中性粒細胞、單核/巨噬細胞、淋巴細胞在腎纖維化發(fā)生發(fā)展中的作用研究進展

陳鳳，桂明，趙麗娟

中南大學(xué)湘雅三醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，長沙 410013

腎纖維化的發(fā)生與慢性腎臟病（CKD）進展及預(yù)后密切相關(guān)，成年CKD 的發(fā)病率為10%～13%。腎纖維化是導(dǎo)致腎功能逐漸喪失的主要因素［1］，腎纖維化過程主要有以下幾個步驟：①腎臟損傷引發(fā)的炎癥激活和免疫細胞浸潤；②生長因子、趨化因子和細胞因子等促纖維化介質(zhì)的釋放；③細胞外基質(zhì)（ECM）合成/降解不平衡，導(dǎo)致肌成纖維細胞（MF）激活和ECM 在腎小管間質(zhì)的過度積聚；④腎臟實質(zhì)細胞出現(xiàn)不可逆轉(zhuǎn)損傷，腎小管萎縮；⑤腎臟微血管減少、毛細血管稀疏［2-3］。腎早期纖維化病變并非均勻分布于整個腎實質(zhì)，而是從某些局部部位開始，形成微小的“纖維化生態(tài)位”，并伴隨對中性粒細胞、單核/巨噬細胞、淋巴細胞浸潤等［4-8］。本文對上述細胞在腎纖維化發(fā)生發(fā)展中的作用機制進行總結(jié)，為腎纖維化的發(fā)病機制及抗纖維化藥物的研發(fā)提供新思路。

1 中性粒細胞在腎纖維化發(fā)生發(fā)展中的作用機制

中性粒細胞在人類循環(huán)白細胞中占比為50%～70%，主要源于造血干細胞，在骨髓中發(fā)育成熟，由粒—單核祖細胞經(jīng)歷原始粒細胞和其他成熟階段粒細胞，最終發(fā)育成成熟的中性粒細胞。粒細胞集落刺激因子（G-CSF）主要負責(zé)中性粒細胞從骨髓中的發(fā)育、產(chǎn)生和釋放調(diào)控，G-CSF 通過下調(diào)趨化因子受體4（CXCR4）降低成熟中性粒細胞在骨髓中的殘留，并通過上調(diào)趨化因子受體2（CXCR2）促進成熟中性粒細胞自骨髓中釋放，維持中性粒細胞的保留/釋放平衡［9］。中性粒細胞在組織損傷以及免疫反應(yīng)過程中，經(jīng)過趨化作用會迅速遷移至炎癥發(fā)生部位，通過釋放活性氧（ROS）自由基、生成細胞因子和形成中性粒細胞胞外誘捕網(wǎng)（NETs）等機制而發(fā)揮作用［10-11］。

中性粒細胞是晚期腎纖維化中最常見的免疫細胞群之一［10-12］。既往研究表明，當(dāng)腎臟細胞受損時，會釋放損傷相關(guān)分子模式（damp），導(dǎo)致先天性免疫細胞浸潤，中性粒細胞釋放 ROS 和顆粒內(nèi)容物，從而直接損傷腎細胞，并產(chǎn)生大量促炎介質(zhì)來吸引和激活其他免疫細胞，間接損傷腎細胞［9］。 RYU 等［12］在慢性單側(cè)輸尿管梗阻（UUO）小鼠模型中發(fā)現(xiàn)，其受損的腎臟中含有大量的Siglec-F+中性粒細胞，主要來源于腎血管中的常規(guī)中性粒細胞，可以由轉(zhuǎn)化生長因子β1（TGF-β1）和粒細胞集落刺激因子（GCSF）誘導(dǎo)表達，而Siglec-F+中性粒細胞能通過產(chǎn)生TGF-β1、腫瘤壞死因子α（TNF-α）和白細胞介素1β（IL-1β）激活成纖維細胞，同時直接分泌膠原蛋白1（COL1A1）來促進腎纖維化；而后該研究進一步在局灶節(jié)段性腎小球硬化（FSGS）模型和腎缺血/再灌注損傷（IRI）模型上進行實驗，結(jié)果均發(fā)現(xiàn)有Siglec-F+中性粒細胞表達；進一步在數(shù)據(jù)庫中搜索，發(fā)現(xiàn)CKD 患者Siglec-8+（Siglec-F 的旁系同源物）中性粒細胞增加也可能與腎臟疾病惡化有關(guān)。此外，Siglec-F+中性粒細胞被證實參與了腎纖維化的發(fā)生， 但其激活成纖維細胞和直接分泌膠原蛋白1（COL1A1）兩種促纖維化機制究竟哪一種占據(jù)主導(dǎo)地位，目前暫無定論。且目前僅研究了亞群Siglec-F+中性粒細胞與腎纖維化的關(guān)系，其他亞群與腎纖維化的關(guān)系尚未可知。

