鐵調素敲除對雄性小鼠鐵代謝及骨代謝影響的實驗研究

劉祿林 江小偉 廖直斌 賴長君 張福生 曹子厚 劉午陽 姬廣林 徐又佳*

1. 贛南醫學院第一附屬醫院骨科，江西 贛州 341000 2. 寧都縣人民醫院骨科，江西 贛州 3428003 3. 蘇州大學附屬第二醫院骨科，江蘇 蘇州 215000

由于人口老齡化程度的不斷加劇，骨質疏松癥及其并發癥已成為公共健康領域新的挑戰[1]。骨質疏松癥的原因很多，近年來研究[2-3]發現鐵蓄積是骨質疏松癥的一個獨立危險因素。絕經后女性雌激素下降90 %，伴隨血清鐵蛋白提高2～3倍，升高的血清鐵蛋白可能是I型骨質疏松癥的重要致病因素[4]。一項針對1 729名健康絕經后女性和中年男性(年齡≥40歲)為期3年的隊列研究[5]結果提示，血清鐵蛋白水平與骨量丟失速率呈正相關。鐵蓄積不僅對成骨細胞增殖、分化有抑制作用[6-7]，還可促進破骨細胞分化和骨吸收[8]，骨轉換失衡最終導致骨質疏松。鐵蓄積與骨質疏松發生的相關性被發現后,有報道表明降低鐵水平可以改善代謝和骨微結構[9-10]。鐵調素是調節機體鐵吸收和利用的關鍵分子[11]。本團隊對小鼠進行鐵調素基因敲除，發現7月齡時小鼠出現明顯鐵蓄積和骨量下降，主要表現為成骨細胞活性受抑制[12]。然而，慢性和持續性鐵蓄積對骨代謝的影響尚不清楚，尤其是在老年狀態下。因此，本研究利用鐵調素基因敲除小鼠構建內源性鐵蓄積小鼠模型(KO組)，將其與野生型(WT組)小鼠比較，觀察兩組小鼠7、12、18月齡時鐵代謝指標和骨量變化，探究骨轉換指標和氧化應激水平的變化，初步探討慢性持續性鐵蓄積對骨代謝的動態影響。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1研究材料：鐵調素基因敲除小鼠購自蘇州大學-劍橋基因組資源中心；微型計算機斷層(Micro-CT，SKY-SCAN公司，比利時)；多功能酶標儀(Biotek公司，美國)；Elisa試劑盒：血清鐵調素 (武漢伊萊瑞特公司)、血清鐵蛋白(英國ABCam公司)、OCN(美國Cloud-Clone 公司)、CTX(美國Cloud-Clone 公司)水平；血清MDA(中國南京建成公司)，SOD(中國南京建成公司)。

1.1.2研究對象：參照文獻[12]將鐵調素基因敲除雜合子小鼠進行雜交，產生敲除型(KO組)和野生型(WT組)后代，選取雄性小鼠作為研究對象,經基因鑒定后進行分籠飼養。在7、12、18月齡時每組選10只小鼠，麻醉后收集小鼠血清、肝臟、股骨及脛骨標本。

1.2 研究方法

1.2.1骨鐵濃度：采用原子吸收光譜法測定脛骨鐵含量。將脛骨樣品用鹽水沖洗幾次，然后在110 ℃的烤箱中過夜干燥。準確測量干重后將干燥的樣品在馬弗爐中550 ℃下灰化，然后溶解在王水酸中，根據原子吸收法測定鐵濃度。

1.2.2普魯士藍肝臟鐵染色：將肝組織用含10 %甲醛緩沖液固定，經乙醇梯度脫水后包埋制成石蠟切片，用普魯士藍染色液(核固紅法)對肝鐵進行染色。

1.2.3Micro-CT掃描檢測小鼠股骨微結構：取小鼠左側股骨，剔除骨周圍肌肉等軟組織。將股骨標本及時置于Micro-CT樣品檢測板中進行適當固定，并行精準掃描。股骨遠端感興趣區(ROI)掃描條件和參數參照文獻[8]。

