gga-miR-155對(duì)MDCC-MSB1細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的影響

余祖華，賈艷艷，何 雷，廖成水，李 靜，魏 穎，陳 建，陳松彪，尚 珂，丁 軻*

(1.洛陽(yáng)活載體生物材料與動(dòng)物疫病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，洛陽(yáng) 471003；2.河南科技大學(xué)功能微生物與畜禽健康實(shí)驗(yàn)室，洛陽(yáng) 471003； 3.河南科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，洛陽(yáng) 471003)

microRNA(miRNA)是一類內(nèi)源性小分子非編碼RNA(noncoding RNAs, ncRNAs)，成熟miRNA長(zhǎng)度為22～25個(gè)核苷酸(nt)，是迄今為止研究最充分的一類ncRNAs[1]。miRNAs與Argonaute (AGO)蛋白形成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體 (RISC)，通過(guò)其5′端6～8個(gè)核苷酸的種子序列與靶mRNA的3′UTR互補(bǔ)結(jié)合，導(dǎo)致mRNA降解和/或翻譯抑制，在轉(zhuǎn)錄后表達(dá)調(diào)控中起著關(guān)鍵作用[2]。據(jù)估計(jì)，miRNA約占細(xì)胞總RNA的0.02%，并在轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)超過(guò)60%的編碼基因[3]，每個(gè)miRNA可以識(shí)別和抑制多種靶mRNA，而其表達(dá)的增加或減少最終可能導(dǎo)致細(xì)胞基因表達(dá)譜的全面改變，從而參與生物體內(nèi)包括細(xì)胞的增殖與分化、新陳代謝、免疫應(yīng)答、疾病的發(fā)生和腫瘤的形成等幾乎所有的生物學(xué)過(guò)程。

馬立克病(Marek’s disease，MD)是由血清Ⅰ型馬立克病病毒(Marek’s disease virus，MDV)感染雞后引起的一種以CD4+T淋巴細(xì)胞增生為主要特征的腫瘤性、免疫抑制性傳染病。雖然MDV誘導(dǎo)腫瘤的發(fā)生可以用病毒疫苗較好地預(yù)防，但伴隨著病毒自身進(jìn)化及疫苗免疫壓力，目前，MDV流行毒株的毒力正不斷增強(qiáng)[4]，因此MD腫瘤發(fā)生發(fā)展的機(jī)制和有效防控仍是該病研究的重要方向。近年來(lái)研究表明，miRNA在MD腫瘤發(fā)生中發(fā)揮重要的調(diào)控作用[5-6]，其中，miR-155的功能性同源體MDV-miR-M4在MDV致瘤作用中發(fā)揮重要的調(diào)控作用[7-9]。miR-155是一種保守的多功能miRNA，研究表明miR-155在機(jī)體的造血、免疫、炎癥、腫瘤等多項(xiàng)生命活動(dòng)中發(fā)揮重要的調(diào)控作用[10-12]。近年來(lái)研究表明，miR-155在CD4+T細(xì)胞功能中起著至關(guān)重要的作用，其可通過(guò)靶基因?qū)D4+T細(xì)胞免疫方面以及免疫抑制性疾病發(fā)揮了重要調(diào)控作用，可作為一個(gè)潛在的疾病生物標(biāo)志物和治療的目標(biāo)[13]。余祖華等[14]研究發(fā)現(xiàn)，gga-miR-155可促進(jìn)MDV轉(zhuǎn)化的腫瘤細(xì)胞系MDCC-MSB1細(xì)胞的增殖、抑制其凋亡，但其具體的調(diào)控機(jī)制仍需進(jìn)一步地探討。因此，為了更好地了解 gga-miR-155在MD腫瘤發(fā)生中可能的作用，本研究以MDV轉(zhuǎn)化的腫瘤細(xì)胞系MDCC-MSB1為模型，在過(guò)表gga-miR-155的基礎(chǔ)上，使用高通量測(cè)序分析過(guò)表達(dá)gga-miR-155的MDCC-MSB1細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的變化，旨在揭示gga-miR-155調(diào)控的 mRNA 轉(zhuǎn)錄物，以探討gga-miR-155在MD腫瘤發(fā)生中的作用機(jī)制，為MD的防控研究提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑和耗材 RPMI 1640 培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)、Penicillin-Streptomycin Solution均購(gòu)自 Gibco 公司；轉(zhuǎn)染試劑riboFECTTMCP 購(gòu)自廣州銳博生物科技有限公司、總RNA提取試劑盒TPK-1001購(gòu)自聯(lián)川生物科技有限公司；PrimeScriptTMRT reagent Kit、TB Green?Premix Ex TaqTMII購(gòu)自Takara公司；胰蛋白胨磷酸肉湯(TPB)購(gòu)自Sigma 公司；6孔細(xì)胞板、25 cm2細(xì)胞瓶、離心管等購(gòu)自Corning公司。

