骨碎補-續斷藥對對成骨/破骨代謝的雙向調控作用及其對Hif1ɑ基因的影響

陳玄 陳娟 謝麗華 李生強 黃景文 葉云金 陳賽楠 黃小彬 葛繼榮*

1.福建省中醫藥科學院骨質疏松證候基因組學重點研究室，福建 福州350003

2.福建省中西醫結合防治骨質疏松重點實驗室，福建省中醫藥科學院及福建中醫藥大學附屬康復醫院，福建 福州 350003

近年來中醫藥治療骨質疏松癥(osteoporosis，OP)的臨床效果已得到廣泛認同和肯定。骨碎補、續斷是中醫治療OP的常用藥物之一，其中骨碎補位于OP治療最高頻次用藥前3名，續斷則位居OP藥物組方的高頻次用藥前十[1]。在治療OP的中藥復方中，骨碎補、續斷常常配伍使用，包括經典名方續骨活血湯和眾多臨床經驗方，如骨保合劑[2]、補腎強督方[3]、補腎通絡湯[4]等。筆者在前期研究中也發現，以骨碎補、續斷為君藥的課題組經驗方續苓健骨方具有改善絕經后骨質疏松(postmenopausal osteoporosis，PMOP)患者和去卵巢(ovariectomy，OVX)大鼠的骨密度、骨生物力學指標、骨組織微結構、血液鈣磷代謝的作用[5-7]。因此，骨碎補-續斷配伍治療OP具有廣泛的實踐基礎和良好的應用前景。

目前，骨碎補和續斷的粗提物已被分別開發成中藥二類新藥——強骨膠囊[8]和續斷壯骨膠囊[9]，可直接用于治療OP，但有關骨碎補-續斷藥對的療效和機制的研究仍寥寥無幾。有必要了解骨碎補-續斷藥對用于治療OP的效果如何？其療效的發揮是通過調控成骨代謝還是破骨代謝，或二者兼而有之？本研究擬通過細胞實驗分別觀察骨碎補-續斷藥對對成骨代謝和破骨代謝的調控作用，并初步探討其作用靶點和機制，為骨碎補-續斷配伍用于治療OP提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物：3月齡SPF級雄性SD大鼠40只，購自杭州醫學院。實驗動物許可證號：SCXK(浙)2019-0002。大鼠在20 ℃～25 ℃，濕度65%～70%，光照12 h/12 h的環境中飼養，給予標準鼠飼料和自由飲水。

1.1.2實驗細胞：小鼠顱頂前成骨細胞亞克隆14(MC3T3-E1 subclone14)細胞株，購自中國科學院細胞庫(貨號GNM15)；小鼠單核巨噬細胞白血病細胞(RAW264.7)，購自美國ATCC細胞庫(貨號TIB-71)。

1.1.3實驗藥物：骨碎補(黃岡金貴中藥產業發展有限公司，批號D9100102)、續斷(廈門燕來福制藥有限公司，批號180517)，購自鷺燕醫藥股份有限公司。

1.1.4試劑：DMEM高糖減血清培養基(源培生物，Cat．#L180KJ )；胎牛血清(BI公司，Cat．#04-001-1B)；β-甘油磷酸鈉、地塞米松、抗壞血酸磷酸鹽、RANKL(Cat．#R0525)、茜素紅染料(Alizarin red)等試劑購自美國Sigma公司；CCK-8 試劑盒(Abmole公司，Cat. # M4839)；TRAP/ALP染色試劑盒(日本和光純藥公司，Cat．#294-67001)；反轉錄試劑盒(Takara公司，Cat．#639505)；熒光定量PCR試劑盒(Takara公司，Cat．# DRR041 A)；引物由Takara 公司合成；Western-blot主要試劑購自碧云天公司；HIF1ɑ抗體(Abcam公司，Cat．#ab179483)。

