活性氧簇調控破骨細胞分化的研究進展

張家勝 王劍 郁婷婷

上海交通大學醫學院附屬上海兒童醫學中心遺傳分子診斷科，上海 200127

骨骼是人體運動系統最重要的組成部分。在人體整個生命周期中，骨骼通過嚴格調控舊骨吸收和新骨生成的平衡來維持骨重塑穩態。破骨細胞負責骨吸收，是控制骨重塑的關鍵細胞，對維持骨穩態平衡至關重要[1-2]。研究發現，胚胎第7天左右，紅細胞髓系祖細胞出現在卵黃囊造血島，并分化為集落刺激因子1受體(colony stimulating factor 1 receptor, CSF1R)陽性卵黃囊巨噬細胞，可作為破骨細胞的前體[3]。出生后，這些前體細胞逐漸被造血干細胞來源的單核細胞前體所取代，并相互融合，部分也與長期存活的紅細胞髓系祖細胞來源的破骨細胞合胞體反復融合，形成多核破骨細胞[4]。破骨細胞分化成熟是發揮骨吸收功能的前提，其分化過程受多種因子調控。

研究顯示，活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)是破骨細胞分化成熟過程中關鍵的細胞內信號轉導分子[5]，對破骨細胞分化具有重要的調控作用，針對ROS清除的抗氧化劑可抑制破骨細胞分化成熟[6-9]。本文就ROS調控破骨細胞分化成熟的研究進展進行綜述，以期為溶骨亢進型疾病如骨質疏松癥等提供更廣泛的治療思路。

1 破骨細胞分化過程中ROS的產生與清除

ROS是氧氣轉化為水的過程中氧化還原反應的中間產物，包括氧自由基和非自由基氧化劑。氧自由基包括超氧陰離子(·O2ˉ)和羥基(·OH)等。非自由基氧化劑包括過氧化氫(H2O2)、臭氧(O3)和高反應性脂質或碳水化合物衍生的羰基化合物等[10]。

細胞內ROS主要在線粒體和細胞膜上產生。在氧化磷酸化過程中，線粒體活性氧簇 (mitochondrial ROS, mtROS)主要通過線粒體內膜上的電子傳遞鏈產生。例如，·O2ˉ是通過線粒體呼吸鏈復合物Ⅰ的異咯秦半醌(FAD)、泛醌、復合物Ⅲ的細胞色素b566、輔酶Q等還原輔酶或輔基將單個電子轉移到氧分子上而產生的[11]。細胞膜上ROS的生成主要由煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶(reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase，NOX)介導。NOX由多個蛋白亞基組合而成，位于質膜上的亞基被激活后，磷酸化并招募胞內亞基，形成有活性的NOX復合體。激活的NOX復合體直接從煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)向游離氧分子轉移電子，生成ROS[12-13]。

在NOX家族的7個成員中，破骨細胞主要表達可生成·O2ˉ的NOX1/2和生成H2O2的NOX4[14]。核因子κB受體激活因子配體(receptor activator of NF-κB ligand, RANKL)信號募集和激活TRAF6后，可激活小GTP酶RAC1，其激活后可與NOX1的胞內亞基結合組成復合物，從而激活NOX1，短暫生成ROS[15]。NOX2的質膜亞基gp91phox對于生成ROS起重要作用，其敲除小鼠模型的骨髓源性單核巨噬細胞定向分化過程產生破骨分化缺陷表現，且可被H2O2補償[16]。Nox4敲除小鼠骨密度較高，破骨細胞數量和標志物減少[17]。利用基因敲除和敲低技術相結合的方法，研究[18]發現在促破骨細胞分化時，NOX1和NOX2之間存在靈活的代償機制，而NOX4并不參與該代償機制。最新的研究[19]發現，破骨細胞表面的髓系細胞觸發受體2 (Trem2)是調節細胞內ROS產生的另一關鍵分子，其被激活后可與受體DAP12結合，從而激活酪氨酸激酶Syk，使ROS產生增加。

