嘧菌酯處理后煙葉葉際微生物在不同時期的響應

吳小軍 汪漢成 劉亭亭 蔡劉體 孟建玉 彭麗娟

摘要：為研究煙葉不同部位葉際微生物群落在嘧菌酯處理后不同時期的變化規律，采用高通量測序和Biolog代謝表型技術分別測定了煙葉不同部位葉際微生物在嘧菌酯處理前后不同時期的群落結構、多樣性及代謝功能。結果表明，相較于處理前，250 g/L嘧菌酯SC（0.15 kg a.i./hm2）處理后0～15 d內，葉際真菌群落中，感病與健康煙葉葉際優勢真菌屬種類均增加。感病煙葉葉際鏈格孢屬、殼多孢菌屬和莖點霉屬相對豐度均先增加后降低；枝孢霉屬、亞隔孢殼屬和Symmetrospora則先降低后增加。健康煙葉葉際鏈格孢屬、枝孢霉屬、亞隔孢殼屬和Symmetrospora相對豐度均先降低后增加；殼多孢菌屬、假絲酵母屬、浪梗霉屬和蠟殼菌屬則先增加，并在處理后5 d時成為新的優勢菌屬。在細菌群落中，感病與健康煙葉葉際泛菌屬、馬賽菌屬和鞘脂單胞菌屬相對豐度均持續降低，感病煙葉葉際的假單胞菌屬、乳桿菌屬、腸桿菌屬和甲基桿菌屬豐度先增加后降低。感病煙葉葉際真菌群落多樣性和豐富度持續增加，細菌群落多樣性先增加后降低，豐富度先降低后增加；健康煙葉葉際真菌群落多樣性和豐富度先增加后降低，細菌群落多樣性先降低后增加，豐富度先增加后降低。嘧菌酯處理后5 d時對感病煙葉葉際微生物的碳源代謝抑制作用較健康煙葉弱，但10 d時則均表現出較強抑制作用。研究結果揭示了嘧菌酯施用后15 d內煙葉葉際真菌和細菌群落結構、多樣性及代謝功能的時序變化規律，為了解嘧菌酯防控煙草赤星病的微觀作用機制提供參考依據。

關鍵詞：嘧菌酯；煙草赤星病；群落結構；代謝功能；微生物多樣性

中圖分類號：S182；S435.72? 文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2023）24-0123-10

煙草（Nicotiana tabacum L.）是一種重要的經濟作物，煙草赤星病（tobacco brown spot）是國內外煙葉生產中危害較大的真菌性病害，易在上部葉成熟期暴發，病斑呈黃褐色，具明顯同心輪紋［1-2］。該病害病原菌為鏈格孢屬（Alternaria sp.）真菌，目前已報道的病原物種類有Alternaria alternata、A. longipes和A. tenuissim等［3-4］。當前，甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑嘧菌酯（azoxystrobin）在我國部分煙葉產區用于煙草赤星病防治，該藥劑主要作用于細胞色素Bcl向細胞色素c的電子轉移，抑制病菌線粒體的呼吸作用，從而達到對病菌的殺滅作用；對子囊菌門、擔子菌門和卵菌綱的多種病原菌均有較強的殺菌效果，在防治真菌性病害方面具有較大應用前景［5-8］。

