四種蔬菜土壤真菌群落組成與多樣性

扈進冬，李紅梅，吳遠征，魏艷麗，李紀順

(齊魯工業大學(山東省科學院) 山東省科學院生態研究所 山東省應用微生物重點實驗室,山東 濟南 250103)

山東是蔬菜種植和生產大省，蔬菜播種面積達200萬公頃，產量達1.1 億噸[1]，設施蔬菜栽培面積保持在86.7萬公頃以上，約占全國的四分之一[2]。但連年種植模式以及不合理的施肥、用藥，耕作土壤板結、酸化、堿化、土傳病害等問題嚴重影響了作物的產量和品質。姜、大蔥、黃瓜和草莓是重要的蔬菜品種，萊蕪大姜、章丘大蔥、曲堤黃瓜還是當地特產和全國農產品地理標志產品，均存在連年栽培、土壤環境質量下降問題，制約著這些作物的健康和可持續生產。

土壤微生物是土壤生態系統的重要組成部分，其數量、種類及群落結構等與地理位置、土壤類型、作物類型、土壤肥力等密切相關，并在一定程度上反映了土壤的環境質量。真菌是微生物群落的重要組分，有些真菌具有促進土壤有機質轉化、營養元素循環、作物生長、控制作物病害等有益作用，也有些真菌會導致植物病害并影響植物產量和質量。受溫度、酸堿度、水分和養分等多種土壤環境因子的影響[3-4]，單一作物連作模式下土壤病原真菌會不斷累積，有益真菌的相對含量則不斷降低，減弱了土壤真菌群落結構的穩定性，造成土壤真菌群落生態失衡和作物產量降低[5-7]。本文選用姜和大蔥、黃瓜和草莓分別作為露地蔬菜和設施蔬菜的典型代表，通過熒光定量PCR(quantitative polymerase chain reaction，qPCR)和擴增子測序技術，檢測并分析了這些作物土壤中真菌群落組成及多樣性狀況，結合土壤理化性質測定，分析了土壤真菌群落與環境相關因子間的關系，以期闡釋不同真菌群落多樣性與蔬菜土壤環境質量關系，為土壤環境質量的改善提升提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 土壤采樣與處理

1.1.1 取樣位點概況

土壤采樣點分別位于濟南市歷城區張而鎮、萊蕪區、濟陽區曲堤鎮、章丘區。隨機選取草莓大棚樣品10個、黃瓜大棚樣品10個、大蔥種植區樣品10個、大姜種植區樣品10個，每個采樣點間隔大于1 000 m以上。

1.1.2 采樣方法與處理

土壤樣品采集時間為2021年9月中旬，使用土壤采集器采集土壤樣品，取樣時去除表層土，鉆取0～20 cm土壤，每個采樣點隨機5點取樣混合后作為1個土壤樣品，置入冰盒內低溫保存。樣品均勻混合后過20目細篩去除石塊和植物殘體，-80 ℃保存備用。剩余土壤(約200 g)置于室內自然風干，用于土壤理化性質測定，包括：pH、電導率、全氮(TN)、堿解氮(AN)、速效磷(RP)、速效鉀(RK)測定。

每個土樣準確稱取0.3 g冷凍土壤，使用DNeasy PowerSoil Kit (QIAGEN, USA)土壤微生物DNA提取試劑盒提取土壤基因組DNA，0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA提取質量后-20 ℃保存。

1.2 實時熒光定量 PCR

以土壤基因組 DNA 為模板，采用引物 ITS1F (5′- CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA -3′)和 ITS2R(5′- GCTGCGTTCTTCATCGATGC -3′ )[8]進行實時qPCR，測定土壤真菌 ITS 序列拷貝數。以含有釀酒酵母的18SrRNA基因的質粒的10倍稀釋液產生標準曲線(基因拷貝數范圍從3.0×103到3.0×107)。采用三步方案進行qPCR反應：在95 ℃ 10 min； 95 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共40個循環反應；循環結束后，樣品加熱到95 ℃，立刻降至60 ℃保持5 s，每5 s提高0.5 ℃遞增到95 ℃，建立熔解曲線。qPCR反應體系(20 μL)包括10 μL 2×SG Fast qPCR Master Mix預混液(生工生物工程(上海)股份有限公司)，20 μmol/L正向和反向引物各1 μL，DNF Buffer 2 μL，5 μL分子級水和1 μL土壤樣品DNA。每樣本均三次重復，結果表示為每克土壤目標拷貝數，根據標準曲線計算各樣本中總真菌ITS 序列拷貝數。

