7-羥乙基白楊素對低壓缺氧致PC12細胞損傷的改善作用及機制 Δ

張冬梅，高迎春，張潔，景臨林，馬慧萍 （聯(lián)勤保障部隊第九四〇醫(yī)院藥劑科/全軍高原醫(yī)學實驗室，蘭州730050）

我國高原面積廣闊，具有重要的政治、軍事和經(jīng)濟地位。氣壓低、氧含量低是高原環(huán)境最主要的特征。大腦對低氧刺激尤為敏感，動物研究和臨床試驗表明，急性低壓缺氧可導致大腦皮質(zhì)神經(jīng)細胞、海馬神經(jīng)細胞損傷[1]。當腦神經(jīng)細胞缺氧時，氧氣及營養(yǎng)物質(zhì)消耗所導致的線粒體損傷、神經(jīng)細胞丟失、氧化應激或細胞壞死、凋亡、自噬是缺氧性損傷的關鍵環(huán)節(jié)[2―4]，但目前關于高原低壓缺氧致神經(jīng)細胞損傷的機制及藥物研究較少，其預防和治療一直面臨著較大壓力。可見，探索低壓缺氧致神經(jīng)細胞損傷的發(fā)生機制并尋找抗低壓缺氧損傷藥物具有重要意義。

近年來有研究表明，黃酮類化合物具有改善缺氧損傷神經(jīng)的藥理作用，如抗氧化、抗炎、抗凋亡作用等[5―7]。白楊素（化學名5，7-二羥基黃酮）又名白楊黃素，是來源廣、毒性低的黃酮類化合物，具有抗焦慮、抗抑郁和保護神經(jīng)等多種生物活性，但其生物利用度較低[3]。為了改善白楊素的上述缺點，本課題組通過結構修飾合成了7-羥乙基白楊素[化學名5-羥基-7-羥乙氧基黃酮，英文名7-hydroxyethyl chrysin，以下簡稱“7-HEC”][8]；藥理研究表明，7-HEC能改善低壓缺氧誘導的腦組織損傷、認知功能障礙，并能逆轉(zhuǎn)缺氧模型大鼠海馬神經(jīng)細胞損傷[9]，但具體機制尚不清楚。PC12細胞是研究神經(jīng)生理和神經(jīng)藥理的常用細胞之一，本課題組為了更好地模擬高原環(huán)境，在單純?nèi)毖跄Ｐ偷幕A上進行改良，建立了PC12細胞低壓缺氧損傷模型，并證實了低壓缺氧可誘導該細胞凋亡[10]。研究指出，抗凋亡蛋白B細胞淋巴瘤2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）與促凋亡蛋白Bcl-2相關X蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）的表達比值決定了細胞凋亡的進程，活化的胱天蛋白酶3（cleaved caspase-3）則是執(zhí)行細胞凋亡的關鍵因子，可見，caspase-3/Bax/Bcl-2通路是調(diào)控細胞凋亡的重要信號通路[11]。基于此，本研究擬探討7-HEC對低壓缺氧致PC12細胞損傷的保護作用，同時以caspase-3/Bax/Bcl-2通路為線索，探討該化合物改善低壓缺氧致PC12細胞損傷的分子機制，以期為7-HEC在高原低壓缺氧損傷防治領域中的應用提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器包括自制壓力控制型細胞缺氧培養(yǎng)箱（實用新型專利ZL201821672535[12]）、EST-10-02型氧濃度測定儀（深圳市興源恒通科技有限公司）、CKX41型倒置相差顯微鏡（日本Olympus公司）、INC 153H9T6型三氣培養(yǎng)箱（德國Memmert公司）、Spectra-Maxi3型全自動熒光酶標儀（美國Molecular Devices公司）、ACEA NovoCyte型流式細胞儀（美國ACEA Biosciences公司）、ChemiDocMP Imaging System型凝膠成像分析系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