1.2.4血清中鐵調素、鐵蛋白、氧化應激和骨轉換標志物的測定：將兩組小鼠完全麻醉后，經小鼠內眥靜脈取適量血液，室溫靜置2 h后，4 ℃，3 000 r/min，離心20 min，取上清即為血清標本。采用酶聯免疫吸附法(ELISA)檢測小鼠血清鐵調素、鐵蛋白、OCN、CTX。采用組織化學反應法檢測SOD、MDA水平。按照各種試劑盒說明書步驟進行操作。

1.3 統計學方法

所有數據均采用SPSS 21.0統計軟件進行統計學處理，數據以均數±標準差表示，組間比較采用t檢驗。檢驗水準α值取雙側0.05。經處理后的數據使用GraphPad Prism5軟件進行圖像編輯。

2 結果

2.1 小鼠體重、鐵代謝指標相關結果

與WT組小鼠相比，KO組小鼠發育正常，且小鼠的飲食、睡眠、活動、毛發色澤等無異常跡象。如圖1A所示，在7、12、18個月各時間觀察點，同一觀察節點時間比較兩組小鼠的體重無顯著差異。為驗證Hepc1基因敲除的效果，采用ELISA檢測血清鐵調素水平，KO組小鼠各時間點鐵調素均顯著低于同期的WT組小鼠(圖1B)。反映機體鐵存儲水平的血清鐵蛋白在KO組小鼠則明顯高于同期的WT組小鼠(圖1C)。此外，在本研究中也觀察到骨組織鐵含量在KO組小鼠均顯著高于WT組小鼠(圖1 D)。鐵調素敲除后鐵調素水平下降，血清鐵和組織鐵含量明顯升高，結果提示內源性鐵蓄積小鼠模型成功構建。

圖1 小鼠體重和鐵代謝指標結果Fig.1 Results of body weight and iron metabolism related indices in mice注：A：體重；B：血清鐵調素；C.：血清鐵蛋白；D：骨鐵濃度。與WT小鼠相比，*P<0. 05。

2.2 小鼠普魯士藍肝鐵染色

肝臟普魯士藍染色提示KO組小鼠肝臟切片鐵沉積在3個時間點均明顯增高(圖2)，提示鐵調素基因敲除后，小鼠肝臟逐漸出現鐵蓄積，該結果進一步說明內源性鐵蓄積模型的成功構建。

圖2 肝臟普魯士藍鐵染色圖 (×40)Fig.2 Prussian blue staining of iron in liver (×40)

2.3 股骨Micro-CT掃描檢測結果

為了評估鐵超載對骨微結構的影響，對骨小梁和皮質骨進行了顯微CT分析。從三維立體圖可以看出隨著年齡增大，WT組小鼠松質骨骨小梁逐漸疏松，而KO組小鼠較同期WT組小鼠骨小梁數量更少、骨小梁間隙更大(圖3A、3B)。進一步三維CT數據分析表明，較同期WT組小鼠，KO組小鼠BMD明顯降低，BV/TV、Tb.N、Tb.Th、ConnD減小，Tb.Sp、SMI增大；皮質骨三維數據分析提示和同期WT組小鼠相比，KO組小鼠皮質外徑周長沒有明顯區別，而內徑周長增大，皮質骨面積明顯減小(表1)。

表1 小鼠股骨遠端微結構參數三維分析Table 1 Three-dimensional analysis of microstructural parameters of distal femur in

圖3 股骨遠端松質骨和皮質骨Micro-CT三維重建Fig.3 Three-dimensional reconstruction of cancellous and cortical bone of the distal femur by Micro-CT注：A：松質骨；B：皮質骨。

2.4 血清骨轉換指標和氧化應激指標

KO組小鼠在7、12、18個月三個時間點的OCN水平均顯著低于WT組小鼠(圖4A)；而兩組小鼠的CTX水平在7月齡時無明顯區別，在12、18月齡時KO組小鼠均顯著高于WT組小鼠(圖4B)，提示內源性鐵積累同時合并骨吸收活性增強、骨形成水平抑制。本研究同時檢測了氧化應激水平，KO組小鼠三個時間點的氧化指標MDA明顯高于WT組小鼠(圖4C)，而抗氧化指標SOD則呈相反趨勢(圖4D)。