此外，中性粒細胞參與纖維化的機制報道較多的是NETs［13］。NETs 是由活化的中性粒細胞分泌，是一種由DNA、組蛋白和抗菌蛋白組成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，NETs的形成往往會伴隨中性粒細胞的溶解性死亡，這種死亡過程被稱為“NETosis”。NETosis 主要有兩種模式，一種經(jīng)典途徑是指中性粒細胞的炎癥性死亡，也稱為自殺式NETosis，特點是NETs釋放伴隨中性粒細胞死亡，表現(xiàn)為細胞膜破裂、核脫落、核膜解體等，是目前研究的主要途徑；另一種非經(jīng)典途徑則是NETosis的非溶性形式，也叫做活體式NETosis，特點是中性粒細胞在釋放NETs后仍存活，染色質(zhì)以囊泡出芽的方式排出，細胞核膜、質(zhì)膜完整，留下活躍的無核中性粒細胞，繼續(xù)行使吞噬功能。目前非經(jīng)典途徑的具體機制以及生理意義尚未明確［10，14］。

雖然關(guān)于中性粒細胞參與CKD 的具體機制尚不明確，但目前已有研究報道NETosis 與腎臟上的膠原蛋白生成有關(guān)。有研究采用高糖誘導(dǎo)的NETs來干預(yù)人腎小管上皮細胞，結(jié)果顯示腎小管區(qū)域E-鈣黏蛋白（E-cadherin）表達下調(diào)、α-SMA 表達上調(diào)，并提示NETs可能通過介導(dǎo)腎小管間充質(zhì)轉(zhuǎn)化進程參與了糖尿病腎纖維化；而在長期給予低劑量雙酚A（BPA）的小鼠模型中，小鼠出現(xiàn)慢性腎功能下降，也出現(xiàn)了NETs 標志蛋白在腎小球的沉積，當(dāng)NETs 被脫氧核糖核酸酶Ⅰ （DNaseⅠ ）降解，雙酚A（BPA）誘導(dǎo)的足細胞損傷也得到緩解，提示NETs有可能在BPA 誘導(dǎo)的慢性腎損傷過程中具有重要作用［15］。而在自身免疫性腎病的發(fā)生過程中， NETosis參與腎纖維化的機制更為復(fù)雜，常常涉及到自身免疫性疾病中的抗體以及腎臟上的免疫復(fù)合物，當(dāng)自身抗體效應(yīng)機制未能及時消除NETs相關(guān)抗原時，就會發(fā)生炎癥組織損傷和細胞內(nèi)抗原釋放，免疫介導(dǎo)損傷后組織修復(fù)機制的激活又可導(dǎo)致纖維化的發(fā)生，并最終導(dǎo)致腎衰竭［9］。目前，NETs 與腎纖維化的研究仍處于起步階段。近來有文獻報道，在傷口修復(fù)的瘢痕組織內(nèi)NETs 浸潤增加，可能與Toll樣受體9（TLR9）/NF-κB/IL-6通路激活成纖維細胞，并通過IL-6促進膠原蛋白分泌有關(guān)［16］。但目前該通路與腎纖維化的關(guān)系暫無報道，未來或許可從這方面進行研究。

