虹鱒fabp10 基因真核表達載體構建、生物信息學及組織表達分析

任廣明，林玉杰，徐黎明，趙景壯，邵軼智，盧彤巖

（中國水產科學研究院黑龍江水產研究所，黑龍江省水生動物病害與免疫重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150070）

脂肪酸結合蛋白（fatty acid binding proteins，Fabps）是一類分子量14～15 kDa 的脂質伴侶蛋白，隸屬于脂質結合蛋白（lipid-binding proteins，Lbps）超家族[1,2]。Fabps 不僅廣泛分布在哺乳動物的所有組織中，也存在于鳥類、魚類、昆蟲的腦、心臟、腸、脂肪等組織中[3]。不同動物的Fabps 組織特異性不同，在國際上通常以Fabps 被分類或鑒定的第一個組織進行命名。至今為止，已命名為9 種組織特異性的胞質Fabps，分別為腦型（brain Fabp，B-Fabp）、肝臟型（liver Fabp，L-Fabp）、腸型（intestinal Fabp，I-Fabp）、心臟型（heart Fabp，H-Fabp）、脂肪細胞型（adipocyte Fabp，A-Fabp）、回腸型（ileum Fabp，I-Fabp）、睪丸型（testis Fabp，T-Fabp）、表皮型（epidermal Fabp，E-Fabp）和髓磷脂型（myelin Fabp，My-Fabp）[4,5]。

Fabps 作為重要的脂質信號，對脂肪酸具有高的親和力，能夠以非共價鍵形式結合疏水性配體，如飽和長鏈脂肪酸、不飽和長鏈脂肪酸、類花生酸、血色素、類視黃醇等[6]。Fabps 與這些脂肪酸結合后可被攜帶至內質網進行信號傳遞與膜的合成；攜帶至胞質進行酶活性的調控；攜帶至線粒體和過氧化物酶體中進行氧化功能；攜帶至核內進行基因轉錄的調控[7,8]。Fabps 與配體有效結合后，一方面提高了脂肪酸的轉運速率，被運送到各個細胞器中參與脂質的存儲、轉運、氧化、脂化與合成以維持細胞內游離脂肪酸較低的濃度，緩解高濃度脂肪酸對細胞的損傷；另一方面可與JAK2、C36 和PPARγ 等因子直接作用，調節胞內信號通路，調控細胞內炎癥反應過程[9-11]。可見，Fabps 通過參與調節脂肪酸和胞內重要的信號通路來影響宿主細胞脂質代謝、能量代謝和炎癥反應。

Fabp10 是一種只在非哺乳脊椎動物的肝臟中檢測到，在哺乳動物肝臟中未被檢出的脂肪酸結合蛋白[3]。目前，關于虹鱒fabp10 基因的序列、結構功能、不同組織中分布等的研究還較少，其參與調節虹鱒機體脂肪酸代謝與炎癥反應的分子機制尚不明確。本實驗旨在構建fabp10 真核表達載體，研究其結構、功能及在虹鱒各組織中的轉錄活性，為進一步探討fabp10 基因在虹鱒脂質代謝及機體炎癥過程中的作用提供重要的參考。

1 材料與方法

1.1 材料

采集健康虹鱒腦、肝臟、心臟、脾臟、頭腎、腸和肌肉組織用于RNA 的提取。轉染用細胞為本實驗室保存的EPC 細胞系。

1.2 主要試劑

TrizoL 試劑、Premix Taq 酶、實時熒光定量PCR試劑盒、RT-PCR 試劑盒、限制性內切酶BamHⅠ和EcoRⅠ、pMD18-T 載體、大腸桿菌DH5α 感受態細胞、T4 DNA 連接酶等購自生工生物工程（上海）股份有限公司；膠回收試劑盒、無內毒素質粒大提取試劑盒，購自北京天根生化科技有限公司，LipofectamineTM2000 轉染試劑盒購自賽默飛世爾科技（Thermo Fisher Scientific）公司。