1.1.5儀器：超微量核酸測定儀Nano2000 (Thermo Fisher公司)；熒光定量PCR儀7500 FAST(美國ABI公司)；CO2培養箱(Thermo Fisher公司)；倒置相差顯微鏡DM40000 B(Leica公司)；全波長酶標儀(ThermoFisher Scientific)；多色熒光/化學發光成像系統(美國FluorchemM公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1實驗分組及骨碎補-續斷含藥血清的制備：40只大鼠隨機分成空白含藥血清組(空白組)、骨碎補-續斷低劑量含藥血清組(低劑量組)、中劑量含藥血清組(中劑量組)、高劑量含藥血清組(高劑量組)，每組10只。骨碎補-續斷按1∶1比例配伍制成水煎劑，根據動物與人體的每千克體質量劑量折算系數折算，骨碎補-續斷的人體用藥量為0.6 g/(kg·d)，低劑量組大鼠用藥量則為6.25×0.6=3.75 g/(kg·d)，中劑量組為3.75×3=11.25 g/(kg·d)，高劑量組為3.75×6=22.5 g/(kg·d)。各組分別灌胃給藥，每天2次，連續7 d，空白組給予等量生理鹽水。末次給藥后1 h，腹腔注射戊巴比妥鈉30 mg/kg麻醉，腹主動脈采血10～15 mL。分離血清，同組動物血清合并，56 ℃水浴30 min滅活，過濾除菌，-20 ℃儲存備用。

1.2.2細胞培養：MC3T3-E1和RAW264.7細胞分別以基礎培養基(DMEM高糖培養基+10%胎牛血清)培養，隔2 d換液。取對數生長期細胞，根據分組，分別添加10%的含藥血清進行干預。

1.2.3CCK-8細胞增殖實驗：細胞以2×103cells /100 μL的密度接種于96孔培養板，每板設空白孔，每組設3個復孔。按分組加入血清，分別培養0、24、48、72、96、120 h后，每孔加入10 μL的CCK8，37 ℃孵育3 h，檢測450 nm波長處OD值。

1.2.4ALP/TRAP染色：MC3T3-E1細胞用成骨誘導劑(50 μg/mL抗壞血酸磷酸鹽，10 mmol /Lβ甘油磷酸鈉，10 nmol/L地塞米松)誘導，隔天半量換液。誘導7 d后，棄去培養基，PBS清洗，0.5 mL固定液冰上固定10 min。RAW264.7細胞用50 ng/mL的RANKL誘導破骨分化，3 d換液1次，誘導5 d后，同法固定。PBS清洗3次，加入250 μL的ALP或TRAP染色液，37 ℃避光孵育40 min，dH2O清洗3次，光鏡下觀察拍照。

1.2.5茜素紅染色：成骨誘導分化14 d，棄成骨誘導分化完全培養基，PBS清洗2次；每孔加2 mL的4%多聚甲醛溶液，固定30 min；棄多聚甲醛溶液，PBS清洗2次；每孔加入1 mL茜素紅染液染5～10 min；棄茜素紅染液，PBS清洗2次，光鏡下觀察拍照。

1.2.6系統藥理學的方法分析藥物可能作用靶點：通過中藥系統藥理學數據庫和分享平臺(TCMSP、BATMAN-TCM、TCMID等數據庫)，篩選出骨碎補-續斷藥對的生物利用度≥30%，類藥性≥0.18的有效化學成分。從PubChem、HIT、BindDB等數據庫獲取經過驗證的上述有效化學成分的靶點；并利用反向分子對接技術，利用DRAR-CPI數據庫和systemsDock在線分子對接工具預測化學成分的潛在作用靶點。從TTD數據庫和DisGeNET數據庫獲取疾病靶點數據。應用Cytoscape軟件將上述成分-靶點數據構建成成分-靶點網絡，進行優化和渲染。根據自由度等參數提取其核心成分和靶點網絡。

1.2.7實時熒光定量PCR(qRT-PCR)：TriZol法提取RNA，采用反轉錄試劑盒進行反轉錄獲得cDNA。配制如下熒光定量PCR反應體系：SYBR Premix Ex TaqTM GC 12.5 μL，引物各0. 5 μL，dH2O 9.5 μL，cDNA 2 μL。經95 ℃預變性10 s后；95 ℃ 5 s→60 ℃ 31 s，反應40個循環。引物序列見表 1，采用2-ΔΔCT法計算缺氧誘導因子(Hypoxia-inducible factor 1-alpha，Hif1ɑ)的mRNA表達水平。

表1 熒光定量PCR引物序列Table 1 Primer pairs used in real-time PCR

1.2.8免疫蛋白印跡法(Western-blot)：收集細胞，提取總蛋白。經SDS-PAGE電泳將不同分子量的蛋白分離后，濕轉法轉移到NC膜上，脫脂奶粉封閉，孵育一抗，二抗，而后ECL顯色。采用化學發光凝膠成像系統觀察并拍照后，Image-Pro Plus 圖像分析軟件分析目標條帶的灰度，并計算細胞中的HIF1ɑ和內參蛋白濃度。

