黃芪多糖通過PI3K/AKT/mTOR促進激素性骨質疏松癥大鼠成骨細胞增殖

孫文星 黃萬新 劉傳慧 陳建停

鄭州市骨科醫院綜合內外科，河南 鄭州 450015

骨質疏松癥是一種全身代謝性疾病，伴有骨丟失和與代謝異常相關的骨組織結構損傷[1]。糖皮質激素性骨質疏松癥(glucocorticoid-induced osteoporosis，GIOP)是最常見的繼發性骨質疏松癥，主要表現為成骨細胞和破骨細胞共同維持骨形成和骨吸收之間的平衡。雙膦酸鹽被認為是GIOP最常用的藥物[2]，但雙膦酸鹽類藥物也存在諸多不良反應，亟需探索更健康、更安全的治療方案。

目前，天然藥物是各種疾病的熱門研究課題。黃芪是黃芪Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bunge的干燥根，是一種用于中藥的草本植物[3]。黃芪多糖是黃芪的有效成分，具有多種藥理活性。黃芪多糖最近已被用于治療骨質疏松[4]。Li等[5]發現黃芪多糖能有效緩解去卵巢大鼠氧化應激介導的骨質疏松癥，與其調節FoxO3a/Wnt2/β-catenin通路的抑制有關。此外，黃芪多糖通過減少骨吸收和抑制破骨細胞生成對小鼠卵巢切除致骨質疏松癥小鼠的骨丟失具有保護作用[6]。

總之，黃芪多糖能夠抑制骨質疏松癥，但黃芪多糖在GIOP中的作用尚未得到明確研究。PI3K/AKT/mTOR信號通路在包括GIOP在內的多種疾病中發揮重要作用[7]。Zhang等[8]發現PI3K/AKT/mTOR信號通路調節成骨細胞的增殖、遷移和侵襲。此外，Lin等[9]發現抑制轉錄的沉默信息調節因子1激活PI3K/AKT/mTOR信號通路，進一步增強成骨細胞的自噬，從而保護成骨細胞。

本研究通過PI3K/AKT/mTOR信號通路探討黃芪多糖對GIOP的保護作用及相關機制。

1 材料與方法

1.1 試劑和主要耗材

黃芪多糖(≥98%，美國Selleck Chemicals公司)；地塞米松磷酸鈉(北京索萊寶生物工程有限公司)；DMEM(南京森博生物科技有限公司)；胎牛血清(北京索萊寶生物工程有限公司)；β-甘油磷酸鈉、骨形態發生蛋白、抗壞血酸(美國Sigma-Aldrich公司)；PI3K/AKT/mTOR通路抑制劑LY294002(美國Selleck Chemicals公司)；CCK-8試劑盒(南京建成工程技術有限公司)；酶標儀(上海美谷分子儀器有限公司)；堿性磷酸酶染色試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司)；單丹磺酰尸胺(Monodansylcadaverine，MDC)染色溶液(北京索萊寶生物工程有限公司)；熒光顯微鏡(德國Leica公司)；Rapid Gold BCA試劑盒(美國Thermo Fisher公司)；PVDF膜(美國Thermo Fisher公司)；一抗p-PI3K、p-AKT、p-mTOR、Beclin-1、p62和GAPDH以及辣根過氧化物酶標記的抗兔二抗IgG(英國Abcam公司)；增強的化學發光液、iBrightTMFL1500gel成像系統(美國Thermo Fisher公司)；DXA小動物骨密度儀(中國上海冉哲儀器設備有限公司)。

1.2 GIOP大鼠模型的建立

動物實驗按照鄭州市骨科醫院倫理委員會關于實驗動物飼養和使用的原則進行，動物倫理審查號為：ZZSGKYY20190031。將60只體重(220±25)g、6～7周齡的SD雌性大鼠隨機分為5組。PBS組大鼠正常喂養，肌肉注射PBS緩沖液(與地塞米松磷酸鈉等量)；其他組大鼠以1 mg/kg的劑量每周兩次肌肉注射地塞米松磷酸鈉，建立GIOP模型[10]，在脛骨近端測量骨礦物質密度(BMD)，以確認模型已成功建立。大鼠常規喂養8周。然后，測量骨礦物質密度。用戊巴比妥鈉(100 mg/kg)麻醉后處死大鼠，取所需組織。