近年來，國內已有關于嘧菌酯及其復配劑防控煙草赤星病的報道。Wang等研究發現嘧菌酯0.094、0.190、0.280 kg a.i./hm2施用3次后，對煙草赤星病防效可達86.00%～89.67%［9］。陳杰等報道32.5%（苯醚甲環唑+嘧菌酯）懸浮劑對煙草赤星病防效可達83.84%［10］。煙草葉斑類病害發生與葉際微生物群落結構和代謝功能變化密切相關。劉暢等研究發現，煙草赤星病煙葉葉際優勢真菌屬為鏈格孢屬［11］，優勢細菌屬為泛菌屬（Pantoea）［12］。Dai等研究發現，煙葉在感染煙草赤星病后其葉際鏈格孢屬隨病情的發展相對豐度增加，微生物群落結構呈復雜的動態變化，且對碳源的利用率降低［13］。病害防治過程中施用的化學藥劑能有效改善植物葉際菌群結構。Qin等研究發現，噴施生防菌劑可改善煙草葉片微生物群落結構并有效防治煙草野火病［14］。劉天波等研究發現，拮抗菌群處理煙葉后其葉際假單胞菌屬（Pseudomonas）和寡氧單胞菌屬（Stenotrophomonas）等菌屬相對豐度顯著改變，群落多樣性增加［15］。Chen等研究發現噴施菌核凈后煙葉葉際鞘脂單胞菌屬（Sphingomonas）、寡養單胞菌屬和沙雷氏菌屬（Serratia）等細菌相對豐度降低［16］。當前，嘧菌酯防控煙草赤星病的效果多是基于病情指數的宏觀評價，缺乏從微觀層面分析嘧菌酯對葉際微生物的影響，特別是藥劑施用后一定時期內煙草葉際微生物群落結構與代謝功能的時序性變化規律缺乏認識。因此，本研究采用高通量測序和Biolog代謝表型技術分別測定了嘧菌酯藥劑施用后不同時期煙葉不同部位葉際微生物的群落結構、多樣性及代謝功能，從微觀層面揭示嘧菌酯施用后煙葉組織微生態的變化規律，以期為煙草赤星病的精準化學防控提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試煙草品種、藥劑及試驗器材

供試煙草品種為云煙105，供試藥劑為250 g/L嘧菌酯懸浮劑（SC），購自先正達南通作物保護有限公司。DNA提取試劑盒（Fast DNA Spin Kit for Soil），購自MP Biomedicals生物醫學公司；Ion Plus Fragment Library Kit 48 rxns建庫試劑盒（貨號：4471252）和GeneJET膠回收試劑盒（貨號：K0691），均購自Thermo Fisher Scientific公司（美國）；Biolog ECO代謝板（貨號：#1056），購自Biolog公司（美國，CA，Hayward）。背負式電動噴霧器（型號：3WBD-20L），購自超農力智慧科技有限公司（浙江，中國）；自動氣象站［由雨量計（MC-YL）、溫度計（MC-KWS）和濕度計（MC-KWS）等組成］，購自北京新紅科技有限公司。

1.1.2 試驗時間及地點

試驗于2020年8月29日至9月16日在貴州省畢節市威寧縣黑石頭鎮煙區進行，選擇明顯感染煙草赤星病的煙田開展試驗。

1.2 試驗設計

1.2.1 藥劑處理

本試驗采取隨機區組設計，各小區隨機排列，小區內煙株長勢一致且煙葉發病情況基本一致。每個小區80株煙，小區四周設保護行。嘧菌酯制劑的用量為40 g/666.67 m2（0.15 kg a.i./hm2），用水量為60 L/666.67 m2，使用背負式噴霧器對煙株正、反葉面進行均勻噴施，以見藥液均勻分布至煙葉正反面為準。

1.2.2 環境因子與病情指數的調查

使用自動氣象站調查并記錄試驗點的環境因子（降水量、溫度、空氣相對濕度）。同時分別在處理前（0 d），處理后5、10、15 d各小區內隨機選取10株煙調查煙葉的發病情況，計算病情指數［17］。

1.2.3 樣品采集

于處理前0 d及處理后5、10、15 d，分別在經嘧菌酯處理的3個小區內隨機取樣，用經消毒的剪刀剪取中上部煙葉的感病部位與健康部位煙葉樣品（10 g），分別裝入50 mL無菌離心管中，將從同一小區內采集的感病與健康煙樣分別混合作為感病組與健康組中1個處理，每個處理3次重復，以感病組與健康組之間互為對照。樣品采集后放入低溫保存箱，并迅速帶回實驗室，一部分用于代謝功能研究（5 g），另一部分放置-80 ℃冰箱保存用于擴增子測序，樣品編號詳情見表1。