細胞內抗氧化機制可清除ROS，阻止其過量積聚，從而維持細胞內ROS的穩態[20]。在抗氧化酶中，最具代表性的是超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)，它通過將·O2ˉ轉化為H2O2而降低其活性[21]。由SOD催化產生的H2O2可被過氧化物酶體和細胞漿中的過氧化氫酶(catalase，CAT)轉化為水和分子氧[22]。血紅素加氧酶-1(heme oxygenase-1，HO-1)是另一重要的抗氧化酶，其與酶解產物如膽紅素和一氧化碳等共同發揮抗氧化、抗炎作用[23-24]。HO-1的表達受抗氧化蛋白NRF2所調控。氧化應激條件下，NRF2磷酸化入核與小MAF蛋白組成異源二聚體，與抗氧化反應元件(anti-oxidant response element, ARE)結合，促進HO-1的轉錄[25-26]。

2 ROS對破骨細胞分化成熟的調控

在破骨細胞分化過程中，RANKL/核因子κB受體活化因子(receptor activator of nuclear factor-κB，RANK)信號轉導通路是調控破骨前體細胞向破骨細胞分化成熟的關鍵信號通路[27]。骨髓基質細胞和成骨細胞分泌的RANKL與破骨細胞表面RANK結合后，誘導腫瘤壞死因子受體相關因子(TNF receptor associated factors，TRAFs)的募集和激活，導致核因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB )、絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase, MAPK)、轉錄因子激活蛋白1(activator protein-1，AP-1)和AKT等多種信號級聯反應的激活。這些信號級聯反應最終促進活化T細胞核因子1(nuclear factor of activated T-cells cytoplasmic 1，NFATc1)的轉錄，進而促進破骨細胞分化和多種溶骨相關基因如ACP5、CTSK和MMP9等的表達，促使破骨細胞發生融合、細胞骨架重塑和發揮骨吸收功能[28-30]。

ROS在破骨細胞分化過程中的調控作用早在上世紀90年代就有研究。在體外培養誘導分化破骨細胞時無論直接添加H2O2還是SOD誘導產生H2O2均可促進骨吸收[31-32]。后續發現，砷誘導產生的H2O2促進破骨細胞分化的作用在較低濃度內具有劑量依賴性[33]。近期報道[34]，破骨細胞內抗氧化蛋白NRF2的缺乏增加了砷誘導的H2O2水平和p38的磷酸化。此研究揭示了H2O2濃度上升與破骨細胞內MAPK信號通路激活之間的潛在聯系。隨著ROS檢測技術的不斷進步，其在細胞內的信號調節作用不斷被闡明。研究者運用DCFH-DA熒光探針技術發現，ROS的產生隨著RANKL濃度的增加而增加[35]。隨著H2O2的加入，IκBα 和AKT以及ERK、JNK,、和p38的磷酸化程度呈劑量依賴性增加[35]。Satish Srinivasan等[36]利用電子自旋共振(electron paramagnetic resonance，EPR)捕獲技術，發現微缺氧條件下，ROS產生增加，IκBβ水平下降，破骨細胞分化增強，且可被抗氧化劑逆轉。在一項糖尿病引起骨質疏松的機制研究[37]報道中，研究者發現，體外利用高糖培養基來培養破骨細胞，可使ROS的產生增加，導致ERK、JNK和p38及IκB的磷酸化加強，并上調IKK，從而增強破骨細胞分化。綜上，隨著ROS檢測技術的進步和H2O2與高糖培養基質及微缺氧培養條件的建立，ROS通過NF-κB、MAPK和AKT等多條信號通路調控破骨細胞分化的機制逐漸被闡明[38-39]。研究[40]顯示，以上信號通路中，磷酸化酶催化位點處的半胱氨酸解離常數(pKa )較低，主要以硫醇形式存在，可被ROS進行氧化修飾從而影響該酶的催化活性。而在破骨細胞中，ROS對于多條信號通路的調控是否通過半胱氨酸的氧化修飾來實現還未有研究。

除調控破骨細胞分化外，ROS也可能參與破骨細胞凋亡調控。據報道，含氮雙膦酸唑與原兒茶酸均可下調ROS并誘導破骨細胞凋亡，而香煙煙霧提取物可激活ROS并抑制破骨細胞凋亡[41-43]。但目前ROS調控破骨細胞凋亡的分子機制還不清楚，且以上研究與激活ROS促進腫瘤細胞凋亡的研究結果[44]不一致，故ROS在破骨細胞凋亡中的調控作用及機制還有待進一步研究。