1.3 含有黃芪多糖的血清制備

含有黃芪多糖的血清獲自GIOP大鼠。GIOP大鼠分為3組，分別以5、10、15 μmol/L的黃芪多糖灌胃，每天2次，連續3 d。第4天，在給藥后1 h后采集大鼠主動脈血樣(將大鼠麻醉并固定在平板上。腹部消毒，切開皮膚暴露腹主動脈。使用采血針采集動脈血。離心后收集血清，過濾，-80 ℃保存)。

1.4 成骨細胞分化

BM-MSCs獲自上海復盛實業有限公司并被誘導分化為成骨細胞。傳代后將BM-MSCs接種到96孔板中，密度為1×104/cm2。誘導培養基的成分主要包括DMEM，10-8mol/L地塞米松，20 mL/L胎牛血清，50 mmol/L β-甘油磷酸鈉、25 μL骨形態發生蛋白和50 μmol/L抗壞血酸。每4天更換一次誘導培養基。在第15天和第25天進行堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)染色以鑒定成骨細胞。培養30 d后，觀察細胞形態變化。當細胞質中出現藍色和紫色顆粒時，認為成骨細胞分化成功，取細胞進行后續研究[16]。

1.5 細胞培養和分組

成骨細胞在含有10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 mg/mL鏈霉素的DMEM培養基中培養。當融合度達到80%～90%時，將成骨細胞以4×105個細胞/孔的密度接種到96孔板中。然后對細胞進行處理，分為PBS組、模型組、黃芪多糖組、LY294002組、LY294002+黃芪多糖組。在PBS組中，PBS處理細胞作為對照。模型組細胞給予地塞米松(10-5mol/L)48 h。黃芪多糖(5、10、15 μmol/L)組在模型組細胞分別用含5、10、15 μmol/L黃芪多糖的血清培養48 h。在模型組治療的基礎上，LY294002組細胞用20 μmol/L PI3K/AKT/mTOR通路抑制劑干預48 h。LY294002+黃芪多糖組的細胞用20 μmol/L的LY294002和15 μmol/L含黃芪多糖的血清處理48 h。

動物分組：PBS組(注射PBS緩沖液)；模型組(地塞米松肌注)；LY294002組(GIOP大鼠模型腹腔注射PI3K/AKT/mTOR通路抑制劑LY294002)；黃芪多糖組(GIOP大鼠模型口服黃芪多糖20 g/kg)；LY294002+黃芪多糖組(GIOP大鼠模型肌注LY294002，黃芪多糖20 g/kg口服)。注射地塞米松磷酸鈉1 h后，LY294002組大鼠腹腔注射PI3K/AKT/mTOR通路抑制劑，劑量為5 mg/(kg·d)[11]。黃芪多糖組大鼠口服黃芪多糖，劑量為20 g/(kg·d)[12-13]；LY294002+黃芪多糖組大鼠腹腔注射PI3K/AKT/mTOR通路抑制劑，灌胃服用黃芪多糖。大鼠常規喂養并給藥8周。

1.6 CCK-8

連續干預48 h后，用0.25%胰蛋白酶消化細胞，接種至96孔板，密度為5×103/孔。24 h后，更換新的DMEM培養基(含1% FBS)，每孔加入10 μL CCK-8溶液。孵育4 h后，用酶標儀檢測450 nm處的吸光度。

1.7 通過ALP染色檢測細胞分化能力

連續干預48 h后，通過5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl Phosphate(BCIP)/Nitroblue tetrazolium chloride(NBT)ALP染色試劑盒檢測細胞分化。然后將處理過的細胞接種到96孔板中，用PBS洗滌3次并用多聚甲醛固定。再用PBS洗滌3次后，將細胞與BCIP/NBT染色液混合，避光孵育30 min。然后棄去染料溶液，用蒸餾水洗滌細胞以終止反應。細胞用核固紅染色液孵育3 min，PBS洗滌后顯微鏡下觀察反應。

1.8 MDC染色

干預48 h后，細胞用0.25%胰蛋白酶消化1 min，然后接種到6孔板中。24 h后，將裝有細胞的板放入培養箱中避光30 min。離心后，將細胞用1×洗滌緩沖液重新懸浮。然后收集90 μL細胞懸液并與10 μL MDC染色溶液在暗室中混合30 min。將細胞在800 g中離心5 min，用1×洗滌緩沖液洗滌，然后重新懸浮。將細胞懸液滴在載玻片上并密封。使用熒光顯微鏡(在355 nm和512 nm)觀察染色結果。按照常規程序將組織制成石蠟切片，固定、包埋、脫水，然后按照試劑盒說明書進行染色。