1.3 方法

1.3.1 引物的設計與合成

根據GenBank 數據庫公布的河鱒（Salmo trutta）fabp10 基因CDS 序列（XM _029737487.1），利用premier 5.0 軟件設計1 對基因克隆引物和2 對熒光定量PCR 引物。其中，基因克隆引物由吉林庫美生物有限公司合成擴增全長引物，并分別在上、下游引物的5'端添加BamHⅠ和EcoRⅠ的酶切位點（下劃線部分）。所有引物均由吉林庫美生物有限公司合成，引物信息見表1。

表1 虹鱒fabp10 基因引物信息Tab.1 Primers of rainbow trout fabp10 gene

1.3.2 虹鱒fabp10 基因CDS 序列全長擴增

采用Trizol 法提取虹鱒肝臟總RNA，利用RTPCR 試劑盒進行PCR 擴增。PCR 反應體系：Taq 酶1 μL、buffer 12 μL，上、下游引物（100 pmol/μL）各1 μL、模板5 μL、ddH2O 補足至25 μL。PCR 反應條件為：50℃30 min，94℃預變性5 min，94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s，30 個循環；72℃徹底延伸10 min。采用1.0%瓊脂糖凝膠進行電泳驗證。

1.3.3 虹鱒fabp10 基因克隆載體構建

采用膠回收試劑盒膠回收fabp10 基因PCR 產物，回收后的目的片段與pMD-18-T 載體16℃過夜連接。其中連接體系：pMD-18-T 1 μL，膠回收產物4.0 μL，Solution I 5.0 μL。采用熱激法將過夜連接的產物轉化至DH5α 感受態細胞中，均勻涂布到含氨芐抗性的LB 培養基固體平板上，37 ℃倒置培養。隨機挑取單個陽性菌落接種于含氨芐抗性的LB 液體培養基中擴繁。提取質粒，雙酶切鑒定質粒，將酶切鑒定成功的質粒送至吉林庫美生物有限公司測序。測序鑒定后與河鱒fabp10 基因CDS 序列進行序列比對，匹配度高的克隆載體將其命名為pMD-18-T-fabp10。

1.3.4 虹鱒fabp10 基因真核表達載體構建

使用BamHⅠ和EcoRⅠ對pMD-18-T-fabp10和pcDNA3.1（+）進行雙酶切，膠回收fabp10 基因片段和線性化pcDNA3.1（+）。利用T4 DNA 連接酶進行連接，其中連接體系：T4 DNA 連接酶1 μL，fabp10 基因片段7 μL，線性化pcDNA3.1（+）1 μL，10×Buffer 1 μL，16℃連接過夜。隨后過夜連接的產物進行轉化、酶切鑒定（參照1.3.3），經測序鑒定后與河鱒fabp10 基因CDS 序列進行序列比對，匹配度高的真核表達載體命名為pcDNA3.1-fabp10。

1.3.5 生物信息學分析

利用NCBI 數據庫中Blast 功能對虹鱒fabp10基因編碼氨基酸序列進行同源性比對；使用在線軟件ProtParam（https://web.expasy.org/protparam/）和ProScale（https://www.expasy.org/resources/protscale）分 析fabp10 基因的基本理化性質，包括基因理論分子質量、編碼的氨基酸組成、等電點、疏水性等；利用在線軟件NetPhos3.1（http://www.cbs.dtu.dk/ services/NetPhos/）分析Fabp10 蛋白的潛在磷酸化位點；采用在線分析軟件TMHMM（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM）預測Fabp10 蛋白跨膜區；利用TargetP 1.1 Server（http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/）和PSORT Ⅱ（https://psort.hgc.jp/form2.html）預 測Fabp10 蛋白的亞細胞定位；利用在線分析軟件SOPMA（http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/）、SWISSMODEL（https://swissmodel.expasy.org/）預測虹鱒Fabp10 蛋白的二級、三級結構。

