免疫因素與復發性流產的相關性分析

張倩，杜琛，陳秀娟，趙杰，李德邦

(1.內蒙古醫科大學,呼和浩特 010050;2.內蒙古醫科大學附屬醫院生殖醫學中心,呼和浩特 010050)

復發性流產(RSA)是指與同一伴侶在妊娠28周以前發生的連續2次或2次以上的自然流產,也包括連續的生化妊娠。在育齡期婦女中的發病率約為1%～5%[1]。RSA的病因非常復雜,目前已知的相關病因主要包括女性生殖道的解剖異常、夫婦染色體異常、內分泌異常和感染等。此外,仍然有大約40%～50%的患者流產病因不明,被稱為不明原因復發性流產(URSA)[2],多數認為與免疫因素相關。目前將免疫性流產分為兩部分,一部分是自身免疫型,主要是指機體產生的抗磷脂抗體(APA)、抗核抗體(ANA)、抗甲狀腺抗體(ATA)等自身抗體干擾正常妊娠、分娩過程所導致的流產;另一部分是同種免疫型,指排除解剖、內分泌、染色體、感染及自身免疫等方面的病因而未能發現其他導致流產的原因,主要與母胎界面的免疫耐受失衡相關。RSA嚴重影響著女性的生殖健康,給社會和家庭帶來巨大的壓力與痛苦。

一、自身免疫型RSA

自身免疫型RSA是指機體產生高滴度的特異性或非特異性的自身抗體,作用于相應的自身正常細胞和組織,最終導致組織器官損傷和功能障礙。自身抗體主要包括抗磷脂抗體(APA)、抗核抗體(ANA)、抗甲狀腺抗體(ATA)、抗卵巢抗體(AoAb)及抗精子抗體(AsAb)等。

1.抗磷脂抗體(APA):是一系列以負電荷磷脂為靶抗原的自身抗體,臨床上主要檢測的包括狼瘡抗凝物抗體(LA)、抗心磷脂抗體(ACA)及抗β2糖蛋白Ⅰ抗體(anti-β2GPI)[3]。LA是一種可在機體內自然產生、也可以因自身免疫系統異常而產生的自身免疫球蛋白,與內皮細胞的磷脂相結合,促進血栓形成[4]。ACA是一種膜結合脂質,是以血小板和內皮細胞膜上帶負電荷的心磷脂為靶抗原的自身抗體,通過延長血液凝固時間在體內起抗凝血作用[5];anti-β2GPI是由肝細胞生成的一種糖蛋白,可以干擾血管內皮生長因子(VEGF)和胎盤生長因子(PlGF)的生成,同時明顯抑制子宮內膜細胞產生VEGF[6],參與凝血和纖溶系統。在這些致病性抗體中,anti-β2GPI被認為是主要致病性自身抗體。β2GPI靶抗原分布于不同的組織,并且在滋養層細胞中高表達。

有研究者通過建立與臨床情況相似的產科抗磷脂綜合征(APS)小鼠模型得出,APA會降低滋養層細胞侵入和遷移的能力,影響滋養層細胞的正常功能,這與胎盤功能不全密切相關[7]。一項體外研究發現,APA可以在低密度脂蛋白受體相關蛋白8(LRP8)介導的作用下,通過降低IL-6(遷移細胞因子)水平和STAT3(一種信號轉導蛋白)活性來抑制滋養層細胞遷移,增加滋養層中可溶性抗血管生成內分泌蛋白的產生,導致螺旋動脈構象產生變化,最終導致不良妊娠結局[8]。

在正常人群中,APA的檢出率不到0.5%,而在復發性流產患者中的檢出率可達5%～20%,其中未經治療者再次妊娠的活產率將降低至10%[9]。APA是病理性妊娠的重要原因。在一項納入了100例RSA患者和100名健康女性作為對照的臨床研究中發現,與對照組相比RSA患者的APA顯著增加(P<0.05)[10]。在一項評估低分子肝素及靜脈滴注或口服丙環素治療效果的臨床研究中,共選取了62例RSA患者,結果顯示,治療前,研究組APA顯著高于對照組;治療后,研究組患者流產率顯著低于對照組(P<0.05)[11]。