7-HEC原料藥（純度98%）由本實驗室自制；DMEM高糖培養(yǎng)基購自美國HyClone公司；胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）、0.25%胰酶消化液均購自美國Gibco公司；青霉素-鏈霉素雙抗購自蘭杰柯生物科技有限公司；乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）試劑盒（批號20180728）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）試劑盒（批號20190412）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒（批號20180728）均購自南京建成生物工程研究所；CCK-8細胞活力檢測試劑盒（批號PM508）購自日本Dojindo公司；Annexin Ⅴ-FITC細胞凋亡檢測試劑盒（批號10625-2）購自上海碧云天生物技術公司；DNA含量檢測試劑盒（細胞周期）（批號20210105）購自北京索萊寶科技有限公司；兔抗鼠Bax單克隆抗體（批號ab32503）、兔抗鼠Bcl-2多克隆抗體（批號ab196495）、兔cleaved caspase-3多克隆抗體（批號ab184787）均購自美國Abcam公司；鼠β-肌動蛋白（βactin）單克隆抗體（批號TA-09）、辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔免疫球蛋白G二抗（批號ZB-2307）均購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.3 細胞

大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞系PC12購自中國科學院上海細胞庫。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng)

將PC12細胞接種于含10%FBS、1%青霉素-鏈霉素雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)基（以下簡稱“完全培養(yǎng)基”）中，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞融合至80%～90%時，用0.25%胰酶消化并按1∶3比例傳代，取對數(shù)生長期的細胞進行后續(xù)實驗。

2.2 分組與處理

根據(jù)不同培養(yǎng)條件，將PC12細胞分為對照組、低壓缺氧組和7-HEC組。對照組細胞用含10%FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h；低壓缺氧組細胞根據(jù)前期確定的低壓缺氧模型條件[10]，于 5%CO2、94%N2、1%O2、54 004 Pa（與5 000 m海拔處大氣壓相當）條件下培養(yǎng)24 h；7-HEC組細胞先用含7-HEC的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)30 min后，再按低壓缺氧組方法培養(yǎng)24 h。

2.3 細胞存活率檢測

采用CCK-8法檢測。取生長良好且處于對數(shù)生長期的PC12細胞，用0.25%胰酶消化后，按每孔1×104個接種于96孔板中。將細胞分為對照組、低壓缺氧組、不同濃度7-HEC組（7-HEC終濃度為100、10、1、0.1、0.01 μmol/L，根據(jù)預實驗結果設置），每組設置6個復孔；同時設置不含細胞、不含藥物的空白組。于37oC、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h后，棄去上清液，對照組和低壓缺氧組細胞加入完全培養(yǎng)基100 μL，7-HEC組細胞分別加入含7-HEC 100、10、1、0.1、0.01 μmol/L 的完全培養(yǎng)基 100 μL，按“2.2”項下方法處理。培養(yǎng)24 h后，每孔加入CCK-8試劑10 μL，于37 ℃下孵育1 h，使用酶標儀于450 nm波長處檢測各孔的光密度（OD）值并按下式計算細胞存活率：細胞存活率＝（實驗組OD值－空白組OD值）/（對照組OD值－空白組OD值）×100%。

2.4 細胞中LDH、MDA含量和SOD活性檢測

取生長良好且處于對數(shù)生長期的PC12細胞，用0.25%胰酶消化后，按每孔2×106個接種于6孔板中。將細胞分為對照組、低壓缺氧組、7-HEC組（1 μmol/L，根據(jù)“2.3”項下結果設置），每組設置6個復孔。按“2.3”項下方法培養(yǎng)24 h，收集細胞和上清液，使用酶標儀以LDH試劑盒（L-P法）檢測上清液中LDH含量，以MDA試劑盒（TBA法）檢測細胞中MDA含量，以SOD試劑盒（WST-8法）檢測細胞中SOD活性，嚴格按照試劑盒說明書操作。

