湖州河川沙塘鱧群體線粒體DNA cyt b 基因序列的遺傳多樣性分析

卞玉玲，劉士力，劉一諾，賈永義，李飛，遲美麗，鄭建波，程順，顧志敏

（1.上海海洋大學農業農村部淡水水產種質資源重點實驗室，上海 201306；2.浙江省淡水水產研究所，農業農村部淡水漁業健康養殖重點實驗室/浙江省淡水水產遺傳育種重點實驗室，浙江 湖州 313001；3.上海海洋大學上海水產養殖工程技術研究中心，上海 201306；4.上海海洋大學水產科學國家級實驗教學示范中心，上海 201306）

河川沙塘鱧（Odontobutis potamophila）屬于鱸形目（Perciformes）、虎魚亞目（Gobioidei），分布于錢塘江、黃河和長江中、下游等流域[1]。因其具有肉鮮味美、氨基酸含量豐富的特點，深受消費者的喜愛。為了滿足不斷增加的消費需求，野生沙塘鱧被過度捕撈，從而導致其數量銳減，IUCN（世界自然保護聯盟）紅色名錄將其評級為信息缺乏物種[2,3]。近年來，隨著苗種繁育技術的突破，為沙塘鱧規模化養殖打下了堅實的基礎[4]。目前，在我國已記載的沙塘鱧屬魚類共4 種，分別是中華沙塘鱧（O.sinensis）、河川沙塘鱧（O.potamophila）、鴨綠沙塘鱧（O.yaluensis）和海豐沙塘鱧（O.haifengensis）[5]。在水產行業中，線粒體DNA（Mitochondrial DNA,mtDNA）標記技術被廣泛應用于遺傳多樣性、親緣關系鑒定和種屬分類的研究。沙塘鱧具有較高的營養與經濟價值，通過線粒體cyt b 基因序列開展遺傳結構研究，對于種群的保護與良種選育具有重要意義。由于mtDNA 具有母系遺傳的特性，使其能夠作為分析群體遺傳進化的依據，又因進化速度快、拷貝數多、檢測方便等優點，為研究不同地理群體的水產動物種內及種間的生存狀態、遺傳變異，以及對將來的物種保護和環境調節奠定基礎。謝楠等[6]將擴增得到的河川沙塘鱧cyt b 基因序列與同科22 種魚的cyt b 基因進行比對，為沙塘鱧屬和塘鱧科魚類的系統分類提供依據。王丹等[7]以cyt b 基因對分布于珠江及長江的9 個野生中華沙塘鱧種群進行遺傳多樣性分析，基因流方向大致為長江流域種群流向珠江。張燁等[8]采用線粒體基因對安徽的4 個河川沙塘鱧群體進行評價，發現沙塘鱧群體間的分化程度較高。這些研究為沙塘鱧的種質資源開發與利用提供科學的考量。線粒體DNA 結構簡單，其序列變異速率遠高于核基因組，其中細胞色素b（cyt b）基因是mtDNA 自身編碼的為數不多的功能蛋白之一。Zardoya 等[9]研究發現，cyt b 的進化速率適中，替換、缺失和插入等突變能夠穩定持續遺傳，可適用于種間、種內的遺傳分析。本實驗將湖州2 個群體的線粒體細胞色素b（cyt b）基因全長進行擴增，并與GenBank 中的太湖、鄱陽湖和巢湖的數據進行比較分析，探究人工繁殖對河川沙塘鱧種質資源的影響，為沙塘鱧的良種選育、種質資源保護與開發提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 研究材料

實驗采用湖州野生群體和養殖群體各1 個，其中養殖群體為同塘養殖、同批繁殖的河川沙塘鱧群體，于2017 年6 月采自浙江省淡水水產研究所八里店綜合試驗基地；野生群體為同批捕撈，同期采自湖州鐘管鎮。每個群體取32 尾樣本，剪適量尾鰭組織，使用無水乙醇保存，儲存于4℃冰箱中。

1.2 方法

每個樣本取20～30 mg 尾鰭，采用酚-氯仿法[4]提取DNA，使用NanoDrop 2 000 測定DNA 原液濃度，并用瓊脂糖凝膠電泳檢測完整性，將其稀釋至25 ng/μL 左右，于-20℃保存備用。