APA可以作用于不同的靶細胞,如先天免疫細胞(中性粒細胞、單核細胞和血小板)、內皮細胞和滋養層細胞,導致血液凝固和血管生成減少;或者直接破壞滋養層細胞,影響從胚胎植入到螺旋動脈重塑的過程,對胚胎發揮直接的毒性作用[5];也可以與磷脂蛋白結合從而導致內皮細胞功能受損,或引起內皮細胞的活化,增加組織因子和黏附分子的表達,致使血小板聚集、血栓形成;還可過度活化補體系統,造成細胞免疫平衡紊亂、損傷滋養層細胞功能等,最終造成胎盤供血不足、胎兒缺血缺氧,并引起一系列的并發癥,導致病理妊娠。

2.抗核抗體(ANA):是一組針對細胞核成分,并與蛋白質、核酸和蛋白質-核酸復合物相結合的自身抗體。臨床上可以通過間接免疫熒光來檢測外周血中的抗體濃度,結果通常以滴度表示。低滴度表達的陽性ANA常見于健康女性,而高滴度(≥1∶160)表達的陽性ANA多與自身免疫性疾病密切相關,這也與不良妊娠結局有關[12]。有學者研究發現,ANA在正常人群中陽性檢出率為5.9%～23.7%,而在不孕癥患者中陽性檢出率要更高(28.79%～39.45%)[13]。許多研究試圖闡明ANA與RSA之間的關聯,但目前仍存在很大爭議。雖然不能明確兩者之間的關系,但有研究表明ANA可以在早期懷孕和流產中發揮重要作用。一項薈萃分析表明,包括2 683例RSA女性和2 355例正常流產女性,發現RSA組的ANA總陽性率明顯高于對照組。此外,亞組分析表明,高ANA滴度(≥1∶160)與RSA之間存在顯著關聯,而低滴度ANA(1∶40≤ANA≤1∶80)和RSA之間沒有顯著相關性。由此可得出ANA陽性與RSA風險增加呈正相關[14]。

雖然ANA在復發性流產中的作用機制并不是很明確,但有研究提出可能有以下幾種機制。首先,ANA可以直接與胚胎結合,對胚胎的質量和發育產生直接的不良影響,最終導致懷孕和植入率降低;其次,母胎界面中免疫復合物組織的沉淀可能是導致ANA陽性婦女流產的可能機制之一。ANA通過Toll樣受體-9(一種模式識別受體)誘導樹突狀細胞的活化,導致炎癥因子(如INF -α)的產生增加,刺激體液免疫反應并導致ANA的進一步產生,最終導致流產;此外,免疫復合物組織可能誘導局部補體激活與炎癥浸潤。炎癥細胞的募集創造了一個促炎擴增環,增強了C3的活化和沉積,產生額外的C3a和C5a,并導致炎癥細胞進一步流入胎盤,最終導致妊娠丟失[12]。

3.抗甲狀腺抗體(ATA):主要包括抗甲狀腺球蛋白(TGAb)、抗甲狀腺過氧化物酶(TPOAb)和抗甲狀腺受體(TRAb)抗體。有學者認為ATA導致胚胎丟失的機制可能有兩種:甲狀腺依賴機制和非依賴機制。甲狀腺激素可以維持妊娠的進展,而TPOAb對甲狀腺具有毒性作用,可破壞甲狀腺,引起甲狀腺功能減退;TPOAb與流產、胎盤早剝、妊娠高血壓等妊娠并發癥相關;TRAb異常升高也會影響母體和胎兒的甲狀腺功能。由于這些抗體可以自由通過胎盤屏障,所以ATA陽性的女性通常不能分泌足夠的甲狀腺激素,長久以往,最終可能導致流產。透明帶、人絨毛膜促性腺激素受體和胎盤會顯示與甲狀腺組織類似的抗原,ATA可以靶向顯示交叉反應抗原的甲狀腺外組織,從而影響生育能力和妊娠結局[5]。一項薈萃分析指出,TPOAb 與RSA患病率之間存在顯著關聯,血清ATA的存在對女性有害,甚至可能導致RSA[15]。另一項薈萃分析指出,ATA陽性組與正常患者組相比,受精率明顯下降,而流產率則顯著升高[16]。但一項隊列研究指出:ATA陽性與甲狀腺功能正常的女性不良妊娠的風險增加無關[17]。因此,ATA與復發性流產的關系及其發病機制仍有爭議,需要我們進一步去研究。