1.3 真菌ITS基因的Illumina MiSeq測序

每種作物分別選擇了10個DNA樣本用于土壤真菌群落分析。PCR擴增選取真菌ITS基因的ITS2區，使用帶Barcode序列的引物對ITS3(CCAGCASCYGCGGTAATWCC)和ITS4(ACTTTCGTTCTTGATYRA)[9]進行兩輪PCR擴增。擴增完成后對其產物進行純化，純化產物Qubit2.0定量，根據測定DNA濃度將樣品等比例混合均一化形成測序文庫，在上海生工生物工程股份有限公司Illumina MiSeq測序平臺PE300進行高通量測序。

1.4 數據處理與統計分析方法

土壤理化性質檢測數據采用GraphPad Prism (ver.8.0)進行統計分析，采用Duncan’s新復極差法分析數據差異顯著性；高通量測序完成后經過數據處理獲得在97%相似水平下的OTU表，采用R語言(windows版v.4.1.0) vegan、picante包計算香農指數和操作分類單元數、使用FunGuild數據庫(http://www.stbates.org/guilds/app.php)[10]進行真菌功能預測分析，ggplot2包繪制真菌群落豐度、α-多樣性和土壤真菌FunGuild功能分類組成的相對豐度(單因素方差分析(single-way ANOVA)在P<0.05的概率水平下確定最小顯著差異)[11]。使用STAMP軟件分析不同作物土壤中真菌群落和功能的相對豐度[12]；使用深圳微生態科技有限公司提供的生物信息云平臺進行RDA分析(https://www.bioincloud.tech)。

2 結果

2.1 不同作物土壤的理化性質

表1顯示不同作物土壤中6種環境因子組間存在明顯差異(P<0.05)，露地蔬菜土壤與設施蔬菜土壤之間差異明顯，其中露地蔬菜作物姜和大蔥土壤中的全氮含量與電導率大大低于設施蔬菜作物黃瓜和草莓土壤，黃瓜土壤的全氮、有效磷、速效鉀、堿解氮以及電導率均顯著高于其他作物土壤，而大蔥土壤中的全氮、有效磷、速效鉀、堿解氮相對較低。

表1 四種蔬菜作物種植土壤理化性質Table 1 Physical and chemical properties of different crops’ soils

2.2 不同作物土壤中真菌群落的豐度

以真菌ITS拷貝數為指標，采用qPCR檢測了不同作物土壤真菌群落豐度，如圖 1 所示，四種作物土壤中，大蔥土壤中真菌群落豐度最低，姜土壤真菌群落豐度最高，且有顯著差異(P<0.05)；黃瓜和草莓土壤真菌群落豐度介于大蔥和大姜土壤之間，二者沒有顯著性差異。

注：圖中數字表示采用t檢驗計算的兩種作物土壤之間的具有差異的概率值。圖1 不同作物的土壤真菌群落豐度Fig.1 Abundance of soil fungal communities in different crops

2.3 不同作物土壤中真菌群落α-多樣性

測序后40個土壤樣本共得到高質量序列1 476 130條。在97%的相似性水平下聚類操作分類單元(OTU)，同時過濾豐度低于萬分之一的OTU，并按照最少序列數樣本整體抽平到13 563條序列，經UNITE數據庫比對后40個樣本共聚類得到541個真菌OTU。