1.9 蛋白質印跡

將細胞用預冷的PBS洗滌，然后與細胞裂解液混合后在冰上完全裂解。離心后獲得蛋白質樣品(組織樣品在含有蛋白酶抑制劑的緩沖溶液中切成片，然后在液氮中研磨。離心10 min后，收集上清液用于后續實驗)。通過Rapid Gold BCA 試劑盒對蛋白質進行定量分析。在10% SDS-GAGE中分離蛋白質進行電泳，然后轉移到PVDF膜。在5%脫脂牛奶中密封1 h后，將膜與靶向p-PI3K、p-AKT、p-mTOR、Beclin-1、p62和GAPDH一抗在4 ℃過夜；TBST洗3次后，用辣根過氧化物酶標記的抗兔二抗IgG孵育1 h。然后將膜與增強的化學發光液一起孵育。使用iBrightTMFL1500gel成像系統和Image J軟件對蛋白質條帶進行灰度分析。結果顯示為目標蛋白的灰度與內參GAPDH的比值。

1.10 測量骨密度

大鼠脛骨骨密度采用DXA小動物骨密度儀測定。大鼠保持仰臥位，后肢向外旋轉。根據說明書掃描脛骨。

1.11 骨形態學分析

脛骨遠端結構通過微型CT(SkyScan 1272，Bruker，Germany)測量。分析骨小梁間距(Tb.Sp)、骨小梁數(Tb.N)、骨小梁厚度(Tb.Th)和骨表面積與骨體積比(bone surface/bone volume，BS/BV)并繪制相應圖表。具體操作按照CT操作手冊進行。

1.12 統計學分析

數據采用SPSS 23.0軟件進行分析。每個實驗一式三份進行，結果以平均值±標準差表示。采用獨立樣本t檢驗分析兩組間的差異，采用單因素方差分析結合LSD-t檢驗比較組間差異。P<0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 黃芪多糖增強成骨細胞增殖和分化能力

通過CCK-8和ALP染色法評價成骨細胞的增殖和分化能力。結果顯示，與對照組相比，其余各組細胞增殖分化能力均降低(P<0.05)。此外，黃芪多糖治療組細胞增殖分化能力較模型組增強(P<0.05)。同時，隨著黃芪多糖用量的增加，細胞的增殖分化能力也增強，15 μmol/L處理的細胞增殖分化能力最強(圖1)。

圖1 不同組別黃芪多糖增強成骨細胞增殖和分化能力Fig.1 Astragalus polysaccharide enhances the proliferation and differentiation of osteoblasts注：與PBS組比較，*P<0.05；與模型組比較，^P<0.05。

2.2 黃芪多糖激活PI3K/AKT/mTOR信號通路

為進一步探討黃芪多糖對成骨細胞的作用機制，采用Western blot檢測PI3K/AKT/mTOR信號通路相關蛋白的表達。結果顯示，與對照組相比，其他各組PI3K、AKT、mTOR蛋白表達，以及p-PI3k、p-AKT、p-mTOR蛋白表達均降低(P<0.05)。與模型組比較，黃芪多糖治療組PI3K、AKT、mTOR蛋白表達無明顯變化(P>0.05)，而p-AKT、p-mTOR表達均升高(P<0.05)。此外，15 μmol/L黃芪多糖處理組增加最為明顯(圖2)。

圖2 黃芪多糖激活PI3K/AKT/mTOR信號通路Fig.2 Astragalus polysaccharide activates PI3K/AKT/mTOR signaling pathway注：與PBS組比較，*P<0.05；與模型組比較，^P<0.05。

2.3 黃芪多糖可能挽救了PI3K/AKT/mTOR信號通路抑制劑的作用

如圖3所示，采用PI3K/AKT/mTOR信號通路抑制劑進一步探索黃芪多糖對成骨細胞的作用機制。與模型組相比，黃芪多糖處理組細胞增殖分化能力增強(P<0.05)，而LY294002組結果正好相反(P<0.05)。與LY294002組相比，LY294002+黃芪多糖處理組細胞增殖和分化能力也增強(P<0.05)，說明黃芪多糖部分逆轉了PI3K/AKT/mTOR信號通路抑制劑的作用。

圖3 黃芪多糖可能挽救了PI3K/AKT/mTOR信號通路抑制劑的作用Fig.3 Astragalus polysaccharide may rescue the effect of PI3K/AKT/mTOR signaling pathway inhibitor注：與PBS組比較，*P<0.05；與模型組比較，^P<0.05；與15 μmol/L黃芪多糖組比較，#P<0.05；與LY294002組比較，&P<0.05。