2 單核/巨噬細胞在腎纖維化發(fā)生發(fā)展中的作用機制

單核/巨噬細胞作為一種免疫細胞，隨著急性腎損傷向CKD 的進展也會發(fā)生表型轉(zhuǎn)換。單核/巨噬細胞是由單核細胞、巨噬細胞和樹突狀細胞組成的單核吞噬細胞系統(tǒng)，分為腎臟常駐單核吞噬細胞和循環(huán)系統(tǒng)來源的單核吞噬細胞。目前單核/巨噬細胞主要分為M1型和M2型單核/巨噬細胞兩類。M1型單核/巨噬細胞是促炎細胞，在急性腎損傷早期發(fā)揮作用，其表型特征多為CD38、CD80 等，當(dāng)腎損傷未解決且進行性加重時，開始出現(xiàn)M1 型向M2 型的轉(zhuǎn)化；M1 型單核/巨噬細胞表達的誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（NOS2 ）和基質(zhì)金屬蛋白酶12（MMP-12）減少，而隨著腎小球和間質(zhì)纖維化的不斷進展，M2 型單核/巨噬細胞表面的CD163和CD206表達增加［17］。

當(dāng)腎臟損傷未能得到控制或存在持續(xù)性炎癥反應(yīng)時， M2 型單核/巨噬細胞會被持續(xù)性激活，發(fā)揮抗炎、促進組織修復(fù)、血管再生、纖維化發(fā)生等功能。M2 型單核/巨噬細胞有三個亞群，即為M2a、M2b、M2c。M2a 型單核/巨噬細胞是由IL-4 和 IL-13誘導(dǎo)產(chǎn)生的，參與誘導(dǎo)抗炎TH2 樣免疫反應(yīng)，具有促進傷口愈合和組織纖維化的作用。免疫復(fù)合物誘導(dǎo)M2b 型單核/巨噬細胞參與免疫調(diào)節(jié)，并有助于TH2 的激活，IL-10、TGF-β 和糖皮質(zhì)激素均可誘導(dǎo)M2c 型單核/巨噬細胞的分化。M2c型單核/巨噬細胞有助于免疫抑制、基質(zhì)重塑和組織修復(fù)［17］。在CKD 的發(fā)生過程中，與纖維化密切相關(guān)的主要是表達 CD206 和（或）CD163 的M2 型單核/巨噬細胞。腎小球 CD163+M2 型單核/巨噬細胞的數(shù)量與腎小球硬化、間質(zhì)纖維化和腎小管萎縮相關(guān)，間質(zhì)中的CD163+M2 型單核/巨噬細胞存在于活動性纖維化區(qū)域，并產(chǎn)生結(jié)締組織生長因子［18］。而CD206+M2型單核/巨噬細胞的數(shù)量與亞臨床炎癥、腎小管損傷和纖維化進展相關(guān)［19］，并且M2 型單核/巨噬細胞產(chǎn)生的CC 家族趨化因子配體18（CCL18） 與進行性超濾失敗和腹膜纖維化相關(guān)［20］。