圖2顯示，大蔥土壤真菌群落多樣性最豐富，草莓土壤真菌群落多樣性最差(香農指數)；與黃瓜、草莓設施蔬菜土壤相比，露地作物大蔥和大姜的土壤真菌群落豐富度更高(香農指數，但黃瓜和姜之間差異不顯著，P<0.05)。姜土壤真菌群落豐富度最高，黃瓜土壤真菌群落豐富度最低；與設施黃瓜、草莓土壤相比，露地大蔥和姜土壤真菌群落豐富度更高(操作分類單元數OTUs，P<0.05)。露地作物大蔥和姜之間，設施黃瓜和草莓之間的真菌群落豐富度和群落多樣性差異不顯著(P>0.05)。

圖2 不同作物土壤中真菌群落α多樣性Fig.2 Alpha-diversity of fungal communities in the soils of different crops

2.4 不同作物土壤真菌群落結構分析

依據物種注釋結果，對不同作物土壤樣本的物種進行分類，得到不同作物土壤樣本在門水平下的物種相對豐度柱狀堆積圖。如圖3所示，子囊菌門(Ascomycota)是不同作物土壤中最主要的真菌門類，占比73.36%～84.61%；其次擔子菌門(Basidiomycota)、壺菌門(Chytridiomycota)、被孢霉門(Mortierellomycota)也是含量比較豐富的優勢菌門，但在不同作物土壤中占比有明顯差異，如擔子菌門在黃瓜和草莓土壤中相對豐度低于1%，而大蔥和姜土壤中擔子菌門相對豐度均大于6%。通過STAMP差異比較不同作物土壤樣本之間物種在門水平上的相對豐度，發現草莓土壤與大蔥土壤的子囊菌門、壺菌門和擔子菌門相對豐度差異顯著(P<0.05)；草莓土壤與姜土壤的子囊菌門和擔子菌門相對豐度差異顯著(P<0.05)；草莓土壤與黃瓜土壤的擔子菌門相對豐度差異顯著(P<0.05)；黃瓜土壤與大蔥土壤的子囊菌門和壺菌門相對豐度差異顯著(P<0.05)；黃瓜土壤與姜土壤的被孢霉門相對豐度差異顯著(P<0.05)；其余組合之間無顯著性差異。

注：縱軸表示真菌門類群，每一列表示對應門類的平均相對豐度，不同顏色表示不同作物土壤，最右邊是對應的P值。圖3 不同作物土壤真菌群落在門水平上的差異檢驗Fig.3 Difference test of phylum level of soil fungal communities for different crops

2.5 不同作物土壤中功能真菌類群的豐度分析

圖4顯示了不同作物土壤中功能真菌類群的相對豐度，在姜、黃瓜、大蔥和草莓土壤的功能真菌類群中排泄物腐生菌、植物腐生菌、土壤腐生菌等營腐生真菌相對豐度分別為37.05%、12.26%、32.97%、43.68%，是土壤真菌的重要功能類群；草莓土壤中營腐生真菌占比最高，顯著高于黃瓜、大蔥土壤中營腐生真菌類群豐度(P>0.05)。姜、黃瓜、大蔥和草莓土壤中植物病原菌相對豐度分別為3.21%、0.72%、4.24%和2.24%；黃瓜土壤中植物病原真菌類群占比最低，但與其余三種作物土壤中植物病原真菌類群豐度無顯著差異(P>0.05)。

圖4 不同作物土壤中功能真菌的組成Fig.4 Composition of functional fungi in the soils of different crops

2.6 不同作物土壤真菌群落與土壤環境因子的關聯分析

不同作物土壤理化性質與土壤真菌群落間的冗余分析(redundancy analysis，RDA)如圖5所示。結果展示了不同作物土壤真菌群落與pH、總氮、堿解氮、有效磷、速效鉀、電導率6種環境因子的相關性，排序軸RDA1和排序軸RDA2方差變量解釋分別為31.76%和22.17%，累計解釋了土壤真菌群落結構累積方差變量的53.93%，說明RDA排序結果是比較可靠的，在不同作物土壤中6種環境因子對其真菌群落組成有顯著性影響(P<0.05)；排序軸RDA1與堿解氮的正相關性最大，相關性系數為0.999 2；排序軸RDA2 與pH的正相關性最大，相關性系數為0.300 8；與電導率值的負相關性最大，相關性系數為-0.806 9(表2)，6種環境因子中pH和RP與土壤真菌群落的相關程度最大，分別為0.438 7和0.367 3。