2.4 黃芪多糖誘導成骨細胞自噬

自噬是維持成骨細胞穩定狀態的機制之一，因此還研究了黃芪多糖對成骨細胞自噬體形成以及自噬相關因子Beclin-1和p62表達的影響。MDC染色和Western blot結果顯示，與模型組相比，黃芪多糖處理組陽性細胞率升高，自噬體數量增加，Beclin-1表達升高，p62表達降低(P<0.05)。同時，與模型組相比，LY294002組陽性細胞率降低，自噬體數量減少，Beclin-1表達降低，p62表達升高(P<0.05)。與LY294002組相比，LY294002+黃芪多糖處理組的Beclin-1表達更高(P<0.05)。見圖4。

圖4 黃芪多糖誘導成骨細胞自噬Fig.4 Astragalus polysaccharide induces autophagy in osteoblasts注：與PBS組比較，*P<0.05；與模型組比較，^P<0.05；與15 μmol/L黃芪多糖組比較，#P<0.05；與LY294002組比較，&P<0.05。

2.5 黃芪多糖改善GIOP大鼠的骨質疏松癥

建立GIOP大鼠模型，分析骨密度和骨形態。結果顯示，黃芪多糖處理組BMD、BS/BV、Tb.N、Tb.Th值高于模型組，Tb.Sp值低于模型組，LY294002組則相反(P<0.05)。與LY294002組相比，LY294002+黃芪多糖處理組上述指標被逆轉，BMD、BS/BV、Tb.N、Tb.Th升高，Tb.Sp降低(P<0.05)。見圖5。

圖5 黃芪多糖改善GIOP大鼠的骨質疏松癥Fig.5 Astragalus polysaccharide relieves osteoporosis in GIOP rats注：與PBS組比較，*P<0.05；與模型組比較，^P<0.05；與黃芪多糖組比較，#P<0.05；與LY294002組比較，&P<0.05。

3 討論

黃芪多糖關節腔注射治療大鼠骨關節炎可促進退變軟骨的修復。有研究發現黃芪多糖干預可以緩解小鼠軟骨損傷，抑制了膝關節組織基質金屬蛋白酶3和基質金屬蛋白酶13水平，增加了蛋白聚糖和Ⅱ型膠原表達水平[14]。首先在細胞水平上分析了黃芪多糖的功能。結果表明，隨著黃芪多糖劑量的增加，成骨細胞的增殖、分化能力和堿性磷酸酶活性均增加，表明黃芪多糖具有治療GIOP的潛力。然后分析了黃芪多糖的相關機制。一些研究報道，地塞米松通過抑制PI3K/AKT信號通路抑制成骨分化[15]。其他一些研究指出，CS-NPs通過激活mTOR/ULK1通路誘導自噬來促進成骨細胞分化[16]。本研究中，黃芪多糖處理后與PI3K/AKT/mTOR相關的磷酸化和蛋白的表達增加，說明黃芪多糖處理激活了PI3K/AKT/mTOR信號通路。此外，成骨細胞的增殖分化能力和堿性磷酸酶活性均被通路抑制劑抑制，而通路抑制劑的抑制作用被黃芪多糖部分逆轉。因此，筆者推測黃芪多糖通過激活PI3K/AKT/mTOR信號通路促進成骨細胞增殖和分化。

自噬是一種應激防御機制，通過降解受損細胞和細胞器形成自噬體來維持細胞的穩定狀態[17]。據報道，自噬促進成骨細胞的形成和晚期成骨[18]。本研究發現成骨細胞自噬被黃芪多糖促進，而被PI3K/Akt/mTOR通路抑制劑抑制。黃芪多糖治療部分逆轉了通路抑制劑對自噬的抑制作用。因此，本研究表明黃芪多糖通過激活PI3K/AKT/mTOR信號通路促進成骨細胞自噬。骨質疏松癥的主要特征是骨骼中大孔和不完整的骨骼結構，為體內實驗構建了GIOP大鼠模型。骨密度測定和顯微CT顯示黃芪多糖治療后BMD、BS/BV、Tb.N、Tb.Th值升高，Tb.Sp值降低，進一步證明黃芪多糖在GIOP中的作用。

綜上所述，黃芪多糖通過激活PI3K/Akt/mTOR信號通路、促進成骨細胞自噬、促進增殖分化、增加骨密度等對GIOP的治療具有價值。然而，該藥物的作用機制非常復雜。除了本研究中提到的機制外，黃芪多糖達到治療目的的其他機制也可能存在。因此，未來還將結合臨床病例進一步探索其他機制。