1.3 統計學處理

采用SPSS 17.0軟件進行數據分析，計量資料用均數±標準差表示，多組間比較采用重復測量的方差分析，統計具有差異時再以Bonferroni 法進行組間多重比較；兩組間比較采用兩樣本t檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 骨碎補-續斷對MC3T3-E1細胞增殖和成骨分化的影響

觀察不同濃度的骨碎補-續斷含藥血清處理細胞1、2、3、4、5 d的細胞增殖倍數，發現與空白組相比，低劑量組的細胞增殖速度沒有明顯差別；而中、高劑量組細胞從第3天開始，細胞增殖速度快于空白組(P<0.05)，且隨著培養天數的增加，增殖速度進一步加快；中劑量組與高劑量組相比，二者沒有明顯差異(圖1A)。進一步觀察中劑量和高劑量的骨碎補-續斷含藥血清對細胞成骨潛能和鈣化能力的影響，中、高劑量組細胞的ALP染色和茜素紅染色程度均明顯高于空白組，中劑量組和高劑量組之間未見明顯差別(圖1B和1C)。

圖1 含藥血清對MC3T3-E1細胞的增殖(A)、ALP染色(B，40×)和茜素紅染色(C)的影響Fig.1 Effects of drug-containing serum on MC3T3-E1 cells proliferation(A), ALP staining (B，40×), and Alizarin red staining(C)

2.2 骨碎補-續斷對RAW264.7細胞增殖和破骨分化的影響

觀察不同濃度的骨碎補-續斷含藥血清處理細胞1、2、3、4、5 d的細胞增殖倍數，發現與空白組相比，低劑量組的細胞增殖速度略有降低，但差異無統計學意義；而中、高劑量組細胞從第3天開始，細胞增殖速度明顯降低(P<0.01)，且隨著培養天數的增加，細胞增殖被進一步抑制；中劑量組與高劑量組相比，二者沒有明顯差異(圖2A)。觀察RAW264.7分化為破骨細胞的能力，發現中、高劑量組細胞的TRAP染色水平明顯低于空白組，中劑量組和高劑量組之間沒有明顯差別(圖2B)。

圖2 含藥血清對RAW264.7細胞的增殖(A)和TRAP染色(B)的影響(200×)Fig.2 Effects of drug-containing serum on RAW264.7 cells proliferation(A)and TRAP staining(B)(200×)

2.3 HIF1ɑ可能是骨碎補-續斷的作用靶點之一

采用系統藥理學和分子對接技術，分析骨碎補-續斷藥對治療OP的已驗證或預測的分子靶點及相應的藥物活性成分，并通過自由度(≥5)篩選出核心作用靶點網絡。結果顯示，骨碎補和續斷分別有14和8個核心活性成分，其中甾醇(beta-sitosterol)是骨碎補和續斷共有的活性成分。活性成分的已驗證或經預測的作用靶點共有包括HIF1ɑ在內的43個。其中有8個藥物的活性成分可作用于HIF1ɑ(表2)。

表2 可能作用于Hif1ɑ基因的骨碎補-續斷活性成分Table 2 Active ingredients of the herbs that may act on Hif1ɑ gene

2.4 骨碎補-續斷對MC3T3-E1和RAW264.7細胞Hif1ɑ基因表達水平的影響

檢測中劑量骨碎補-續斷含藥血清處理的MC3T3-1和RAW264.7細胞的Hif1ɑ表達水平，發現MC3T3-1細胞中的Hif1ɑ基因的mRNA和蛋白水平均明顯升高(P<0.01)；RAW264.7細胞的Hif1ɑ基因的mRNA 水平沒有明顯改變(P>0.05)，但蛋白水平明顯提高(P<0.01)，見圖3。

圖3 含藥血清對MC3T3-E1和RAW264.7細胞的Hif1ɑ基因的mRNA和蛋白水平的影響(**P<0.01)Fig.3 Effects of drug-containing serum on mRNA and protein expression levels of Hif1ɑ gene in MC3T3-E1 and RAW264.7 cells (**P<0.01)