2.5 細胞凋亡和細胞周期檢測

2.5.1 細胞凋亡 采用Annexin Ⅴ-FITC/PI雙染流式細胞術檢測。取生長良好且處于對數(shù)生長期的PC12細胞，按“2.4”項下方法分組（每組設置3個復孔）、處理、培養(yǎng)。隨后，棄去上清液，細胞用4 ℃預冷的磷酸鹽緩沖液清洗2次，用不含乙二胺四乙酸的胰酶消化1 min，于室溫下以1 500 r/min離心5 min；用4 ℃預冷的磷酸鹽緩沖液清洗2次，以1 500 r/min離心5 min，棄去上清液；細胞用1×bingding buffer 400 μL重懸，制成密度為1×106個/mL的懸液；取上述懸液，加入Annexin Ⅴ-FITC試劑適量（每100 μL懸液加入Annexin Ⅴ-FITC試劑5 μL），輕輕混勻，室溫避光孵育15 min；加入PI試劑10 μL和1×binding buffer 400 μL，輕輕混勻，使用流式細胞儀檢測細胞凋亡率（%）。

2.5.2 細胞周期 采用流式細胞術檢測。取生長良好且處于對數(shù)生長期的PC12細胞，按“2.4”項下方法分組（每組設置3個復孔）、處理、培養(yǎng)。隨后，收集各組細胞，用磷酸鹽緩沖液清洗2次后，于－20 ℃ 75%乙醇中固定過夜；以1 500 r/min離心5 min，收集細胞，用磷酸鹽緩沖液清洗2次后，用RNaseA試劑重懸并于37 ℃下孵育30 min；加入PI試劑400 μL，于4 ℃下避光孵育30 min，使用流式細胞儀檢測各周期的分布情況。

2.6 細胞中凋亡相關蛋白表達檢測

采用Western blot方法檢測。取生長良好且處于對數(shù)生長期的PC12細胞，按“2.4”項下方法分組（每組設置3個復孔）、處理、培養(yǎng)。隨后，收集各組細胞，用磷酸鹽緩沖液洗滌2次，加入RIPA細胞裂解液100 μL，于冰浴中放置30 min，于4 ℃下以1 500 r/min離心15 min；取上清液，以BCA法進行定量后，加上樣緩沖液煮沸變性10 min，取變性蛋白樣品50 μg進行10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳并轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜上，用含50 g/L脫脂奶粉的TBST緩沖液室溫封閉1 h，加入cleaved caspase-3、Bcl-2、Bax、β-actin一抗（稀釋比例均為1∶1 000），4 ℃孵育過夜；用TBST緩沖液洗膜3次，加入二抗（稀釋比例為1∶5 000），室溫孵育1 h；用TBST緩沖液洗膜3次，以凝膠成像系統(tǒng)成像，以目標蛋白與內(nèi)參蛋白（β-actin）灰度值的比值表示目標蛋白的表達水平，并記錄Bax與Bcl-2表達水平的比值（Bax/Bcl-2比值），實驗重復3次。

2.7 統(tǒng)計學方法

使用GraphPad Prism 9.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。每組實驗至少重復3次。數(shù)據(jù)均以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。檢驗水準α＝0.05。

3 結果

3.1 不同濃度7-HEC對低壓缺氧細胞存活率的影響

與對照組比較，低壓缺氧組細胞的存活率顯著降低（P＜0.01）；與低壓缺氧組比較，7-HEC 10、1、0.1 μmol/L組細胞的存活率均顯著升高（P＜0.05或P＜0.01），提示在上述濃度下，7-HEC可逆轉(zhuǎn)細胞存活率的降低，故選擇作用較明顯的1 μmol/L進行后續(xù)實驗。結果見圖1。

圖1 不同濃度7-HEC對低壓缺氧細胞存活率的影響（±s，n＝6）

3.2 7-HEC對低壓缺氧細胞中LDH、MDA含量和SOD活性的影響

與對照組比較，低壓缺氧組細胞上清液中LDH含量和細胞中MDA含量均顯著升高，細胞中SOD活性顯著降低（P＜0.01）。與低壓缺氧組比較，7-HEC組細胞上清液中LDH含量和細胞中MDA含量均顯著降低（P＜0.01），細胞中SOD活性顯著升高（P＜0.01）。結果見表1。