在腎纖維化的過程中，單核/巨噬細胞主要通過分泌細胞因子，促進成纖維細胞活化以及ECM 產(chǎn)生，或者通過單核/巨噬細胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)化而直接參與ECM的合成，涉及通路主要有Notch信號通路、TGF-β/Smad 信號通路、Wnt/β-連環(huán)蛋白信號通路等［19-22］。近來有學(xué)者提出，TGF-β1/Smad3 信號通路可以以酪氨酸蛋白激酶類（Src）為中心調(diào)節(jié)中樞，促進單核/巨噬細胞直接轉(zhuǎn)變?yōu)槭軗p腎臟內(nèi)的肌成纖維細胞（MMT），產(chǎn)生膠原蛋白并促進ECM 沉積，因此提出MMT 可能是慢性炎癥疾病進展為致病性纖維化的關(guān)鍵［17］。但單核/巨噬細胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的過程仍然存在爭議，原因之一是腎纖維化模型的骨髓譜系尚未確定單核/巨噬細胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，另外一個原因則是單核/巨噬細胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)化過程只能在伴有進行性腎纖維化的活動性炎癥病變中觀察到，而在急性炎癥或非進行性腎纖維化病變中卻很少見。因此，單核/巨噬細胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)化是否在急性腎損傷到CKD 的過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用仍不確定［23］。

除此之外，Wnt 作為通路之一有19 種亞型，單核/巨噬細胞聚集于再生的腎臟組織中可表達Wnt4、Wnt7b、Wnt10a 和Wnt10b，而絕大部分Wnt 主要是通過與TGF-β信號通路之間相互作用而促進纖維化進展。Wnt5a 可以增強 TGF-β 誘導(dǎo)的M2 型單核/巨噬細胞極化和Yes 相關(guān)蛋白（Yap）/具有PDZ結(jié)合基序的轉(zhuǎn)錄共激活因子（Taz）表達，從而促進腎纖維化。當(dāng)TGF-β1作用于骨髓衍生單核/巨噬細胞（BMDM），可發(fā)生單核/巨噬細胞轉(zhuǎn)化為MF，Wnt3a/β-連環(huán)蛋白信號通路相關(guān)蛋白表達升高，而當(dāng)敲除骨髓細胞中的Wnt3a，則可導(dǎo)致單核/巨噬細胞積累和M2 型單核/巨噬細胞極化減少，從而減輕UUO 小鼠模型的腎纖維化［22，24-25］。但KIEWISZ 等［26］認為，Wnt4 與腎纖維化無關(guān)。因此，上述指標與腎臟單核/巨噬細胞的關(guān)系仍有待研究。目前的研究并未闡明TGF-β 信號通路下游信號分子如Smad 家族是否參與了該過程，另外Wnt 信號與TGF-β 信號通路參與了MMT 的交流機制、以及Wnt信號通路調(diào)控腎纖維化過程中單核/巨噬細胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)化與上皮細胞相互作用的關(guān)聯(lián)性也值得繼續(xù)研究［25］。在腎纖維化的生態(tài)位早期，其細胞外基質(zhì)蛋白召集可溶因子如Wnt和TGF-β，從而創(chuàng)造出獨特的纖維化微環(huán)境。因此，Wnt、TGF-β 與早期炎癥細胞浸潤的關(guān)系更值得進一步研究。此外，Notch 信號通路可通過炎癥、TGF、間充質(zhì)轉(zhuǎn)化等機制在腎間質(zhì)纖維化、糖尿病腎病等腎臟疾病中發(fā)揮重要作用。Notch 信號通路與腎小管上皮細胞以及足細胞相關(guān)，共有3個亞型，對于這3個亞型是否與免疫細胞浸潤有關(guān)仍需進一步探討。

3 淋巴細胞在腎纖維化發(fā)生發(fā)展中的作用機制

T 淋巴細胞是細胞免疫中的主要效應(yīng)細胞，在腎臟疾病尤其是免疫介導(dǎo)性腎病的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用［27］。參與腎炎發(fā)生發(fā)展的主要是CD4+及CD8+T 淋巴細胞，而與腎纖維化相關(guān)的是CD4+T 淋巴細胞。淋巴細胞可被腎損傷信號激活分化為不同的Th 細胞，產(chǎn)生特定的細胞因子。T 淋巴細胞參與腎臟損傷的作用機制有：①淋巴細胞在腎組織內(nèi)聚集和活化，并通過細胞毒作用直接殺傷細胞；②通過趨化或激活單核/巨噬細胞和自然殺傷細胞，誘導(dǎo)遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)，造成腎臟損傷；③通過釋放腫瘤壞死因子等細胞因子，參與及擴大炎癥反應(yīng)。