圖4 小鼠骨轉換指標和氧化應激指標結果Fig.4 Results of bone turnover index and oxidative stress index in mice注：A：血清骨鈣素；B：血清I型膠原羧基末端肽；C：血清丙二醛；D：血清超氧化物歧化酶。與WT小鼠相比，*P<0. 05。

3 討論

近年來的研究[3,13]表明骨代謝異常與機體鐵蓄積有關。通過基因工程敲除鐵代謝相關基因得到的內源性鐵蓄積模型穩定可靠、結果更加準確[7]。在本研究中，大致模仿了人類的青年期、成年期、老年期，觀察鐵調素基因進行敲除后小鼠7、12、18月齡時鐵代謝和骨代謝相關指標的變化。而且，由于雌激素和鐵調素之間存在潛在直接調控關系[4]，為排除雌激素影響，將雄性小鼠作為研究對象。本研究發現鐵調素敲除組雄性小鼠鐵調素明顯下降，組織呈現明顯的鐵蓄積狀態。隨著小鼠月齡增大，組織鐵呈漸進性累積，但兩組小鼠在飲食、睡眠、活動或體重方面沒有顯著差異。這些表型證實這是研究機體慢性鐵蓄積的成功模型。對股骨顯微CT掃描發現KO組小鼠的骨密度較正常組小鼠顯著下降，同時骨小梁分析參數發生了相應的變化，骨體積分數、骨小梁數目下降及骨小梁間隙增加。研究結果表明鐵蓄積能顯著降低小鼠的骨量和干擾正常骨微結構，與相關文獻報道一致[12]。

骨重塑包括破骨細胞去除舊骨以及成骨細胞促進新骨的形成。本研究進一步檢測了骨轉換指標OCN和CTX。縱向比較發現WT組和KO組小鼠隨著月齡增大，OCN和CTX均逐漸減少，說明隨著增齡骨轉換水平降低。而兩組小鼠橫向比較，KO組小鼠各時間點OCN均低于WT組小鼠；CTX水平除了在7月齡時無明顯差異，在12、18月齡時KO組小鼠均高于WT組小鼠，說明鐵蓄積抑制了成骨的同時且促進了破骨活性。對原代小鼠祖細胞和小鼠成骨細胞系的研究[14]表明，鐵可抑制成骨細胞的生成、分化和功能。同時，鐵蓄積還可通過刺激mTOR水平的升高抑制“骨形成和血管生成偶聯”導致骨量下降[7]。成熟破骨細胞發揮骨吸收功能過程需要大量線粒體提供高能量來完成[15]。鐵攝取可通過增加PGC-1 beta表達、ROS生成和線粒體數量刺激破骨細胞分化和骨吸收[16]。而鐵穩態的關鍵調節因子鐵調素通過降鐵可逆轉這種效應[10]。

本次研究同時觀察了氧化應激指標。在本實驗模型中，小鼠體內的ROS水平顯著升高，在小鼠老齡時尤為明顯，可能有兩個主要原因。一方面，ROS主要產生于線粒體代謝，會隨著年齡的增長而積累[17]；另一方面，衰老細胞通常會積累大量的細胞內鐵(高達30倍)[18]，鐵可介導Fenton反應產生氧化應激，因此衰老的因素及內源性鐵蓄積綜合導致了小鼠老齡時ROS水平升高[19]。活性氧的積累被認為是破壞骨內穩態的一個重要因素，包括抑制成骨細胞的活動、促進其凋亡[6]，且可通過激活參與破骨細胞功能的關鍵途徑加速破骨細胞的再吸收[16]。

綜上所述，鐵調素基因敲除后小鼠出現慢性累積性鐵蓄積，鐵蓄積可刺激氧化應激水平提高，并通過抑制成骨活性、促進破骨吸收而加重骨量丟失。