1.3.6 陽離子脂質體法轉染EPC 細胞

將EPC 細胞接種于6 孔板中，接種密度為7.5×105個/孔。轉染前將6 孔板中培養液更換成無抗生素的培養基，按照LipofectamineTM2000 試劑盒說明書進行操作轉染EPC 細胞。試驗設置pcDNA3.1-fabp10 轉染組與pcDNA3.1（+）處理組，分別在轉染24 h、36 h、48 h 后收集細胞，利用RT-qPCR檢測fabp10 基因的表達情況。

1.3.7 fabp10 在虹鱒組織中的分布與表達

采用Trizol 法提取虹鱒各組織中的總RNA，利用RT-qPCR 技術檢測不同組織fabp10 基因的轉錄活性，每個樣本重復3 次，以內參β-actin 矯正個體之間的差異，采用2-△△Ct方法進行數據分析。

1.4 統計分析

采用GraphPad prism 5.0 繪圖，利用SPSS 17.0對數據進行單因素方差分析（one-way ANOVA），實驗數據用“平均值±標準差”表示，差異顯著性水平P ＜0.05。

2 結果與分析

2.1 虹鱒fabp10 基因擴增

以虹鱒肝臟組織提取的RNA 為模板進行PCR擴增，經1.0%瓊脂糖凝膠電泳驗證，條帶大小約378 bp。測序結果經Blast 比對，目的片段與Gen-Bank 數據庫公布的預測的河鱒fabp10 基因CDS 區同源性高達100%，說明成功擴增出虹鱒fabp10 基因CDS 序列。與O.mykiss L-fabp 基因CDS 區同源性達99.47%，這一結果證實虹鱒fabp10 是一種肝臟型脂肪酸結合蛋白。

2.2 虹鱒fabp10 基因克隆載體與真核表達載體構建

經連接、轉化DH5α 感受態細胞，提取質粒，使用BamHⅠ和EcoRⅠ對虹鱒fabp10 基因的克隆載體pMD-18-T-fabp10 和真核表達載體pcDNA3.1-fabp10 進行雙酶切鑒定（圖1）。結果表明，酶切條帶符合預期片段大小，約為378 bp。

圖1 pcDNA3.1-fabp10 雙酶切驗證Fig.1 Double enzyme digestion of pcDNA3.1-fabp10

2.3 生物信息學分析

2.3.1 理化性質預測

虹鱒fabp10 基因分子式為C612H1003N163O194S6，總原子數1978，分子量為13.94 ku，理論等電點為8.53，不穩定指數（Instability index）為23.29，平均親水性（GRAVY）水平為-0.36，脂肪系數（Alippahtic index）為80.40。這一結果說明Fabp10 蛋白為相對穩定的脂溶性蛋白。

Fabp10 蛋白共包含18 種氨基酸，其中賴氨酸數量最高，為11.10%，其次是蘇氨酸（10.30%）、甘氨酸（7.90%）和絲氨酸（7.90%）。虹鱒Fabp10 蛋白中天冬氨酸與谷氨酸（負電荷氨基酸）總數量為16，精氨酸與賴氨酸（正電荷氨基酸）總數量為18（表2）。ProtScale 軟件預測分析，Fabp10 蛋白整個肽鏈中含有親水性和疏水性氨基酸，其中得分最大值為1.43（第116 氨基酸處）；最小值為-1.96（第43 個氨基酸處），氨基酸的負值分值相對較大，根據得分判定Fabp10 蛋白為疏水性蛋白（圖2）。通過TMHMM軟件分析預測，Fabp10 蛋白的1～126 位氨基酸位于細胞膜表面，其他位氨基酸未形成跨膜螺旋區。

表2 Fabp10 蛋白氨基酸組成Tab.2 Amino acids composition of Fabp10 protein in rainbow trout