表1 7-HEC對低壓缺氧細胞中LDH、MDA含量和SOD活性的影響（±s，n＝6）

表1 7-HEC對低壓缺氧細胞中LDH、MDA含量和SOD活性的影響（±s，n＝6）

a：與對照組比較，P＜0.01；b：與低壓缺氧組比較，P＜0.01

組別對照組低壓缺氧組7-HEC組LDH/（U/mL）23.45±4.11 38.85±2.99a 25.19±2.25b MDA/（nmol/mg prot）0.035±0.002 0.081±0.007a 0.040±0.004b SOD（U/mg prot）0.132±0.005 0.113±0.002a 0.134±0.003b

3.3 7-HEC對低壓缺氧細胞凋亡和細胞周期的影響

3.3.1 細胞凋亡 與對照組比較，低壓缺氧組細胞的凋亡率顯著升高（P＜0.01）；與低壓缺氧組比較，7-HEC組細胞的凋亡率顯著降低（P＜0.01）。結果見圖2。

圖2 7-HEC對低壓低氧細胞凋亡的影響（±s，n＝3）

3.3.2 細胞周期 與對照組比較，低壓缺氧組G1期細胞比例顯著升高，S期、G2期細胞比例均顯著降低（P＜0.05或P＜0.01）；與低壓缺氧組比較，7-HEC組G1期細胞比例顯著降低，G2期細胞比例顯著升高（P＜0.01）。結果見圖3。

圖3 7-HEC對低壓缺氧細胞周期的影響（±s，n＝3）

3.4 7-HEC對低壓缺氧細胞中凋亡相關蛋白表達的影響

與對照組比較，低壓缺氧組細胞中cleaved caspase-3蛋白的表達水平顯著升高，Bcl-2/Bax比值顯著降低（P＜0.05或P＜0.01）；與低壓缺氧組比較，7-HEC組細胞中cleaved caspase-3蛋白的表達水平顯著降低，Bcl-2/Bax比值顯著升高（P＜0.05或P＜0.01）。結果見圖4。

圖4 7-HEC對低壓低氧細胞中凋亡相關蛋白表達的影響（±s，n＝3）

4 討論

本研究通過考察7-HEC對低壓缺氧PC12細胞增殖、抗氧化能力、細胞凋亡和細胞周期的影響，評價了該化合物對低壓缺氧致神經(jīng)細胞損傷的保護作用。細胞存活率檢測結果顯示，細胞在低壓缺氧（1%O2、54 004 Pa）條件下培養(yǎng)24 h后，其存活率明顯下降；經(jīng)0.01、0.1、1、10、100 μmol/L的7-HEC提前干預后，7-HEC 0.1、1、10 μmol/L組低壓缺氧細胞的存活率明顯提升，提示上述濃度的7-HEC可逆轉(zhuǎn)細胞存活率的降低；其中，1 μmol/L的活性最佳，故以該濃度作為后續(xù)研究的藥物濃度。

LDH是存在于正常細胞胞質(zhì)中的酶，當細胞膜受損后，LDH即被釋放到細胞外，故可通過檢測細胞上清液中LDH的含量來判斷細胞膜的受損程度[13]。本研究結果顯示，與對照組比較，低壓缺氧組細胞上清液中LDH含量顯著升高；與低壓缺氧組比較，7-HEC組細胞上清液中LDH含量顯著降低。這說明7-HEC對低壓性缺氧引起的細胞膜損傷具有改善作用。