4.抗卵巢抗體(AoAb):是一種靶抗原在卵巢顆粒細胞、卵母細胞、黃體細胞和間質細胞內的自身抗體。正常女性體內會存在一定量非致病性的AoAb,可以幫助清除一部分體內衰老細胞和組織。但是在機體受到感染、創傷、反復穿刺取卵或使用促排卵藥物的作用下,會產生卵巢抗原,從而刺激AoAb的釋放,作用于相對應的靶細胞,最終引起卵巢過度的免疫應答,甚至產生不可逆的損傷,從而加快卵泡的閉鎖或影響卵巢的排卵和內分泌功能,最終導致不孕。有研究指出,在RSA患者中可檢測到有57.08%的病例出現AoAb陽性,而對照組只有18.44%,表示AoAb可能是導致RSA的重要原因之一[18]。但是目前大多數報道的研究都是小型或非隨機的前瞻性研究,因此AoAb在流產中的作用很難得出更有意義的結論。

5.抗精子抗體(AsAb):關于AsAb導致反復自然流產的相關研究,目前學術界尚未形成一致性的臨床共識。但長期以來一致認同的是精子對于女性身體來說是具有抗原作用的,在受到感染或外傷等因素的作用下進入女性血液循環中從而產生免疫抗體,AsAb便是機體產生的免疫復合物。AsAb可以通過兩種機制來抑制精子-透明帶緊密結合[19],一種是直接與精子膜中透明帶的配體結合,另一種是與精子膜中透明帶配體附近的相應抗原結合,它們都干擾精子膜中透明帶的配體與透明帶中的精子受體之間的結合,最終導致流產及不孕。

二、同種免疫型RSA

成功的妊娠需要在子宮內膜的母胎免疫界面進行準確的免疫對話。從妊娠早期到妊娠晚期不同的免疫環境表明,母胎界面的局部免疫生態需要精心安排,才可以保證發育中胎兒的正常存活及生長。除蛻膜細胞和內皮細胞外,浸潤性免疫細胞也是母體蛻膜的主要細胞成分之一,主要包括蛻膜自然殺傷細胞(uNK)、巨噬細胞、T細胞、子宮樹突狀細胞(uDC)等。

1.蛻膜自然殺傷細胞:在人類的免疫細胞中,自然殺傷細胞(NK)主要存在于外周血液中,稱為外周血NK(pNK)細胞,并廣泛分布在全身。NK細胞主要分為CD56brightCD16-及CD56dimCD16+兩種類型,CD56brightCD16-主要產生免疫調節細胞因子,具有較弱的毒性,而CD56dimCD16+主要產生細胞毒性作用[20]。大約90%的pNK細胞具有CD56dimCD16+表面表型,其余10%具有CD56brightCD16-表面表型。除pNK細胞外,NK細胞還存在于外周組織中,例如肝臟、肺、皮膚和子宮,被稱為“組織駐留NK”(trNK)細胞。大多數trNK細胞是CD56brightCD16-NK細胞,并高表達CD69、CD103和CD49a。蛻膜NK(uNK)細胞是在子宮內膜蛻膜組織中發現的一種特殊類型的trNK細胞,與pNK細胞和其他trNK細胞相比,表現出許多獨特的表型和功能特征[21]。

uNK是妊娠早期和中期蛻膜中最豐富的免疫細胞。其數量在懷孕前三個月中約占總淋巴細胞的70%,在妊娠晚期約占50%[20]。在正常妊娠早期階段,滋養層細胞可以分泌與炎癥相關的多種細胞因子和趨化因子,如TGF-β、IL-6、CXCL8/IL-8、CXCL12/SDF1和CCL2/MCP1,募集pNK細胞向子宮遷移,并調節它們在子宮中的功能,介導免疫細胞與子宮內皮細胞之間的相互作用,重塑蛻膜螺旋動脈血管壁[22]。