3 ROS作為溶骨性疾病治療靶點的研究進展

由于ROS可通過多條信號通路調控破骨細胞的分化成熟，故將ROS作為靶點的抗氧化劑對于溶骨性疾病的治療研究也常有報道。研究[45]發現，老年人和女性人群的血漿中，抗氧化劑的含量明顯減少。在卵巢切除小鼠中應用N-乙酰半胱氨酸(NAC)或抗壞血酸鹽等抗氧化劑可以減少雌激素下降引起的骨丟失[46]。一些回顧性隊列研究[47-50]發現，服用常見抗氧化劑如維生素C、維生素E、 NAC和硫辛酸(LA)的人群骨密度(bone mineral density，BMD)相對較高。

近年來，眾多新型抗氧化劑顯現出對破骨細胞分化成熟的靶向抑制作用，有望為骨質疏松癥等溶骨亢進型疾病提供治療新思路。根據其抗氧化作用原理不同，可將這些抗氧化劑分為兩大類，即抑制ROS產生型和促進ROS代謝型(表1)。

表1 新型抗氧化劑對于破骨細胞分化成熟的靶向調控Table 1 Targeting effects of novel antioxidants on osteoclast differentiation and maturation

抑制ROS產生型抗氧化劑包括米托蒽醌甲磺酸鹽(MitoQ)、木黃酮和葛根素和阿齊沙坦等，主要通過抑制ROS的產生，從而抑制破骨細胞分化。例如，MitoQ是一種線粒體特異性抗氧化劑，其可抑制缺氧環境下的mtROS的產生，從而通過抑制NF-κB信號通路來抑制破骨細胞分化[36]；木黃酮通過抑制NOX1的翻譯和激活來減少破骨細胞內ROS的產生從而抑制破骨細胞形成[7]；葛根素通過下調TRAF6和NOX1的表達，抑制TRAF6/ROS依賴的MAPK和NF-κB信號通路，從而抑制破骨細胞分化[8]。近期[51]發現，一種血管緊張素Ⅱ受體阻滯劑阿齊沙坦可下調NRF2的表達以抑制ROS 的產生，來抑制MAPK和NF-κB信號通路，從而抑制破骨分化。

促進ROS代謝型抗氧化劑包括姜黃素、髓過氧化物酶和白樺提取物BAG等，主要通過促進ROS代謝分解，從而抑制破骨細胞分化。例如，姜黃素可上調NRF2的表達并增強SOD和CAT活性而促進ROS的代謝，通過NF-κB/AKT信號通路來抑制NFATc1的表達，從而抑制破骨細胞分化成熟[52-54]。姜黃素環糊精包合物與金納米制劑聯用在體外證實可提高卵巢切除誘導骨質疏松模型的骨密度[55]。一期臨床試驗[56]結果表明，姜黃素可提高骨密度和減少骨吸收，對骨質疏松過程有抑制作用。姜黃素和阿侖膦酸鹽聯合治療可調節骨質疏松絕經后婦女的骨轉換標志物并提高骨密度[57]。髓過氧化物酶通過分解細胞內H2O2，抑制破骨細胞發生和骨吸收[58]。有H2O2暴露時，輔酶Q10可提高SOD和CAT酶活性及氧化應激相關蛋白的表達來加速ROS代謝，以抑制RANKL誘導的破骨細胞分化[59]。

4 小結與展望

本文總結了ROS在破骨細胞分化成熟過程中的調控作用。破骨細胞在分化過程中伴隨著ROS的產生，ROS通過調節NF-κB、MAPK和AKT信號通路，促進破骨細胞分化成熟。將ROS作為靶點的常見抗氧化劑可作為治療溶骨性疾病的全新方向。近年來，多種新型抗氧化劑特異性靶向ROS產生和代謝酶類，通過抑制ROS產生或促進ROS代謝從而抑制溶骨作用，為溶骨亢進型疾病治療藥物的研發提供了新思路。

盡管不同抗氧化劑均通過降低破骨細胞的ROS水平，從而抑制破骨細胞分化，但其所調控的信號通路卻有所不同，這其中的機理還未有研究。雖然在眾多新型抗氧化劑治療溶骨性疾病研究中的大部分仍處于基礎研究和早期臨床試驗階段，但由于靶向分子的多樣性以及調控信號通路的可選擇性，使其在精準醫療中具有巨大潛力。