)基(KGM12800 S，凱基生物)，F(xiàn)BS(10099-141，Gibco)，RANKL(HY-P73388，MCE)，雌二醇(S30633，源葉生物)，薯蕷皂苷元(B21177，源葉生物)，CCK-8法細胞增殖檢測試劑盒(KGA317，凱基生物)，抗酒石酸酸性磷酸酶染色液(G1492，Solarbio)，Trizon Reagent(CW0580 S，CWBIO)，HiScript Ⅱ Q RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper)(R223-01，Vazyme)，超純RNA提取試劑盒(CW0581 M，CWBIO)，ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix(Q711-02，Vazyme)，miRNA提取試劑盒(CW0627 S，CWBIO)，miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit (by stem-loop)(MR101-02，Vazyme)，BCA蛋白定量試劑盒(BCA Protein Assay Kit)(E-BC-K318-M，Elabscience)，RIPA細胞裂解液(C1053，北京普利萊基因技術有限公司)，Rabbit Anti ERα(AF6058，Affinity，1/1000)、Rabbit Anti RANK (DF12532，Affinity，1/1000)、Mouse Anti-β-Actin (HC201，TransGen Biotech，1/2000)，HRP conjugated Goat Anti-Mouse IgG (H+L) (GB23301，Servicebio，1/2000)，HRP conjugated Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)(GB23303，Servicebio，1/2000)。

1.2 方法

1.2.1細胞培養(yǎng)與分組：雌二醇與薯蕷皂苷采用DMSO分別溶解后配置成5 μg/mL的雌激素溶液和1 μmol/L、2.5 μmol/L的薯蕷皂苷溶液。小鼠單核巨噬細胞(RAW264.7)細胞置于39 ℃干式恒溫加熱器中復蘇后，轉(zhuǎn)移至細胞培養(yǎng)瓶，待細胞密度至80%～90%時對細胞進行傳代，經(jīng)1×PBS洗兩遍、0.25%胰酶(含0.02% EDTA)消化、細胞培養(yǎng)基終止消化、6 000 r/min離心3 min處理后，再根據(jù)實驗需要進行種板。為比較薯蕷皂苷與雌激素對破骨分化的抑制作用，實驗分為4組：模型對照組、雌激素組、低劑量薯蕷皂苷組、高劑量薯蕷皂苷組，接種于含50 μg/L的RANKL完全培養(yǎng)基2 mL，處理7 d后，分別更換為含5 μg/mL雌二醇的完全培養(yǎng)基2 mL、含1 μmol/L薯蕷皂苷元的完全培養(yǎng)基2 mL與含2.5 μmol/L薯蕷皂苷元的完全培養(yǎng)基2 mL，培養(yǎng)48 h后進行后續(xù)檢測。

1.2.2CCK8細胞毒性測定：將RAW264.7細胞以5×103個/孔的密度接種于96孔板中，分為6組，每組設5副孔，細胞貼壁后加入不同濃度的薯蕷皂苷(0、0.1、1、2.5、5、10 μmol/L)進行培養(yǎng)，48 h后將待測的96孔板細胞換成相同的培養(yǎng)基，每孔100 μL，每孔加入10 μL CCK8試劑，37 ℃培養(yǎng)箱中孵育2 h后通過酶標儀在450 nm波長檢測吸光度(optical density，OD)值。通過下述公式計算細胞相對存活率：OD給藥組/OD對照組×100%。

1.2.3抗酒石酸堿性磷酸酶染色(TRAP染色)：吸除皿中的培養(yǎng)基，自然晾干后予TRAP固定液4 ℃固定60 s，水洗晾干后切片入TRAP孵育液，37 ℃溫箱避光浸染45～60 min，水洗后予甲基綠染色液染色2～3 min，水洗、晾干后鏡檢。染色后破骨細胞胞漿被染成紫紅色，細胞核被甲基綠染成綠色。每孔隨機選取5個不相鄰視野求均值，計數(shù)每組TRAP陽性多核細胞數(shù)。

1.2.4實時定量PCR[11]：根據(jù)試劑盒說明分別提取細胞microRNA和總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA后，配置成20 μL的反應體系，在熒光PCR儀[CFX ConnectTM實時，伯樂生命醫(yī)學產(chǎn)品(上海)有限公司]上按照反應條件為95 ℃預變性10 min，95 ℃反應10 s變性，58 ℃反應30 s退火，72 ℃反應30 s延伸，進行40次循環(huán)。