已有學者研究得出,uNK細胞有三個主要亞群:uNK1、uNK2和uNK3細胞[23]。uNK1細胞主要表達絨毛外滋養層(EVT)上存在的HLA I類配體的NK受體,即KIR(HLA-C受體)、LILRB1(HLA-G受體,對EVT具有特異性)、CD94-NKG2A(HLA-E的抑制受體)和CD94-NKG2C(HLA-E的激活受體)[24]。HLA-C和HLA-G分子與其受體在uNK1細胞上的相互作用有助于滋養層侵襲、血管重塑和維持免疫耐受的局部微環境[25]。uNK1細胞含有更多的細胞質顆粒蛋白(包括穿孔素1、顆粒溶血素等),可產生對抗胎盤感染及參與糖酵解的酶的免疫力,在孕早期發揮主要作用。uNK2與uNK1之間的功能相似,與后者共同表達HLA-E分子的活化殺傷細胞凝集素樣受體C2(NKG2C)和NKG2E(NK細胞上的激活受體)以及NKG2A受體(NK細胞上的抑制受體),還表達高水平的X-C基序趨化因子配體1(XCL1),介導胎兒-母體界面EVT和樹突狀細胞的募集。uNK3細胞比例較低,高表達趨化因子配體5(CCL5),誘導EVT向母體組織的遷移[21]。

正常妊娠時,uNK通過產生趨化因子IL-8和IP-10來調節滋養層細胞的侵襲,參與滋養層侵襲和螺旋動脈重塑,降低NK細胞的細胞毒性作用,參與母胎耐受的調節。有研究表明,在RSA患者子宮蛻膜中CD56brightCD16-NK細胞亞型明顯減少,而CD56dimCD16+細胞比例較高,這表明RSA患者體內的NK細胞具有較高的細胞毒性[26]。CD56dimCD16+細胞通過分泌過多顆粒素等對細胞造成毒性作用,導致滋養層細胞過度凋亡,從而影響滋養層細胞侵襲蛻膜內血管,使蛻膜動脈重塑受損,最終造成失敗妊娠。

2.巨噬細胞:作為一種對人類妊娠至關重要的免疫細胞,巨噬細胞對各種環境信號有著顯著的可塑性,并在調節著床、胎盤形成、胎兒發育、分娩等,特別是母胎界面的血管重塑中發揮著重要作用。在卵子正常受精后,巨噬細胞在雌激素和黃體酮的作用下被募集到子宮內膜內,以響應促炎、代謝和免疫刺激的作用。在懷孕前三個月,蛻膜巨噬細胞約占蛻膜淋巴細胞的10%～20%,是僅次于uNK細胞的第二大主要白細胞群[27]。巨噬細胞主要定位于入侵的滋養層細胞和螺旋動脈附近,并在妊娠早期發揮重要作用:增強囊胚著床和滋養層細胞入侵、重塑螺旋動脈、清除凋亡細胞和細胞碎片以及保護胎兒免受外來病原體的侵害[28]。