1.3 cyt b 擴增程序及測序

cyt b 擴增和測序的引物為通用引物L14724 和H15915。L14724：5'-GACTTGAAAAACCACCGTTG-3'；H15915：5'-CTCCGATCTCCGGATTACAAGAC-3'，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。PCR 為25 μL 反應體系：上、下游引物（10 μmol/L）各1 μL，2×PCR Mix 12.5 μL，DNA 模板25 ng，雙蒸水補足體系。反應程序：94℃預變性5 min；94℃變性30 s，58.5℃退火30 s，72℃延伸2 min，共35 個循環；72℃延伸10 min。用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測產物品質，擴增產物由生工生物工程（上海）股份有限公司用正反引物進行雙向測序。測序后部分有雜峰的樣本，克隆后再次進行測序。

1.4 數據分析

用于比較分析序列的樣本來自太湖（GenBank登錄號：KM924270-KM924288）、鄱陽湖（登錄號：KM924241-KM924269）和巢湖（登錄號：KM924174-KM924199）。通過BioEdit 7.0 軟件對序列進行分析，應用Mega 6.0 軟件計算堿基含量，并采用鄰接法基于Kimura's 2-Parameter 模型建立系統進化樹，自舉檢驗值（Bootstrap）設置為1 000 次。運用DnaSP 5.0軟件計算單倍型數、單倍型多樣性指數（H）、變異位點、核苷酸多樣性指數（Pi）等，并檢驗中性分子進化演變，計算Tajima's D 和Fu's Fs 參數，以此推測群體的歷史演化。使用Arlequin 3.1 中的分子方差分析（AMOVA）法計算遺傳分化指數（Fst）。

2 結果與分析

2.1 河川沙塘鱧5 個群體線粒體DNA cyt b 區序列堿基組成

將湖州兩個群體的原始序列進行軟件比對和人工校對，發現八里店群體有7 個樣本線粒體DNA cyt b 存在不同拷貝現象，其中2 個樣本有1 個堿基缺失，5 個樣本存在雜合位點。5 個群體包含138 個樣本，對線粒體cyt b 1 141 bp 的DNA 序列基因進行了分析。結果顯示存在變異位點378 個，占分析位點的44.26%，含有241 個簡約信息位點，平均轉顛換比值（TS/TV）為0.76。4 種堿基在所得序列中平均含量為A（26.8%）、G（13.8%）、T（28.0%）和C（31.4%），其中G 的含量最低，A+T 含量為54.8%，明顯高于C+G 含量。

2.2 河川沙塘鱧5 個群體單倍型的發生關系

除去插入缺失的序列，在138 個個體中共定義了75 種單倍型，將分析的湖州群體單倍型序列提交GenBank，登錄序列號為：MF286741-MF286759。河川沙塘鱧群體的單倍型網絡中介圖如圖1 所示。湖州群體單倍型編號為（H1-H13），其中八里店群體具有10 種單倍型，鐘管群體具有9 種單倍型，這兩個群體共享6 種單倍型，與其余3 個群體不共享任何單倍型；太湖群體單倍型數量為11 種（H14-H24）；鄱陽湖群體單倍型數量為25 種（H25-H49）；巢湖群體擁有的單倍型最多，為26 種（H50-H75）。河川沙塘鱧單倍型具有明顯的分化，除八里店和鐘管群體具有共享單倍型外，其余群體都沒有共享單倍型，這可能是由于八里店為養殖群體，親本來源于鐘管群體的原因，因此，將其統歸為湖州群體，湖州群體位于網絡中介圖的中心區域，明顯分成2 個部分。鄱陽湖群體的單倍型具有3 個明顯分開的區域，太湖群體單倍型位于其中。巢湖群體位于另一端，呈樹枝狀分布。根據河川沙塘鱧單倍型的網絡中介圖，推斷cyt b 基因序列可以區分不同來源的群體。

圖1 河川沙塘鱧Cyt b 基因單倍型的網絡關系圖Fig.1 Median-joining network for sequence of Cyt b gene haplotypes of O.potamophila

2.3 河川沙塘鱧5 個群體線粒體DNA cyt b 基因遺傳結構分析

表2 河川沙塘鱧群體線粒體cyt b 基因序列分子方差分析Tab.2 Analysis of molecular variance（AMOVA）of part sequence of cyt b in O.potamophila