1.2.4 煙草葉際微生物基因組測序分析

參照DNA提取試劑盒說明對不同時期所取煙葉樣品中微生物基因組DNA進行提取，用瓊脂糖凝膠電泳檢測其純度和濃度。再將提取的DNA用無菌水稀釋至濃度為1 ng/μL，并以此為模板，分別使用真菌引物ITS1-1F-R（5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′）和ITS1-5F-F（5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′）及細菌引物806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）和515F（5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′），參照Huang等的PCR擴增體系及程序對所取樣品真菌ITS1區域與細菌V4區域進行擴增［18］。參照Dai等的方法［13，19］進行測序分析，樣品中真菌、細菌分別與Unit（v7.2）和SSUrRNA數據庫比對注釋，并且對數據進行均一化處理，分析各樣本在門屬水平上的群落組成；使用Qiime軟件計算α多樣性指數，使用corr.test函數計算環境因子與微生物α多樣性及物種間的相互變化關系數值并進行Spearman分析，此過程在北京諾禾致源科技股份有限公司完成。原始測序數據上傳至GenBank（BioProject ID：PRJNA882617、Biosample accession ID：SUB12086680和BioProject ID：PRJNA882598、Biosample accession ID：SUB120 85061）。

1.2.5 煙草葉際微生物碳源代謝功能分析

分別取不同時期感病與健康混合煙樣各2 g，分別置于盛有100 mL 0.8%無菌生理鹽水的300 mL三角瓶中，在28 ℃、180 r/min振蕩2 h，將振蕩液靜置 30 min。用移液槍吸取100 μL上清液加入到ECO代謝板的測試孔中，將接完菌的ECO代謝板密封并置于OmniLog恒溫培養箱中28 ℃下培養7 d。使用Biolog D5E_OKA_data.exe軟件收集該過程中代謝孔內顏色變化值，使用HemI軟件根據代謝孔顏色變化值制作熱圖分析，對不同時期煙葉樣品的微生物代謝功能進行分析。

1.3 數據處理及統計分析

使用DPS 7.5與Excel 2017軟件進行數據處理及統計分析。

2 結果與分析

2.1 環境因子及病情指數

試驗開展期間該地區大部分時間有小雨。自動氣象站測量結果顯示，在處理前0 d及處理后0～[JP3]5、5～10、10～15 d的日平均降水量（R）分別為13.60、19.00、11.3、25.4 mm；日平均氣溫（T）分別為18.32、18.97、17.51、16.54 ℃；日平均空氣相對濕度分別為82.49%、83.81%、78.99%和90.98%。處理前 0 d 及處理后5、10、15 d的病情指數（DI）分別為44.44、48.14、63.58、70.55；處理后5、10、15 d的相對防效分別為81.75%、53.93%和54.95%（表2）。

2.2 煙草葉際真菌和細菌群落結構

2.2.1 OTU聚類

Venn圖分析結果表明，在OTU水平，感病與健康煙葉葉際真菌群落共有的OTU數分別為15、25種（圖1-A、圖1-B），葉際細菌群落共有的OTU數分別為9、5種（圖1-C、圖1-D）。感病與健康煙葉葉際共有的真菌屬為鏈格孢屬、亞隔孢殼屬（Didymella）、枝孢霉屬（Cladosporium）和附球菌屬（Epicoccum）等，而健康煙葉葉際特有的真菌屬為尾孢屬（Cercospora）、盤菌屬（Botryotinia）和黑團孢屬（Periconia）等，感病與健康煙葉葉際共有的細菌屬為泛菌屬，感病煙葉特有的細菌屬為假單胞菌屬、鞘脂單胞菌屬和腸桿菌屬（Enterobacter）等。在處理前0 d和處理后5、10、15 d，感病煙葉葉際真菌群落特有的OTU數分別為8、4、10、48種；細菌群落特有的OTU數分別為12、4、143、32種。健康煙葉葉際真菌特有的OTU數分別為38、75、45、39種；細菌群落特有的OTU數分別為15、5、100、80種。以上結果表明，感病煙葉葉際真菌群落共有OTU數低于健康煙葉；細菌群落共有OTU數高于健康煙葉。嘧菌酯處理后感病煙葉葉際真菌群落特有OTU數均呈先降低后增加趨勢；健康煙葉葉際真菌群落特有OTU數呈先增加后降低趨勢，感病與健康煙葉葉際細菌群落特有OTU數均呈先降低后增加再降低趨勢。