從真菌群落組成上看，在土壤中相對豐度大于0.5%的真菌門類中，子囊菌門受pH的影響最大，呈正相關，而與電導率呈負相關；捕蟲霉門(Zoopagomycota)受電導率影響較大、呈正相關；被孢霉門受RP影響最大，呈負相關；毛霉門(Mucoromycota)受RK影響較大，呈負相關；壺菌門受全氮和堿解氮影響較大，呈負相關；擔子菌門受電導率影響較大、呈負相關(圖5)。

表2 排序軸RDA與環境因子的相關關系Tab.2 Correlation between the sorting axes RDA and environmental factors

圖5 不同作物土壤真菌群落組成及門水平真菌類群與環境因子的RDA分析Fig.5 Redundancy analysis of the relationship between crop soil fungal community composition or phylum level fungal groups and environmental factors

3 討論

通過土壤DNA的高通量測序結果可以看出，子囊菌、擔子菌、被孢菌門、壺菌門、捕蟲霉門等真菌類群相對豐度占比較高，是土壤真菌的主要真菌組分，在總的土壤真菌中平均占比大于1%；毛霉門和捕蟲霉門也是重要的真菌門類，占比次之。多樣性分析表明大蔥和姜土壤中真菌群落香農指數高，OTU數多，多樣性更為豐富；黃瓜和草莓土壤樣品取自大棚，香農指數低，OTU數低，多樣性較低。此外，本項研究發現露地蔬菜土壤子囊菌含量低于設施蔬菜土壤子囊菌含量，分別為72.37%、73.45%、93.28%和83.61%；被孢霉門含量相對較高，分別為3.08%、5.83%和1.91%和0.92%。有研究表明在發病土壤中子囊菌Ascomycota的相對豐度更高，而在健康土壤中被孢霉門Mortierellomycota卻更多[13]，還有文獻報道，在富含有機質的土壤中被孢霉豐度很高，是土壤碳及養分轉化的關鍵真菌類群[14]。上述結果說明露地蔬菜土壤微生物生態狀況優于設施蔬菜土壤微生物生態。究其原因，從土壤理化性質分析結果可以看出，農戶在設施蔬菜種植過程施用比露地蔬菜更多的化學肥料，使得設施蔬菜土壤中N、P、K營養成分明顯高于露地蔬菜土壤，土壤電導率值偏高，土壤板結，從而造成了土壤微生物群落失衡。

依據FunGuild數據庫在線比對結果獲得姜、黃瓜、大蔥和草莓土壤中植物病原菌相對豐度，姜和大蔥的相對豐度更高，似乎其土壤真菌群落變得比設施蔬菜更不適宜，但將高通量測序獲得的相對豐度乘以qPCR定量獲得的土壤總真菌絕對量則發現，黃瓜和草莓土壤中病原真菌ITS序列拷貝數分別為每克土壤1.84×106和8.54×106，而大蔥和姜土壤中的病原真菌ITS序列拷貝數分別為每克土壤5.67×105和2.78×107上述結果顯示，不同作物土壤中病原真菌相對豐度無明顯差異，但伴隨土壤真菌總豐度的增加病原真菌絕對量會同比大幅升高，大大增加了作物病害發生幾率，這與當前萊蕪姜種植區莖基腐病、姜根腐病等土傳病害頻發相一致[15]，需要引起高度重視。因此，需從改善土壤質量入手，增施木霉、芽孢桿菌等有益菌，減施化學肥料，配施有機肥，降低土壤真菌豐度，改善真菌群落結構，為作物營造健康土壤環境。

真菌是土壤的重要組分，與細菌、原生動物等微生物共同參與土壤的養分和水分的生物地球化學循環[15]，并在多方面影響作物生長、控制作物疾病發生[4-5]，其豐度和組成可作為土壤健康評估的重要指標[16-17]，本研究分析了不同作物土壤真菌群落組成和多樣性，并探討了其與環境因子相互關系，為土壤環境質量的改善、提升提供了理論依據。