引物均由通用生物系統(tǒng)(安徽)有限公司合成，U6是miR-503的參考基因，β-actin是ERα、RANK、TRAP、MMP9、CTSK的參考基因，每組設3個復孔，使用2-ΔΔCt方法計算相對表達水平。引物序列見表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences of PCR

1.2.5Western blot檢測：加入RIRP細胞裂解液，12 000 r/min離心10 min，取上清；BCA蛋白測定試劑盒測定蛋白水平，95 ℃加熱5 min使蛋白變性。將樣品經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜上，加入脫脂牛奶封閉2 h；分別加入RANK抗體(1/1 000)、ERα抗體(1/1 000)和β-Actin抗體(1/2 000)，4 ℃孵育過夜；與HRP標記的山羊抗兔IgG抗體室溫孵育2 h；通過超高靈敏度化學發(fā)光成像系統(tǒng)處理印跡，進行曝光。

1.3 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)以平均值±標準差表示，所有實驗至少進行3次。統(tǒng)計分析采用SPSS 21.0軟件進行分析，數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布且方差齊性較好，多組樣本比較采用單因素方差分析(ANOVA)，采用最小顯著性差異法(LSD)-t檢驗進行組間兩兩比較，組間顯著性差異為P<0.05，以*表示。

2 結(jié)果

2.1 薯蕷皂苷在0.1～10 μmol/L濃度下對RAW264.7細胞沒有細胞毒性

培養(yǎng)48 h后，CCK-8實驗結(jié)果顯示，薯蕷皂苷的濃度為0.1～10 μmol/L時對RAW264.7細胞活性無明顯毒性作用。0.1、1、2.5、5、10 μmol/L濃度的薯蕷皂苷干預與不使用薯蕷皂苷干預比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。薯蕷皂苷在0～10 μmol/L濃度內(nèi)均未顯示出毒性作用。見圖1。根據(jù)CCK-8結(jié)果及其他參考文獻[12]，選取1 μmol/L(低劑量)和2.5 μmol/L(高劑量)進行后續(xù)實驗。

圖1 不同濃度薯蕷皂苷對RAW264.7細胞活力的影響Fig.1 Effect of different concentrations of dioscin on the viability of RAW264.7 cells

2.2 薯蕷皂苷抑制RANKL誘導的破骨細胞生成

TRAP染色結(jié)果如圖2、表2所示，各組均出現(xiàn)融合生長，胞質(zhì)染色較深，形態(tài)大的TRAP陽性多核細胞。與RANKL模型組比較，雌激素組和高劑量(2.5 μmol/L)薯蕷皂苷組陽性細胞顯著減少(P<0.05)。低劑量組(1 μmol/L)陽性細胞數(shù)目平均值雖然低于RANKL組，但差異不具有統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

圖2 各組Trap染色結(jié)果A：RANKL誘導組；B：雌激素組；C：低劑量薯蕷皂苷組；D：高劑量薯蕷皂苷組 Fig.2 Trap staining results of each groupA： RANKL-induced group; B： Estrogen group; C： Low-dose dioscin group; D： High-dose dioscin group

表2 各組TRAP染色陽性細胞計數(shù)Table 2 TRAP staining positive cell count in each group

2.3 對破骨細胞相關基因表達的影響

通過實時定量PCR檢測各組破骨標志基因的表達，結(jié)果顯示，與RANKL模型組比較，雌激素組與低、高劑量薯蕷皂苷組中MMP-9、CTSK、TRAP的基因表達均被抑制(P<0.05)。見圖3。

圖3 qPCR檢測破骨標志性基因(TRAP、CTSK和MMP-9)Fig.3 Osteoclast-specific gene expression (TRAP, CTSK, and MMP9) was analyzed with qPCR注：與RANKL組比較，*P<0.05。