2.2.2 煙草葉際真菌和細菌門水平群落結構

在真菌群落門水平上，處理前0 d，感病（AJB0）與健康（AJJ0）煙葉葉際優勢真菌門均為子囊菌門（Ascomycota，93.38%和62.84%）和擔子菌門（Basidiomycota，2.63%和6.74%）。在處理后5、10、15 d，感病煙葉葉際子囊菌門和擔子菌門相對豐度分別為92.52%和1.04%、92.43%和1.75%、80.61%和3.83%；健康煙葉葉際子囊菌門和擔子菌門相對豐度分別為66.27%和3.74%、61.55%和2.24%、50.86%和5.21%。其中，在處理前，感病煙葉葉際擔子菌門相對豐度均明顯低于健康煙葉，而在處理前后不同時期，感病煙葉葉際子囊菌門相對豐度均明顯高于健康煙葉（圖2-A）。

在細菌群落門水平上，處理前0 d，感病（AJB0）煙葉葉際優勢細菌為變形菌門（Proteobacteria，38.38%）；健康（AJJ0）煙葉葉際優勢細菌為變形菌門（6.96%）和厚壁菌門（Firmicutes，16.05%），其中，感病煙葉葉際變形菌門相對豐度顯著高于健康煙葉。在處理后5、10、15 d，感病煙葉葉際變形菌門相對豐度分別為32.66%、12.79%和34.90%；健康煙葉葉際變形菌門和厚壁菌門相對豐度分別為4.60%和0.11%、2.24%和0.79%、12.35%和6.85%；感病煙葉葉際厚壁菌門（2.24%）在處理后10 d增加成為優勢細菌門，其在處理后15 d相對豐度為12.01%。處理前0 d和處理后5、10 d，感病煙葉葉際變形菌門相對豐度顯著高于健康煙葉（圖 2-B）。

2.2.3 煙草葉際真菌和細菌屬水平群落結構

在真菌群落屬水平，在處理前0 d和處理后5、10、15 d，感病煙葉葉際優勢真菌及相對豐度分別為鏈格孢屬（84.10%、86.61%、67.80%和73.84%）、枝孢霉屬（6.62%、2.21%、1.07%和2.21%）、殼多孢菌屬（Stagonosporopsis，0.43%、0.86%、10.60%和0.55%）、莖點霉屬（Phoma，0.00%、0.46%、6.10%和0.06%）和Symmetrospora（2.27%、1.04%、1.16%和3.58%），健康煙葉葉際優勢真菌及相對豐度分別為鏈格孢屬（35.66%、25.92%、49.30%和39.49）、枝孢霉屬（14.83%、10.05%、2.76%和2.27%）、亞隔孢殼屬（Didymella，2.67%、1.04%、1.32%和0.89%）、殼多孢菌屬（0.55%、2.94%、2.33%和0.52%）、假絲酵母屬（Candida，0.00%、0.77%、1.99%和11.12%）、浪梗霉屬（Polythrincium，0.00%、6.99%、0.00%和0.00%）、Symmetrospora（5.61%、1.56%、2.02%和4.69%）、蠟殼菌屬（Sebacina，0.00%、1.10%、0.00%和0.00%）和Diutina（0.00%、0.15%、0.31%和1.38%）（圖3-A）。其中，在處理前后各個時期，感病煙葉葉際鏈格孢屬相對豐度均明顯高于健康煙葉；在處理后5 d，健康煙葉葉際假絲酵母屬、浪梗霉屬和蠟殼菌屬相對豐度顯著高于感病煙葉以及其他各個取樣時期的健康煙葉；在處理前0 d，健康煙葉葉際亞隔孢殼屬和枝孢霉屬相對豐度明顯高于感病煙葉以及處理后10、15 d的感病煙葉。