根據其細胞因子分泌、趨化因子表達和功能特征,蛻膜巨噬細胞可以分化為經典激活的巨噬細胞(M1)和交替激活的巨噬細胞(M2)。M1表型可以發揮促炎作用,通過γ干擾素(IFN-γ)和腫瘤壞死因子(TNF)或病原體(脂多糖)的暴露從而被誘導產生。M1巨噬細胞主要分泌促炎細胞因子和趨化因子如IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-12、TNF-α、CXCL9、CXCL10、NO及蛋白水解酶等,表達表面標志物CD80、CD86、TLR-2、TLR-4和主要組織相容性復合體(MHC)Ⅱ類,具有較高的呈遞抗原的能力,可極大限度地促進組織損傷和炎癥反應[29]。M2表型具有調節穩態和抗炎的作用,由Th2細胞因子誘導產生,例如IL-4(IL-4)和白細胞介素-13(IL-13)、抗炎因子IL-10以及凋亡細胞(AC)和巨噬細胞集落刺激因子(MCSF或CSF-1),可以分泌大量IL-10、TGF-β、CCL17、CCL18和CCL22等抗炎細胞因子和促進組織重塑的因子[30]。在外界不同的刺激作用下,M2表型又可以細分為M2a、M2b、M2c和M2d。在胚胎植入子宮內膜之前,蛻膜巨噬細胞偏向M1分化;而當滋養層細胞開始侵入子宮肌層時,細胞分化便向混合的M1/M2傾斜;直到胎盤發育結束,蛻膜巨噬細胞才轉化為主要的M2表型,保護胎兒和胎盤直到分娩。在一項使用低劑量脂多糖(LPS)誘導小鼠流產模型來觀察巨噬細胞的動態變化的研究中,結果顯示M1細胞總體呈增加趨勢,M2細胞呈下降趨勢,M1/M2比值呈上升趨勢,這表明流產前M1巨噬細胞是主要表型。而將M2細胞轉移到流產模型小鼠體內后,經LPS誘導的流產量顯著減少[31]。也有研究發現,在RSA患者的子宮蛻膜中常可觀察到M1的異常增加或M2的異常降低[32]。由此可認為M1/M2失衡引起的過度促炎環境是RSA的原因之一。因為巨噬細胞具有高度的多樣性,可塑性和異質性,所以在一定條件下M1和M2表型可以相互轉化,但其在炎癥與免疫調節中的功能不能完全歸因于一個或另一個亞群。

巨噬細胞在胎盤發育過程中與滋養層細胞密切接觸,來自滋養層細胞的細胞因子是巨噬細胞極化和功能的重要調節劑。組蛋白乙酰化可影響細胞因子的表達和分泌,ATP檸檬酸裂解酶(ACLY)是調節組蛋白乙酰化的重要因子。研究表明,RSA患者胎盤絨毛中的ACLY水平降低,可能會導致滋養層細胞中組蛋白乙酰化的抑制,從而減少IL-10等抗炎因子的分泌,激活巨噬細胞中的內質網應激,從而抑制其M2極化[33]。IL-10被認為是妊娠成功的關鍵細胞因子。這與既往一項研究的結果一致,與正常流產女性相比,RSA女性的蛻膜巨噬細胞分泌的CD80、CD86表達增加,IL-10表達降低[28]。上皮-間充質轉化(EMT)是以上皮表型喪失和間充質表型獲得為特征,在絨毛外滋養層細胞(EVT)遷移和侵襲的調控中起重要作用。一項研究指出,M1表型巨噬細胞可分泌細胞外囊泡(EV),上調miRNA的表達,從而抑制滋養層EMT,降低滋養層細胞的遷移和侵襲能力,還可加劇小鼠的胚胎吸收[34]。RSA患者體內的巨噬細胞也會表達CD36來介導吞噬作用。巨噬細胞胞吞巨噬作用增強后也會導致胚胎缺血缺氧,最終導致流產。

3.T淋巴細胞:主要效應亞群可分為Th1、Th2、Th17和調節性CD4+T(Treg)細胞。Th1細胞負責介導細胞免疫,能夠調節NK細胞、淋巴細胞活化殺傷細胞(LAK)、細胞毒性T淋巴細胞(CTL)的發育,并殺死滋養層細胞[33]。Th2細胞參與體液免疫,可以產生抗體及維持同種免疫耐受狀態。Th2細胞可以促進妊娠胎盤的正常生長,而Th1細胞可抑制滋養層細胞生長。在胎盤正常發育中,母體子宮對胎兒抗原主要是通過Th2來發揮免疫耐受作用,而抑制妊娠期間Th1的免疫作用,從而保護胎兒免受來自母親Th1的攻擊。已有研究證實,健康懷孕的女性子宮蛻膜上的T細胞多向Th2偏倚,而有RSA病史的女性多傾向于Th1偏倚,母胎界面Th1/Th2平衡傾向于Th2時更有利于妊娠。近年來,T細胞免疫球蛋白結構域和粘蛋白結構域-3(Tim-3)在生殖免疫領域的作用受到廣泛關注。Tim-3主要在分化的Th1細胞中表達,懷孕婦女子宮蛻膜中的Tim-3表達上調,可以增強先天性免疫和適應性免疫反應。最近的一份報告顯示,RSA組胎盤絨毛合體滋養層和細胞滋養層膜上的Tim-3表達顯著高于對照組[35]。先天免疫系統受到Th1/Th2細胞因子平衡的影響,有益或有害模式的局部免疫細胞分化取決于Th1/Th2。在Th1高表達環境中,巨噬細胞分化為有害的 M1巨噬細胞,uNK 細胞分化為淋巴因子激活的殺傷細胞,樹突狀細胞分化為有害的DC-1,T細胞分化為有害的Th17細胞,所有這些細胞都能夠靶向并殺死胚胎。相反,在Th2顯性環境中,巨噬細胞多分化為M2細胞,uNK細胞變成促進血管生成的免疫細胞,T細胞分化為Treg細胞以促進局部耐受[36]。