圖2 虹鱒Fabp10 蛋白親水/疏水性分析Fig.2 Hydrophilic/hydrophobic analysis of Fabp10 protein in rainbow trout

2.3.2 蛋白磷酸化位點與亞細胞定位

運用在線軟件在虹鱒Fabp10 蛋白中共預測到23 個磷酸化位點，均為蘇氨酸磷酸化位點。TargetP軟件預測Fabp10 蛋白的分泌信號作用位點占比8.15%，其他占比91.85%。Fabp10 蛋白主要分布在細胞質中，其次分布在細胞核內，在線粒體、過氧化物酶體和液泡中也有分布（表3）。

表3 Fabp10 蛋白亞細胞定位Tab.3 Sub-cellular localization of Fabp10 protein in rainbow trout

2.3.3 Fabp10 二級、三級結構預測

SOPMA 在線分析軟件預測虹鱒Fabp10 蛋白18.25%可能性形成螺旋，38.89%可能性形成延伸鏈，8.73%可能性形成轉角，34.13%可能性形成無規則卷曲。該蛋白無二硫鍵的形成，且無特殊的二級結構。SWISS-MODEL 對Fabp10 蛋白三級結構的預測發現，該蛋白在二級結構基礎上進一步盤繞、折疊，依靠次級鍵形成了具有空穴的高級結構，而這種結構有利于與其配體分子結合，即可能是某些分子的結合位點（圖3）。

圖3 虹鱒Fabp10 蛋白三級結構預測Fig.3 Tertiary structure prediction of Fabp10 protein in rainbow trout

2.4 氨基酸序列同源性對比

基于20 個物種Fabp10 氨基酸序列，采用MEGA 6.0 軟件，利用N-J 法構建的系統進化樹顯示（圖4），虹鱒Fabp10 氨基酸序列與褐鼠（Rattus norvegicus）、人（Homo sapiens）Fabp 氨基酸序列同源性分別為29.10%和30.08%。進化樹中所有魚類聚為一大支，虹鱒Fabp10 氨基酸序列與大麻哈魚（Oncorhynchus kisutch）Fabp10 氨基酸序列、虹鱒（O.mykiss）L-Fabp氨基酸序列、大鱗大馬哈魚（O.tshawytscha）Fabp10 氨基酸序列、鯡形白鮭（Coregonus clupeaformis）Fabp10 氨基酸序列和白斑狗魚（Esox lucius）Fabp10 氨基酸序列聚為一支，其氨基酸序列同源性高達96%以上；與奧利亞羅非魚（Oreochromis aureus）、紅鰭東方鲀（Takifugu rubripes）、鱖（Siniperca chuatsi）、斑馬魚（Danio rerio）、鯉（Cyprinus carpio）等聚為一大支，其氨基酸序列同源性在80%以上。

圖4 不同物種Fabp10 氨基酸序列系統進化樹分析Fig.4 Phylogenetic tree of Fabp10 amino acid sequences among different species

2.5 pcDNA3.1-fabp10 的轉染

與對照組（pcDNA3.1 處理組）相比，轉染24 h、36 h、48 h 后虹鱒fabp10 基因的表達量均顯著升高（P＜0.05）。其中，在轉染36 h 時EPC 細胞中fabp10基因的表達量相對最高，為對照組的1848 倍。轉染48 h 后其表達量與36 h 相比顯著下降（P＜0.05）（圖5）。

圖5 不同轉染時間fabp10 基因的表達分析Fig.5 Analysis of fabp10 gene expression during the different transfection time

2.6 fabp10 在虹鱒組織中的分布與表達

如圖6 所示，除腸與脾臟fabp10 基因表達量差異不顯著外，各組織中fabp10 基因的相對表達量均差異顯著（P＜0.05）。fabp10 基因在肝臟中表達豐度最高，為84 798.03，隨之為腎臟、肌肉、腸、脾臟、心臟，在腦中表達量最低，而肝臟中fabp10 高水平的表達與肝臟行使虹鱒機體脂肪酸代謝密切相關。