1.1.2 細(xì)胞 馬立克氏病毒轉(zhuǎn)化的腫瘤細(xì)胞系MDCC-MSB1為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.3 主要儀器 ABI7900熒光定量PCR儀 (美國(guó)ABI公司)，CO2恒溫培養(yǎng)箱(日本Sanyo公司)，倒置熒光顯微鏡、倒置顯微鏡(日本Olympus公司)，NanoDrop ND-2000超微量核酸蛋白測(cè)定儀(美國(guó)Thermo公司), Agilent 2100 生物分析儀(美國(guó)Agilent公司)，分光光度計(jì)等。

1.2 gga-miR-155模擬物及熒光定量引物的合成

1.2.1 gga-miR-155模擬物的合成 根據(jù)miRBase數(shù)據(jù)庫(kù)中g(shù)ga-miR-155成熟體序列委托廣州銳博生物科技有限公司合成gga-miR-155模擬物(5′-UUAAUGCUAAUCGUGAUAGGGG-3′)及其陰性對(duì)照(5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′)。

1.2.2 熒光定量引物的設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)文獻(xiàn)[6]設(shè)計(jì)合成gga-miR-155和U6的頸環(huán)熒光定量PCR 擴(kuò)增引物以及隨機(jī)抽取的差異表達(dá)基因的熒光定量PCR(表1)，引物送往生工生物工程(上海)有限公司合成。

表1 Real-time PCR引物序列

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

MDCC-MSB1細(xì)胞采用含有10%FBS、1% (Penicillin-Streptomycin Solution)和10% TPB的 RPMI1640 培養(yǎng)基，置于5% CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.4 試驗(yàn)分組和細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染

將3×105個(gè)·mL-1處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、生長(zhǎng)狀態(tài)良好的MDCC-MSB1細(xì)胞懸液接種于6孔細(xì)胞板，每孔1 mL細(xì)胞懸液。試驗(yàn)分為2組，一組為gga-miR-155模擬物轉(zhuǎn)染組，另一組為gga-miR-155模擬物陰性對(duì)照轉(zhuǎn)染組，每組3個(gè)重復(fù)。根據(jù)riboFECTTMCP轉(zhuǎn)染試劑操作說(shuō)明進(jìn)行轉(zhuǎn)染，在轉(zhuǎn)染后48 h收集細(xì)胞進(jìn)行相關(guān)檢測(cè)。

1.5 RNA提取及檢測(cè)

于轉(zhuǎn)染后48 h收集gga-miR-155模擬物及其陰性對(duì)照轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞，用總RNA提取試劑盒TPK-1001提取細(xì)胞總 RNA，將每組3個(gè)重復(fù)的樣本分別命名為M1、M2、M3和C1、C2、C3。Nanodrop-1000核酸蛋白測(cè)定儀測(cè)定總RNA的濃度和純度, 用Agilent 2100 生物分析儀檢測(cè)RNA質(zhì)量。

1.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

按照文獻(xiàn)[9]方法，定量并分析、比較轉(zhuǎn)染后48 h gga-miR-155模擬物及其陰性對(duì)照轉(zhuǎn)染組中g(shù)ga-miR-155相對(duì)表達(dá)量的差異。