3 討論

雖然目前骨碎補-續斷配伍廣泛應用于中醫藥臨床治療OP，但是有關二者聯合使用的具體效果和作用機制的研究仍然十分匱乏。在改善大鼠骨折方面，將骨碎補總黃酮與續斷總皂苷1∶1配伍用藥，發現骨碎補是產生療效的主要原因，而與續斷的配伍產生了協同效應，其療效優于二者分別單獨使用的效果[10]。骨碎補、續斷、續斷與骨碎補混合水煎液(1∶1)都具有增強MC3T3-E1成骨細胞的增殖作用，并且與續斷聯合使用具有降低骨碎補對細胞的毒性作用，但骨碎補、續斷及其混合液的促成骨代謝作用研究未進一步觀察[11]。

目前國內外尚無骨碎補-續斷藥對在調控成骨和破骨代謝方面作用的研究發表。本研究結果表明，中、高劑量的骨碎補-續斷含藥血清不僅可促進MC3T3-E1細胞的增殖，還提高其成骨分化和礦化能力，促進成骨代謝；還可明顯抑制RAW264.7細胞的增殖和分化，抑制破骨代謝。

為了進一步探討骨碎補-續斷調控骨代謝的分子機制，本研究預測和驗證了藥物的可能作用靶點，其中包括HIF1ɑ。課題組前期對PMOP患者治療前后的外周血細胞進行轉錄組學檢測，發現與對照組相比，PMOP患者的HIF1ɑ的mRNA水平明顯下降，而以骨碎補-續斷為君藥的續苓建骨方治療后，HIF1ɑ的mRNA水平明顯提高[7]。此外，使用含骨碎補、續斷等藥物的補腎通絡湯[4]治療PMOP大鼠后，也同樣發現HIF1ɑ的表達水平明顯增高。提示HIF1ɑ可能是骨碎補-續斷藥對的核心作用靶點之一。

HIF1ɑ是氧分壓感傳信號通路上的一個關鍵分子，許多研究也表明，HIF1ɑ作為轉錄因子，在骨代謝調控中具有重要作用[12-13]。在骨骼發育、骨代謝動態平衡、骨再生和病理狀態等不同條件下，在成骨前體細胞或成骨細胞內增強HIF1ɑ的表達，可明顯促進骨形成[14-15]。而在骨細胞內選擇性敲除HIF1ɑ，小鼠的骨小梁體積和數量明顯減少[16]。在軟骨細胞內選擇性敲除HIF1ɑ，小鼠的軟骨內成骨能力受損，新生骨小梁的密度和厚度都降低[17]。此外，在骨細胞內選擇性敲除Fra-2基因，HIF1ɑ水平明顯提高時，除了成骨活性的增加，小鼠骨組織切片還觀察到了許多功能、形態異常的巨型破骨細胞[18]。在成骨和骨細胞內敲除PHD2基因，一種調節HIF1ɑ蛋白的穩定性的基因，細胞核內聚集的HIF1ɑ數量明顯增加，小鼠骨小梁數量和體積，成骨細胞數量及骨形成能力都明顯提升。同時，破骨細胞的數量及破骨代謝標志物的水平也明顯降低[15]。這些研究表明，HIF1ɑ既能調控骨形成，又能調控骨吸收。

骨碎補、續斷均歸肝、腎經。骨碎補能活血續傷，兼溫補腎陽。續斷則以補腎陽為主，兼活血化瘀。中醫認為，“陽化氣，陰成形”是機體能量代謝和物質轉化的一個動態變化過程，通過補陽促進“陽化氣”可以調節能量代謝[19]。另一方面，研究已證明，中藥活血化瘀的功能與其促進血管新生，提高細胞耐缺氧能力有密切關系[20]。作為缺氧應答中最為關鍵的轉錄因子，HIF1ɑ在調控細胞能量代謝、血管生成等方面具有重要作用[21]。雖然目前在骨碎補或續斷的機制研究中對于HIF1ɑ的探討極少，但已發現HIF1ɑ是其他多種活血或補陽類中藥中的重要作用靶標[22-23]。本研究初步證實了HIF1ɑ是骨碎補-續斷發揮雙向調控成骨/破骨代謝作用的重要機制之一，為骨碎補-續斷藥對應用于治療OP提供了一定的實驗和理論依據。但作用于HIF1ɑ的主要藥物活性物質是什么？藥物通過HIF1ɑ調控骨代謝的下游具體分子機制是什么?骨碎補-續斷藥對是否還有其他重要的分子靶點和機制？仍有待進一步的研究進行證實或闡明。