在細菌群落屬水平，在處理前0 d和處理后5、10、15 d，感病煙葉葉際優勢細菌及相對豐度分別為泛菌屬（22.78%、5.95%、3.59%和10.77%）、假單胞菌屬（5.61%、20.76%、1.57%和0.56%）、鞘脂單胞菌屬（6.17%、1.57%、0.67%和0.11%）和馬賽菌屬（Massilia，2.13%、1.35%、0.56%和0.00%）、甲基桿菌屬（Methylobacterium，0.00%、0.00%、3.14%和0.11%）、乳球菌屬（Lactococcus，0.00%、0.00%、1.57%和11.56%）和腸桿菌屬（Enterobacter，0.22%、0.79%、1.01%和6.06%），健康煙葉葉際優勢細菌屬為泛菌屬（6.73%、0.56%、0.45%和3.37%）、魏斯氏菌屬（Weissella，15.38%、0.00%、0.00%和0.00%）、乳球菌屬（0.00%、0.00%、0.45%和5.16%）和腸桿菌屬（0.00%、0.22%、0.45%和3.82%）（圖3-B）。其中，處理前0 d，健康煙葉葉際魏斯氏菌屬明顯高于健康煙葉以及其他各個取樣時期的健康煙葉；處理后5 d感病煙葉葉際假單胞菌屬明顯高于健康煙葉以及其他各個取樣時期的感病煙葉。

2.3 煙草葉際真菌和細菌α多樣性

本研究所測感病與健康煙葉樣品中葉際真菌和細菌的覆蓋度指數均大于0.82，表明本次樣品的

測序結果能夠合理反映其葉際微生物的多樣性。嘧菌酯處理后，感病與健康煙葉葉際微生物多樣性（香濃指數）與豐富度（Chao1與ACE指數）指數均不同程度發生改變（表3）。于真菌方面，在處理前 0 d，感病（AJB0）煙葉葉際真菌多樣性和豐富度指數均顯著低于健康煙葉（AJJ0）（P<0.05，下同）。在處理后0～15 d，感病（AJB）煙葉葉際真菌多樣性指數呈先降低后增加趨勢，豐富度指數呈持續增加趨勢；健康（AJJ）煙葉葉際真菌多樣性指數呈先增加后降低再增加趨勢，豐富度指數呈先增加后降低趨勢。其中，在處理后5、10、15 d，感病煙葉葉際真菌群落多樣性指數均顯著低于健康煙葉；在處理后5、10 d，感病煙葉葉際真菌豐富度指數均顯著低于健康煙葉。

細菌方面，在處理前0 d，感病煙葉葉際細菌多樣性和豐富度指數均高于健康煙葉，但差異不顯著。在處理后0～15 d，感病煙葉葉際細菌多樣性指數呈先增加后降低趨勢，豐富度指數呈先降低后增加再降低趨勢；健康煙葉葉際細菌多樣性指數呈先降低后增加趨勢，豐富度指數呈先增加后降低趨勢。其中，在處理后5、10、15 d，感病煙葉葉際細菌多樣性指數均高于健康煙葉，在處理后5、10 d，感病煙葉葉際細菌豐富度指數均高于健康煙葉，在處理后15 d，感病煙葉葉際細菌豐富度指數低于健康煙葉，但差異均不顯著。

2.4 Spearman相關性

本研究對樣品的取樣時間、環境因子（平均溫度、相對濕度、降水量）及病情指數與其葉際top50的菌屬進行Spearman相關分析，來研究環境因子與微生物α多樣性和物種之間的相互變化關系。結果表明，在真菌屬水平，取樣時間與伊薩酵母屬（Issatchenkia）相對豐度呈顯著正相關，與靈芝屬（Ganoderma）相對豐度呈極顯著正相關，與Hannaella相對豐度呈顯著負相關。降水量與Filobasidium相對豐度呈顯著負相關。溫度與靈芝屬相對豐度呈極顯著負相關。病情指數與鏈格孢屬相對豐度呈極顯著正相關，與亞隔孢殼屬、黑團孢霉屬（Periconia）、尾孢菌屬、鐮刀菌屬（Fusarium）相對豐度呈極顯著負相關，與曲霉屬（Aspergillus）、殼二孢屬（Ascochyta）、小不整球殼屬（Plectosphaerella）及雙足囊菌屬（Dipodascus）相對豐度呈顯著負相關（圖4-A）。