使用DnaSP 5.0 軟件計算河川沙塘鱧5 個群體的遺傳多樣性參數（表1），結果顯示：5 個群體的單倍型多樣性（0.869～1.000）較高，核苷酸多樣性（0.01431～0.03848）具有明顯分化。鄱陽湖和巢湖群體的單倍型多樣性接近或等于1，核苷酸多樣性約為太湖、八里店和鐘管群體的兩倍。其中巢湖群體的Pi值最高，為0.03848，鄱陽湖為0.03087。太湖和湖州的兩個群體明顯要低一些，為0.01431～0.01536。表明河川沙塘鱧5 個群體具有不同的遺傳多樣性。

表1 河川沙塘鱧群體cyt b 基因序列的遺傳多樣性參數Tab.1 Genetic diversity parameters of cyt b gene fragments in O.potamophila

5 個河川沙塘鱧群體線粒體DNA cyt b 基因序列的遺傳差異AMOVA 分析結果表明，群體間的遺傳分化指數Fst=0.48445（P＜0.01），整個遺傳變異中群體間占48.44%，其余的遺傳變異來自于群體內（51.56%），總體上，群體間具有較高程度的遺傳分化。

2.4 河川沙塘鱧5 個群體遺傳距離分析

通過Mega 6.0 軟件計算各地理種群間遺傳距離，所得結果見表3。由表3 可知，各群體間遺傳距離為0.01493～0.05868，遺傳距離差距較大。其中八里店與鐘管群體的遺傳距離最近，鄱陽湖與巢湖群體的遺傳距離最遠，構建的聚類圖上也表現相同趨勢（圖2）。運用Arlequin3.1 計算各群體間的Fst在-0.01821～0.68483，其中八里店和鐘管群體為負值，說明群體間基因交流頻繁，太湖與鄱陽湖群體間的Fst小于0.25，其余群體間的Fst都大于0.25。除去鐘管群體，八里店與其他群體間的Fst都在0.5 以上。八里店、鐘管、太湖、鄱陽湖和巢湖群體內遺傳距離分別為0.01468、0.01573、0.01449、0.03163 和0.03965。

表3 河川沙塘鱧5 個群體間的遺傳距離（對角線下方）和遺傳分化指數（對角線上方）Tab.3 Estimates of genetic distance（below diagonal）and genetic differentiation index Fst（above diagonal）among 5 populations of O.potamophila based on cyt b gene

圖2 基于線粒體cyt b 基因遺傳距離構建的鄰接樹Fig.2 NJ trees of haplotypes of O.potamophila based on part sequences of the Cyt b gene

2.5 河川沙塘鱧5 個群體動態分析

對河川沙塘鱧群體進行核苷酸不配對分布分析和Tajima's D 中性檢驗，結果顯示，河川沙塘鱧野生群體的單倍型檢測中，核苷酸不配對分布（mismatch distribution）呈現多峰型（圖3），雖然鄱陽湖群體和巢湖群體在中性檢驗中也呈現出Tajima's D 值為負值，但統計結果不顯著（P＞0.05）。八里店、鐘管和太湖的Tajima's D 及Fu's Fs 值均為正值，且較高，表明這些群體可能沒有經歷過種群擴張。5 個群體Tajima's D 和Fu's Fs 檢驗均不顯著（P＞0.01）。

圖3 河川沙塘鱧的核苷酸錯配分布圖Fig.3 The nucleotide mismatch distribution of O.potamophila

3 討論

作為生物多樣性的重要層次，遺傳多樣性是評價生物資源的重要依據，種群遺傳多樣性的度量和保護已成為對其生物資源進行評價的核心問題[10,11]。不了解重要種群的遺傳多樣性，就無法實現有針對性的科學保護和合理開發。種群內維持較高單倍型多樣性的主要原因包括種群數量的大小、環境的不均一性及具有適應種群快速增長的特性。與淮河野生鲇（Silurus asotus）[12]、黃顙魚（Pelteobagrus fulvidraco）[13]和烏鱧（Channa argu）[14,15]群體相比，河川沙塘鱧往往具有較高的單倍型多樣性（0.869～1.000），但其核苷酸多樣性（0.014 31～0.038 48）具有明顯分化，可能是由于沙塘鱧生活習性等原因，短期內序列變異達不到有效積累[16，7]。八里店、鐘管沙塘鱧群體表現出較高的單倍型多樣性、較低的核苷酸多樣性特征，符合魚類第2 種單倍型與核苷酸多樣性組合，高H 和低Pi類型[18]。鄱陽湖是我國第一大淡水湖，擁有較為發達的水系，因此，鄱陽湖沙塘鱧群體表現出豐富的遺傳多樣性，單倍型數量與核苷酸多樣性均較高，整體水平表現為高單倍型多樣性、高核苷酸多樣性特征。太湖河川沙塘鱧群體的H 較低、Pi為最低，這可能與采用的樣本量較少有關。