1.7 測(cè)序文庫(kù)的構(gòu)建及高通量測(cè)序

質(zhì)量合格的gga-miR-155模擬物及其陰性對(duì)照轉(zhuǎn)染組細(xì)胞總 RNA，用Ribo-ZeroTMGold Kits 去除樣品中的 rRNA， 富集mRNA后將其片段化，用隨機(jī)引物合成第1條cDNA鏈，再合成第2條cDNA鏈。雙鏈產(chǎn)物經(jīng)純化、平末端修復(fù)、加接頭和poly(A)尾，選擇片段后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得測(cè)序文庫(kù)。文庫(kù)質(zhì)檢合格后采用Illumina NovaseqTM6000平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序分析。

1.8 測(cè)序數(shù)據(jù)分析

6個(gè)樣品(分別為M1、M2、M3和C1、C2、C3)構(gòu)建的測(cè)序文庫(kù)所得的原始數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)濾(去除帶接頭的序列、含有5%以上無(wú)法確定堿基信息的序列及質(zhì)量值Q10的堿基數(shù)占整個(gè)read的20%以上低質(zhì)量的序列)，得到純凈序列(clean reads)，計(jì)算過(guò)濾后每個(gè)測(cè)序文庫(kù)的Phred值(Q20、Q30)和GC含量。應(yīng)用TopHat v2.0.9和Scripture(Beta2)對(duì)所得的clean reads在雞參考基因組進(jìn)行比對(duì)和定位，利用HTSeq(v0.5.3)軟件進(jìn)行基因表達(dá)水平分析，根據(jù)FPKM (fragments per kilobase of transcript sequence per milions base pairs sequenced)計(jì)算每個(gè)基因的表達(dá)量。采用DESeq2軟件對(duì)試驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)胞的基因表達(dá)差異進(jìn)行分析，篩選標(biāo)準(zhǔn)為log2Fold Change≥1且校正后的P<0.05。分別利用 GO seq(v2.12)軟件和KOBAS(v2.0)軟件對(duì)獲得的差異表達(dá)基因進(jìn)行GO富集分析和KEGG 通路富集分析，采用超幾何分布檢驗(yàn)的方法計(jì)算每個(gè)通路條目中差異基因富集的顯著性。最后，通過(guò) TargetScan(v. 5.0)和 miRanda(v. 3.3a)預(yù)測(cè)與gga-miR-155具有靶標(biāo)關(guān)系的mRNA，獲得較為可信的靶基因。

1.9 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果的實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證

為驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果，本研究以GAPDH作為內(nèi)參，采用qRT-PCR檢測(cè)gga-miR-155過(guò)表達(dá)組與對(duì)照組中IDH1、FGL2、RAC2、BACH1、HSPD1和TAF11等6個(gè)差異表達(dá)基因的表達(dá)量。利用Primer Premier 5.0軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，引物相關(guān)信息見(jiàn)表1。取gga-miR-155模擬物及其陰性對(duì)照轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞樣品，利用1.4方法提取總RNA后，按照PrimeScriptTMRT reagent Kit將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。然后使用TB Green?Premix Ex TaqTMII和表1中基因特異性引物在ABI7900熒光定量PCR儀上進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，采用2-△△Ct法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 gga-miR-155在MDCC-MSB1細(xì)胞中的表達(dá)檢測(cè)

采用qPCR檢測(cè)gga-miR-155是否在MDCC-MSB1中實(shí)現(xiàn)過(guò)表達(dá)。由圖1可知，gga-miR-155模擬物轉(zhuǎn)染組表達(dá)量為(11.512±0.896)，gga-miR-155模擬物NC轉(zhuǎn)染組的表達(dá)量為(0.948±0.054)，gga-miR-155模擬物轉(zhuǎn)染組中g(shù)ga-miR-155的表達(dá)量極顯著的高于gga-miR-155模擬物NC轉(zhuǎn)染組(P<0.01)。

**.P<0.01

2.2 RNA樣本檢測(cè)

采用Nanodrop-1000核酸蛋白測(cè)定儀和Agilent 2100 生物分析儀檢測(cè)總RNA質(zhì)量。結(jié)果可知，OD260 nm/OD280 nm值在1.91～2.04之間，28S/18S≥1，在1.4～2之間， RIN 值≥7，在9.2～9.7之間(表2)，表明提取的各組總RNA完整性好，質(zhì)量符合要求，樣品可進(jìn)行高通量測(cè)序。