在細菌屬水平，取樣時間與乳球菌屬和腸桿菌屬相對豐度呈極顯著正相關，與腸球菌屬（Enterococcus）和Serratia相對豐度呈顯著正相關，與魏斯氏菌屬相對豐度呈顯著負相關。降水量和空氣相對濕度均與果膠桿菌屬（Pectobacterium）相對豐度極顯著正相關，與腸球菌屬和Serratia相對豐度呈顯著正相關，與擬桿菌屬（Bacteroides）相對豐度呈極顯著負相關，與Alloprevotella相對豐度呈顯著負相關。溫度與乳球菌屬相對豐度呈極顯著負相關，與腸桿菌屬、Serratia和腸球菌屬相對豐度呈顯著負相關。病情指數與馬賽菌屬和假單胞菌屬相對豐度呈顯著正相關（圖4-B）。

2.5 煙草葉際微生物碳源代謝

Biolog ECO代謝板中含有可供自然界中大部分微生物利用的碳源物質，其中包括氨基酸、有糖類和羧酸類等共31種碳源。嘧菌酯對感染煙草赤星病煙葉葉際微生物代謝功能的影響如圖5所示，在處理前，感病（AJB0）煙葉葉際微生物可高效代謝（顏色值變化值>200）除α-丁酮酸（α-ketobutyric acid）及L-蘇氨酸（L-threonine）外的29種碳源，健康（AJJ0）煙葉葉際微生物可高效代謝除α-丁酮酸外的30種碳源。

在嘧菌酯處理后的5、10、15 d內，感病與健康煙葉葉際微生物對31種碳源代謝均受到不同程度抑制。在感病煙葉葉際微生物代謝方面，處理后 5 d，其葉際微生物（AJB1）可高效代謝26種碳源，主要包括N-乙酰-D-葡萄糖胺（N-acetyl-D-Glucosamine）、D-葡萄糖胺酸（D-galacturonic acid）和L-苯基丙氨酸（L-phenylalanine）等，5種碳源代謝受到抑制，包括D-木糖（D-xylose）、α-丁酮酸和I-赤蘚糖醇（I-erythritol）等；處理后 10 d，其葉際微生物（AJB2）的代謝功能進一步受到抑制，無可高效代謝的碳源；處理后15 d，其葉際微生物（AJB3）的大部分代謝功能恢復，可高效代謝28種碳源，包括D-半乳糖酸內酯（D-galactonic acid lactone）、4-羥基苯甲酸（4-hydroxy benzoic acid）和L-天冬酰胺酸（L-asparagine）等，代謝仍受到抑制的碳源有D-木糖、2-羥基苯甲酸（2-hydroxy benzoic acid）及4-羥基苯甲酸。

在健康煙葉葉際微生物代謝方面，處理后5 d，其葉際微生物（AJJ1）可高效代謝11種碳源，包括 β-甲基-D-葡萄糖苷（β-methyl-D-glucoside）、D-葡萄糖胺酸和γ-羥基丁酸（γ-hydroxybutyric acid）等，對20種碳源代謝受到抑制，包括丙酮酸甲酯、2-羥基苯甲酸和α-丁酮酸等；處理后10 d，其葉際微生物（AJJ2）的代謝功能進一步受到抑制，僅可高效代謝L-天冬酰胺酸和 D-[JP+1]蘋果酸（D-malic acid）2 種碳源，29種碳源代謝受到抑制；處理后15 d，其葉際微生物（AJJ3）代謝功能大部分恢復，可高效代謝除α-丁酮酸、4-羥基苯甲酸、D-木糖、2-羥基苯甲酸4種碳源外的27種碳源。