圖6 虹鱒組織中fabp10 基因的表達量分析Fig.6 Analysis of fabp10 gene expression levels in rainbow trout

3 討論

20 世紀70 年代早期在哺乳動物中發現了能與長鏈脂肪酸結合的脂肪酸結合蛋白（Fabp）[12,13]。Fabps 家族成員眾多，具有一定的組織特異性，但種間同型的Fabps 具有較高的同源性，尤其是三維結構上的高度保守性[2]。本研究中系統進化分析結果顯示，哺乳動物Fabp10 蛋白聚為一大支，魚類聚為一大支，且虹鱒Fabp10 氨基酸序列與大麻哈魚、鯡形白鮭等硬骨魚類其氨基酸序列同源性較高。結合蛋白三級機構分析顯示，fabp10 基因在進化過程中具有較高的保守性。Fabps 的結構特點和組織器官的特異性決定了Fabps 在不同細胞內的生物功能。基因和氨基酸序列比對結果表明，虹鱒Fabp10 蛋白是一種肝臟型脂肪酸結合蛋白，推測其具有與L-Fabp相近的生物學功能。與其他類型脂肪酸蛋白不同，L-Fabp一般通過與兩個配體分子結合而行使其生物學功能[14]。例如，雞fabp10 基因通過與兩個配體分子結合而發揮調節脂肪酸的作用[7]。而Pietro等[15]發現，鯰（Rhamdia sapo）fabp10 基因則是與一個配體分子結合發揮其生物學活性，這種差異極有可能與蛋白的三級結構有關[16]。對蛋白的磷酸位點預測發現，Fabp10 蛋白有23 個磷酸化位點，而蛋白磷酸化對細胞信號傳導具有著重要作用。這說明Fabp10 很可能通過參與調節細胞信號傳導來影響宿主的生命過程。

本實驗構建了虹鱒fabp10 真核表達載體并轉染EPC 細胞，在不同轉染時間其表達量均顯著高于對照組，表明載體構建成功，為進一步研究Fabp10對脂肪酸的調控作用奠定了基礎。虹鱒fabp10 基因在肝臟中表達豐度最高，這可能與其具有調節脂肪酸代謝的功能有關。L-Fabps 負責脂質的吸收和轉運，在調節脂肪酸氧化、減少細胞氧化應激和影響細胞生長分化中發揮重要作用[17,18]。L-Fabp主要負責從血漿中攝取脂肪酸，快速在肝細胞內將其脂化成三酰基甘油和磷脂為宿主提供能量[19]。在細胞核中L-Fabp可直接與PPARα/PPARγ 等核受體相互作用[20]，通過激活Akt/mTOR/、Src/FAK/cdc42 等通路參與調控細胞內代謝與炎癥反應[21]。可見，虹鱒fabp10 基因具有調節宿主細胞脂質沉積和肝臟代謝的作用。此外，L-Fabp還可介導脂肪酸由胞質轉運至多種細胞器中，直接影響脂肪酸在線粒體或過氧化物酶體的β-氧化比率，調節機體的抗氧化水平[22]。定位分析發現，虹鱒Fabp10 不僅分布在細胞質中，還存在于細胞核、線粒體、過氧化物酶體等細胞器中，說明虹鱒Fabp10 具有緩解機體氧化應激損傷的能力。而Fabp10 的抗氧化水平主要與其蛋白結構中富含的半胱氨酸、甲硫氨酸有關。這些殘基具有調節巰基氧化還原反應，可提高谷胱甘肽的生成率[23]。綜上所述，fabp10 基因在虹鱒脂質代謝、炎癥反應等過程中發揮重要的作用。本研究在虹鱒fabp10 基因序列信息及其所編碼蛋白的結構上進行了初步研究，但fabp10 基因在虹鱒代謝與炎癥等反應中的作用仍需深入地探索與研究。