2.4 對ERα/miR-503/RANK通路表達的影響

實時定量PCR結(jié)果顯示，與RANKL組相比，雌激素與薯蕷皂苷組均能不同程度的激活ERα、miR-503-5p，并抑制RANK mRNA的表達(P<0.05)。Western blot結(jié)果顯示，相較于RANKL組，ERα在雌激素組和薯蕷皂苷組的表達量均升高，RANK的表達量在雌激素組和薯蕷皂苷組均降低(P<0.05)。見圖4。以上結(jié)果說明雌激素與薯蕷皂苷對ERα/miR-503/RANK信號通路均有一定的激活作用。

圖4 A：通過qPCR檢測雌激素和不同濃度的薯蕷皂苷對破骨細胞中ERα、miR-503和RANK表達的影響；B：通過Western blot檢測各組細胞中ERα和RANK蛋白的表達量Fig.4 A：The effects of estrogen and different concentrations of dioscin on the expression of ERα, miR-503, and RANK in osteoclasts were analyzed with qPCR; B：The expression of ERα and RANK proteins in each group of cells was detected with Western blotting注：與RANKL組比較，*P<0.05。

3 討論

破骨細胞在骨骼的動態(tài)平衡中扮演著重要的角色，是負責骨吸收的主要細胞。破骨細胞的過度活化可導致骨吸收、骨流失，甚至引發(fā)骨折。因此，破骨細胞作為一個骨質(zhì)疏松癥的重要治療途徑受到大量關注。而我國傳統(tǒng)補腎健脾的中藥在臨床上對骨質(zhì)疏松癥有著大量應用，現(xiàn)代藥理學研究也顯示山藥、黃精等中藥具有良好的抗骨質(zhì)疏松作用[13-16]。薯蕷皂苷作為補腎健脾類中藥山藥、黃精的主要活性成分之一，最近的研究也顯示薯蕷皂苷可調(diào)控骨吸收和骨形成的平衡，具有良好的抗骨質(zhì)疏松作用，但其機制仍需進一步研究[6-9]。

在骨骼的發(fā)育、骨質(zhì)重塑及骨量維持中ERα/miR-503/RANK信號通路起著關鍵作用，破骨細胞表面的ERα與雌激素結(jié)合后，可通過上調(diào)miR-503-5p的表達，靶向抑制RANK的表達，對下游的TRAP、CTSK、MMP-9等破骨標志性基因的表達產(chǎn)生調(diào)控，從而抑制破骨細胞的生成，促進破骨細胞凋亡[10,17-20]。ER是目前治療骨質(zhì)疏松癥的重要靶點之一，ERα基因表達不足的小鼠及患者都會表現(xiàn)出骨質(zhì)疏松的癥狀[21-22]。而在破骨細胞生成過程中，也有許多miRNA在不同程度地表達，并調(diào)節(jié)破骨細胞的分化和功能[23-25]。RANK屬于腫瘤壞死因子超家族，分布在破骨細胞前體細胞的膜上，是介導破骨細胞生成以及破骨細胞激活和生存所必須的細胞內(nèi)信號[26-28]。

本研究發(fā)現(xiàn)，薯蕷皂苷與雌激素均能夠抑制RAW264.7細胞的破骨分化，下調(diào)RAW264.7細胞中破骨標志基因(TRAP、CTSK、MMP-9)的表達。TRAP是一種由成熟破骨細胞和融合前單核細胞表達的含鐵糖蛋白，可通過水解無機磷鹽類和磷酸醋酶來破壞細胞基質(zhì)[29-30]；CTSK基因能反映破骨細胞的功能[31]；MMP-9可以破壞細胞外基質(zhì)成分，促使破骨細胞向骨表面遷移發(fā)揮骨吸收功能[32]。而破骨相關基因的表達下調(diào)進一步證實了薯蕷皂苷對破骨分化的抑制作用。同時，薯蕷皂苷與雌激素能夠明顯上調(diào)ERα的蛋白及mRNA的表達水平，從而上調(diào)miR-503的miRNA表達水平，下調(diào)RANK的蛋白及mRNA表達。

綜上所述，薯蕷皂苷可抑制RAW264.7細胞中破骨標志基因(TRAP、CTSK、MMP-9)的表達及破骨分化，而ERα/miR-503/RANK信號通路可能是薯蕷皂苷發(fā)揮抗骨質(zhì)疏松作用的重要途徑之一。后續(xù)將對該傳導途徑進行更深入的研究，可通過動物實驗及借助相應靶向抑制劑加以驗證。