3 討論與結論

煙草葉斑類病害的發生與其葉際微生物群落結構密切相關，煙葉發病后其葉際菌群落結構隨之發生改變［20］。本研究發現，嘧菌酯處理前，感病與健康煙葉葉際優勢真菌均為鏈格孢屬、枝孢霉屬和Symmetrospora等，優勢細菌均為泛菌屬。結果與劉暢等關于煙草赤星病煙葉葉際優勢真菌和細菌報道結果類似［11-12］，進一步驗證鏈格孢屬為感赤星病煙葉葉際絕對優勢菌屬。本研究發現煙葉葉際還存在另一種葉斑病病原菌亞隔孢殼屬［18］。嘧菌酯處理后0～15 d內，感病煙葉葉際鏈格孢屬、殼多孢菌屬和莖點霉屬相對豐度先增加后降低，枝孢霉屬、亞隔孢殼屬和Symmetrospora相對豐度先降低后增加，健康煙葉葉際鏈格孢屬、枝孢霉屬、亞隔孢殼屬和Symmetrospora相對豐度均先降低后增加，殼多孢菌屬、假絲酵母屬、浪梗霉屬和蠟殼菌屬相對豐度先增加后降低。此結果與何濤等報道施用烯酰嗎啉后葡萄葉際白粉菌屬和赤霉屬等真菌屬豐度上升，枝孢屬和鏈格孢屬等真菌屬豐度下降類似［21］。化學藥劑的使用是植物葉際微生物群落結構改變的一個重要影響因素［22］。本研究中，嘧菌酯處理后煙葉葉際致病菌鏈格孢屬和亞隔孢殼屬等多個病原菌菌屬較長時間內處于較低豐度，表明該藥劑對多種煙草葉斑病害均有較好防效，同時也進一步說明了該藥劑的廣譜性和持效性［23-24］。此外，本研究還發現在處理后5 d煙葉葉際殼多孢菌屬、假絲酵母屬、浪梗霉屬和蠟殼菌屬相對豐度顯著增加。有研究報道，自然界有部分特殊微生物能夠降解農藥并利用農藥作為營養物質進行生長［25］。微生物群落生物量增加后可通過拮抗和競爭等作用機制抑制病菌生長［22］。推測嘧菌酯抑制了部分病原菌的生長，同時為殼多孢菌屬、假絲酵母屬、浪梗霉屬和蠟殼菌屬等增殖創造了條件，但上述菌屬是否能降解并利用嘧菌酯作為營養物質還有待進一步研究。

微生物作為葉際微生態的重要組成部分［26］，在長期的自然選擇下，真菌和細菌分別適應煙葉葉際環境形成了一個復雜的微生態系統［22］。研究表明，煙葉真菌性病害發生后，其葉際真菌豐富度和多樣性均降低，而細菌性病害則相反［27-29］。本研究發現，處理前感病煙葉葉際真菌豐富度和多樣性指數均低于健康煙葉，感病煙葉葉際細菌豐富度和多樣性指數則高于健康煙葉，結果與前人研究基本一致，進一步驗證了煙葉感病后豐富度和多樣性的變化規律。嘧菌酯處理后，感病與健康煙葉葉際真菌群落豐富度和多樣性增加，細菌群落豐富度和多樣性短時間內降低后隨時間延長迅速增加。嘧菌酯被報道主要用于真菌性病害和卵菌病害的防治，其對葉際細菌微生態的改變，可能是由于其影響了葉際真菌菌群結構，進而細菌群落結構也隨之變化，已有的研究發現嘧菌酯能夠通過抑制與藍藻存在競爭關系的綠藻促進藍藻的競爭優勢，改變水體環境中微生物群落結構［30］。因此，嘧菌酯是否也對煙草葉際細菌具有抑菌活性有待下一步通過敏感性測定進行驗證。