衡量種群多態性的重要指標包括種群間的遺傳距離以及Fst，多態性程度與這兩者存在相關性[19]。本文中，遺傳距離為0.01493～0.05868，差距較大，依據種群間的遺傳距離標準，由于八里店為養殖群體，親本來源于鐘管群體，二者親緣關系較近，與其他群體親緣關系較遠。種群間的遺傳距離分析與Fst的分析[20]結果相一致。基因流是指基因從一個種群轉移到另一個種群，其大小影響群體間的相似性程度，基因流越大，相似性越高[21]。沙塘鱧的游泳能力與遷移趨向較弱，地理隔離較明顯、遺傳變異較高，可能會降低群體間的基因交流，生活史與生態習性影響種群之間的遺傳變異狀況[22]。劉士力等采用線粒體16S rRNA 基因片段進行擴增，對建德、鐘管和八里店沙塘鱧群體進行遺傳分析，AMOVA 顯示群體間存在較高程度的遺傳分化，群體間的Fst為0.39347，超過0.25。侯新遠等[23]通過D-loop 基因分析25 種蝦虎魚類的遺傳距離和系統發育樹，獲得不同蝦虎魚類的親緣關系。郁建鋒等利用12S rRNA和16S rRNA 基因，分析福建與太湖的河川沙塘鱧，發現大量的變異位點和簡約位點，在分子水平上得出太湖沙塘鱧與其他地區沙塘鱧之間存在遺傳分化差異[24]，該線粒體基因的變異分化，推測與其生長習性相關。由于不同流域水產動物會形成地理隔離的狀態，因而不同水系間會產生顯著的種群分化[25]。

隨著數據庫中cyt b 基因序列數量的逐漸增多,cyt b 基因逐漸成為重要的分子標記之一[26]。目前，cyt b 基因被廣泛應用于物種鑒定[27-29]、遺傳結構分析[27-32]和系統發育研究[28,29]。對中國華南沿海的黃鰭棘鯛（Acanthopagrus latus）采用cyt b 基因進行分析時發現，海南至福建的8 個群體，共分為東、西兩組，320 尾個體共有62 種單倍型，其中7 種單倍型為所有群體共享[30]。采用線粒體cyt b 基因序列對西江流域廣西境內6 個江段139 尾卷口魚（Ptychidio jordani）進行遺傳多樣性分析時共定義20 個單倍型，其中Hap3 為優勢單倍型，存在于所有群體中，且占總個體數的39.57%[31]。在本實驗中，除了湖州的八里店與鐘管群體共享6 種單倍型外，其他群體間基本不共享單倍型。這可能是八里店養殖群體親本來源于鐘管野生群體的原因。不同種群間基因流動較少，這可能與河川沙塘鱧游泳力較弱相關。應用cyt b 基因可以明確地將湖州、太湖、鄱陽湖和巢湖群體之間區分開來。這與中國少鱗鱖（Coreoperca whiteheadi）類似，貴州省3 個中國少鱗鱖群體間不共享任何單倍型。中國少鱗鱖為溪澗性魚類，生存環境限制了其遷移能力，地理種群間的交流機會少，變異的積累導致了遺傳分化加大[32]。

綜上所述，本研究通過對河川沙塘鱧八里店和鐘管群體的cyt b 基因進行檢測，結合其他3 個河川沙塘鱧群體（太湖、鄱陽湖和巢湖）共同分析其遺傳多樣性及其可能的適應機制，為湖州河川沙塘鱧的種質資源分類評估、種群關系研究及長期穩定保護提供了重要的參考依據。