有研究指出，MDA是脂質(zhì)過氧化的標志產(chǎn)物，其含量高低可反映氧化應激的嚴重程度，以及組織受氧自由基破壞的損傷程度；SOD是清除生物體內(nèi)氧自由基的重要物質(zhì)，兼具修復細胞的功能，當細胞內(nèi)氧自由基水平升高時，SOD的生物合成及活性將有所增強，可用以間接反映機體氧自由基的生成量及清除氧自由基的能力[14]。本研究結果顯示，低壓缺氧組細胞中MDA含量較對照組顯著升高，SOD活性較對照組顯著降低，提示低壓缺氧細胞的脂質(zhì)過氧化反應增加，抗氧化能力減弱。與低壓缺氧組比較，7-HEC組細胞中MDA含量顯著降低，SOD活性顯著升高，提示該化合物可逆轉(zhuǎn)細胞脂質(zhì)過氧化反應增加、抗氧化能力減弱的現(xiàn)象，可通過調(diào)控細胞氧化/抗氧化失衡而發(fā)揮對低壓缺氧致細胞損傷的改善作用。

本研究應用Annexin Ⅴ-FITC/PI雙染流式細胞術檢測了低壓缺氧細胞的凋亡情況，結果顯示，與對照組比較，低壓缺氧組細胞的凋亡率顯著升高；與低壓缺氧組比較，7-HEC組細胞的凋亡率顯著降低。這表明低壓缺氧可誘導細胞凋亡，而7-HEC具有抑制細胞凋亡的作用。本研究應用流式細胞儀檢測了7-HEC對細胞周期的影響，結果顯示，低壓缺氧組G1期細胞比例較對照組顯著升高，S期、G2期細胞比例較對照組均顯著降低，提示在低壓缺氧條件下，細胞周期阻滯于G1期；經(jīng)7-HEC處理后，上述作用得到逆轉(zhuǎn)，G1期的細胞比例明顯降低，G2期的細胞比例明顯上升，S期的細胞比例亦有上升趨勢，提示7-HEC可使進入DNA復制期的低壓缺氧細胞比例增加，可改善低壓缺氧引起的細胞周期阻滯。此結果與CCK-8實驗結果相符。有研究指出，處于G1期的細胞可對各種影響增殖與凋亡的信號進行整合和傳遞，進而決定細胞是否進行分裂、凋亡或延遲分裂，即進入G0期[15―16]。結合上述實驗結果顯示，7-HEC可能通過改善低壓缺氧致PC12細胞周期阻滯而提高細胞存活率、減少細胞凋亡和促進細胞增殖，但具體機制有待后續(xù)研究進一步驗證。

細胞凋亡是一種主動的程序性死亡方式，受抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白的嚴格調(diào)控。通常情況下，抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax以相對穩(wěn)定的比例存在于細胞內(nèi)，二者的表達失衡是造成細胞凋亡的關鍵因素：當Bax表達增多時，Bcl-2/Bax同源二聚體增多，在缺氧刺激下，細胞線粒體膜受損，作為凋亡執(zhí)行蛋白酶的caspase-3被釋放至胞質(zhì)，當細胞發(fā)生凋亡時，caspase-3被活化成cleaved caspase-3，從而啟動和誘導凋亡；相反當Bcl-2高表達時，Bcl-2/Bax同源二聚體解離增多，細胞凋亡受到抑制[17]。本研究結果顯示，與對照組相比，低壓缺氧組細胞中cleaved caspase-3蛋白的表達水平顯著升高，Bcl-2/Bax比值顯著下降；與低壓缺氧組相比，7-HEC組細胞中cleaved caspase-3蛋白的表達水平顯著降低，Bcl-2/Bax比值顯著升高。這提示7-HEC可減少低壓缺氧誘導的細胞凋亡，其作用機制可能與抑制caspase-3/Bax/Bcl-2凋亡信號通路的激活有關。

綜上所述，7-HEC可明顯提高低壓缺氧細胞的存活率，降低上清液中LDH含量，改善細胞周期阻滯，降低細胞凋亡率，從而顯著減輕低壓缺氧誘導的細胞損傷，其作用機制可能與抑制caspase-3/Bax/Bcl-2凋亡信號通路的激活有關。本課題組將進一步從細胞分子水平分析7-HEC保護作用的具體機制，為該化合物應用于高原低壓缺氧損傷的防護提供基礎實驗數(shù)據(jù)和研究線索。