CD4+T淋巴細胞的分化類群與免疫微環(huán)境的刺激密切相關(guān)，能分化成不同的細胞亞群并發(fā)揮不同作用。Th1、Treg 細胞發(fā)揮抗纖維化作用，Th2、Th17、Tfh細胞促進纖維化作用，NK細胞則具有雙重作用。Th2細胞在UUO小鼠模型中具有促腎纖維化作用，但在急性腎損傷中又發(fā)揮保護作用，故在急性腎損傷向CKD 轉(zhuǎn)換時，如何維持Th2 細胞平衡對于減輕腎纖維化可能具有一定的意義。Th17 細胞主要分泌IL-17，IL-17 不僅參與誘導(dǎo)中性粒細胞的動員和激活、還參與巨噬細胞介導(dǎo)的組織損傷，導(dǎo)致組織炎癥損傷加重。在腎梗阻模型中，IL-17A 通過促進趨化因子RANTES表達，介導(dǎo)腎臟組織中白細胞、巨噬細胞浸潤，從而促進腎纖維化，當(dāng)使用IL-17A拮抗劑阻斷后纖維化程度減輕。但也有學(xué)者認為，IL-17A 拮抗劑對嚴重缺血再灌注損傷后的腎纖維化無效，這可能與缺血再灌注損傷的程度有關(guān)。因此，IL-17A 細胞因子家族抑制劑是否可以應(yīng)用于腎纖維化的治療還有待探索，而IL-17家族中的其他細胞因子亞型和CKD 的具體發(fā)病過程也需要進一步研究。

Treg 細胞占 CD4+T 淋巴細胞總數(shù)的 5%～10%，具有抗炎、抗纖維化作用，Treg 細胞缺失會促進炎癥反應(yīng)和急性腎小管壞死，加劇腎功能下降。研究表明，在腎臟缺血再灌注損傷的早期階段，Treg細胞通過產(chǎn)生IL-10發(fā)揮抗炎效應(yīng)，而在缺血性和腎毒性急性腎損傷過程中，Treg 細胞的早期浸潤可以延緩?fù)砥诶w維化進展，其抗纖維化作用已經(jīng)通過CCL20 阻斷劑、間充質(zhì)干細胞—細胞外囊泡等的驗證［28］。Th22 細胞則與慢性腎炎的嚴重程度呈正相關(guān)關(guān)系。在尿毒癥患者中，Th22 細胞與微炎癥狀態(tài)相關(guān)，但其與腎纖維化的關(guān)系以及作用機制暫不明確［29］。其他淋巴細胞，如Th9 細胞、先天淋巴細胞、雙陰性T 淋巴細胞、CD8+T 淋巴細胞、黏膜相關(guān)性T淋巴細胞、B 淋巴細胞等均可參與了腎纖維化的發(fā)生過程。

綜上所述，中性粒細胞參與腎纖維化的機制報道較多的是NETs，多伴隨中性粒細胞的溶解性死亡；單核/巨噬細胞主要是M2 型單核/巨噬細胞參與腎纖維化的發(fā)生，其通過復(fù)雜的信號通路，激活成纖維細胞及間充質(zhì)轉(zhuǎn)化來參與ECM 合成，從而促進腎纖維化的發(fā)展；T 淋巴細胞作為細胞免疫中的主要效應(yīng)細胞，在纖維化的發(fā)展過程中兼具雙重作用，這其實與T 淋巴細胞的不同亞型有關(guān)。總體來說，在腎纖維化損傷的不同階段參與的細胞及其發(fā)揮的作用目前仍不清楚，未來仍需進一步探索。