Th17細胞與黏膜屏障的維持和自身免疫異常相關,主要在妊娠晚期開始增加,常被認為是參與分娩的開始。有研究表明,Th17細胞可以在一定條件下向Th1轉變,使其獲得更高的致病性,這通常與自身免疫性疾病(如RSA)的發病機制有關[37]。Treg細胞是CD4+T細胞的一個子集,主要參與免疫自身和移植耐受,是適應性免疫的重要組成部分,主要功能是限制免疫反應,并在預防自身抗原的自身免疫反應中發揮相關作用。Treg細胞主要在胚胎植入和妊娠早期起關鍵作用。與正常女性相比,RSA女性外周血中以及子宮內膜和蛻膜中的Treg細胞是減少的[28]。在正常妊娠中,Treg細胞通過免疫應答來保護胎兒及其附屬物組織,Treg細胞數目減少可使胎盤發育異常,導致病理妊娠;而與Treg細胞相反,Th17細胞主要是促進炎癥、移植排斥反應和自身免疫性疾病,對正常妊娠有害;因此外周血和蛻膜組織中Treg細胞減少,而Th17細胞增加,會使患者更容易發生流產[35],進一步研究指出RSA女性Treg細胞的減少與Th17細胞的增加會同時出現。對動物模型進行的研究表明,Treg細胞的耗竭導致流產率增大,相反,向小鼠體內轉移Treg細胞可以防止小鼠流產[28]。另一項臨床研究闡明,正常流產組要比APA陽性患者懷孕率較高、流產率較低,且與對照組相比,APA陽性女性的外周血Th1和Th17細胞的比例顯著增高,外周血Th2和Treg細胞的比例顯著降低,從而導致APA女性的Th1/Th2和Th17/Treg比值不平衡[38]。只有精準調控炎癥反應,使Th1、Th2、Th17及Treg細胞在母胎界面達到平衡才能更好地維持正常妊娠。

4.子宮樹突狀細胞(uDC):被稱為有效的抗原呈遞細胞,具有在免疫反應期間誘導抗原特異性激活以克服免疫抑制的獨特能力,其在蛻膜基質細胞中含量較少,但具有處理胎兒抗原并向蛻膜T細胞呈遞的能力。uDC也可以促進局部血管生成。轉基因小鼠模型的研究發現,uDC的耗竭會影響胚胎植入并導致胚胎被吸收等不良妊娠結局[28]。在RSA患者子宮蛻膜中,未成熟的uDC多向成熟的uDC轉變,后者可激活初始T細胞增殖,誘導局部免疫的發生,打破Th1、Th2之間的平衡,導致向Th1偏倚的異常狀態,增強排斥反應,最終導致流產[39]。

三、結論

復發性流產和自身免疫有著不可分割的聯系。在排除了其他因素的影響,例如染色體異常、子宮畸形、排卵障礙及傳染病等病因后,還需從免疫因素方面考慮,并進行相關檢查。自身免疫系統由多種復雜的機制所構成,不同機制相互影響又各自獨立,雖然在眾多學者的努力探索下,我們已經了解部分本質,但仍需更進一步探索其致病機制,為RSA的診治提供更多的理論依據。