植物葉際菌群結構與所處環境密切相關，溫度、紫外線、降雨等環境因子均影響著葉際微生物的群落結構，植物葉際真菌和細菌復雜的時空分布是各種環境因子與寄主植物相互作用的結果［20］。本文發現，病情指數與真菌群落中的鏈格孢屬及細菌群落中的馬賽菌屬和假單胞菌屬相對豐度呈極顯著正相關，取樣時間與真菌群落中的靈芝屬及細菌群落中的乳桿菌屬和腸桿菌屬相對豐度呈顯著正相關。[JP+1]推測隨著煙葉病情的發展，病原菌鏈格孢屬與亞隔孢殼屬和鐮孢菌屬間存在某種復雜的競爭關系。微生物在植物葉際定殖存在優先效益［31］。已有的研究發現假單胞菌屬為葉際初級定殖菌，可保護次級定殖菌抵御環境脅迫［32］。該發現與本文中取樣時間與各菌屬之間的相關性基本符合。表明煙草葉際菌群演替過程還受到微生物優先效益影響。此外，本研究還發現溫度與真菌群落中的靈芝屬及細菌群落中的乳桿菌屬相對豐度呈極顯著負相關，這與韓秋影等報道假單胞菌屬和Thalassospira等細菌屬隨溫度升高數量急劇降低類似［33］，進一步說明了本研究嘧菌酯對葉際微生物菌群結構的影響中，環境因子也起到了一定影響。

碳源是微生物生長代謝所必需的基本物質，Biolog ECO代謝板內含有自然界大部分微生物所能代謝的31種常見碳源［34］。本研究測定了感赤星病煙葉處理前及處理后不同時期感病與健康煙葉葉際微生物對糖類、羧酸類、氨基酸、聚合物類、胺類和酚類等6類共31種碳源代謝活性，發現處理前，感病與健康煙葉均可高效代謝除α-丁酮酸和L-蘇氨酸外的29種碳源。結果與劉亭亭等發現感病與健康煙葉葉際微生物均較弱代謝2-羥基苯甲酸和L-苯基丙氨酸等碳源結果類似［35］。因此，是否可以通過使用α-丁酮酸和L-蘇氨酸來調控煙葉葉際環境進而防控煙草赤星病，有待下一步驗證。在嘧菌酯處理后，感病與健康煙葉葉際微生物碳源代謝活性差異較大，在5 d時對感病煙葉葉際微生物的碳源代謝活性抑制作用較弱，但隨著時間的延長，在10 d時對感病與健康葉際微生物的碳源代謝活性均表現出較強的抑制作用，結果與劉亭亭等報道的波爾多液處理可抑制煙草葉際微生物碳源代謝結果類似［36］，表明該藥劑發揮作用所需較長時間且具有持效性，適合發病初期使用。

本研究發現感赤星病煙葉與健康煙葉葉際微生物的群落結構、多樣性和代謝功能在嘧菌酯施用后不同時期的變化規律存在共性與差異。在嘧菌酯處理后0～15 d內，感病與健康煙葉葉際優勢真菌屬種類均增加，感病煙葉葉際鏈格孢屬、殼多孢菌屬和莖點霉屬相對豐度均先增加后降低；枝孢霉屬、亞隔孢殼屬和Symmetrospora則先降低后增加。健康煙葉葉際鏈格孢屬、枝孢霉屬、亞隔孢殼屬和Symmetrospora相對豐度均先降低后增加；殼多孢菌屬、假絲酵母屬、浪梗霉屬和蠟殼菌屬則先增加，并在處理后第5 d時成為新的優勢菌屬。感病與健康煙葉葉際泛菌屬、馬賽菌屬和鞘脂單胞菌屬相對豐度均持續降低；感病煙葉葉際的假單胞菌屬、乳桿菌屬、腸桿菌屬和甲基桿菌屬豐度先增加后降低。感病煙葉葉際真菌群落多樣性和豐富度持續增加，細菌群落多樣性先增加后降低，豐富度先降低后增加；健康煙葉葉際真菌群落多樣性和豐富度先增加后降低，細菌群落多樣性先降低后增加，豐富度先增加后降低。

嘧菌酯處理后5 d時對感病煙葉葉際微生物的碳源代謝抑制作用較健康煙葉弱，但10 d時則均表現出較強抑制作用。本文從微觀層面揭示了嘧菌酯施用后感病與健康煙葉葉際微生物在不同時期變化規律的差異，為煙草赤星病的精準化學防控提供一定理論參考。

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