表2 RNA樣本檢測(cè)

2.3 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序質(zhì)量評(píng)估

通過(guò)去除tRNA法構(gòu)建文庫(kù)，并進(jìn)行Illumina NovaseqTM6000測(cè)序，gga-miR-155模擬物轉(zhuǎn)染組M1、M2、M3文庫(kù)分別獲得78 879 880億、105 580 002億、110 695 196億條raw reads，過(guò)濾后分別獲得77 655 222億、103 485 920億、108 478 966億條clean reads，序列有效率分別為98.45%、98.02%、98%，GC含量分別為 49.5%、49%、49%；對(duì)照組C1、C2、C3文庫(kù)分別90 571 206億、79 318 188億、101 493 076億條raw reads，過(guò)濾后分別獲得88 803 092億、77 829 620億、99 572 012億條clean reads，GC含量分別為 49.5%、50%、49.5%。平均Q20>99%，Q30>93%，表明數(shù)據(jù)質(zhì)量較高，可用于后續(xù)差異基因分析。

2.4 gga-miR-155模擬物轉(zhuǎn)染后MDCC-MSB1細(xì)胞差異基因表達(dá)的篩選

gga-miR-155模擬物轉(zhuǎn)染組與對(duì)照組檢測(cè)到共有表達(dá)基因13 833個(gè)，其中，gga-miR-155模擬物轉(zhuǎn)染組特有基因1 321個(gè)，對(duì)照組特有基因791個(gè)(圖2A)。對(duì)gga-miR-155模擬物轉(zhuǎn)染組與對(duì)照組中上調(diào)與下調(diào)的顯著性差異表達(dá)mRNA進(jìn)行數(shù)目統(tǒng)計(jì)，并用火山圖展示，橫坐標(biāo)(log2Fold Change)表示基因在不同樣本中的差異倍數(shù)，縱坐標(biāo)(-lgPval)表示表達(dá)差異的顯著性水平，紅色點(diǎn)表示顯著上調(diào)基因，藍(lán)色點(diǎn)表示顯著下調(diào)基因。gga-miR-155模擬物轉(zhuǎn)染組和對(duì)照組相比，共有87個(gè)差異表達(dá)基因，其中,有47個(gè)基因上調(diào)，40個(gè)基因下調(diào)(圖2B、C)。

A.表達(dá)基因韋恩圖；B.差異表達(dá)基因火山圖；C.差異表達(dá)基因?qū)哟尉垲悷釄D

2.5 差異表達(dá)基因的GO分類與富集分析

對(duì)87個(gè)差異表達(dá)基因(DEG)進(jìn)行GO功能分類，結(jié)果如圖3所示。在GO功能分析中，生物學(xué)過(guò)程(biological process)25條，細(xì)胞組分(cellular component)有15條，分子功能(molecular function)有10條。在生物學(xué)過(guò)程里，顯著富集程度排在前4的分別為新陳代謝過(guò)程(metabolic process)、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)(regulation of transcription)、氧化還原過(guò)程(oxidation-reduction process)和細(xì)胞內(nèi)蛋白運(yùn)輸(intracellular protein transport)。在細(xì)胞組分里，顯著富集程度排在前4的分別為細(xì)胞質(zhì)(cytoplasm)、核(nucleus)、膜(membrane)和胞外外泌體(extracellular exosome)。在分子功能里，顯著富集程度排在前3的分別為蛋白結(jié)合(protein binding)、ATP結(jié)合(ATP binding)和蛋白同源化活性(protein homodimerization activity)。功能富集分析顯示，代謝過(guò)程和蛋白結(jié)合有關(guān)的差異基因占比較大。

圖3 差異表達(dá)基因GO功能富集

2.6 差異表達(dá)基因的KEGG富集分析

對(duì)87個(gè)差異表達(dá)基因進(jìn)行KEGG 通路功能注釋并進(jìn)行顯著性富集，結(jié)果顯示共得到20條顯著富集的KEGG信號(hào)通路。其中主要與真核生物核糖生物合成、吞噬體、嘧啶代謝、碳代謝、氨基酸代謝、類固醇生物合成等信號(hào)通路有關(guān)(圖4)，這些富集結(jié)果表明差異表達(dá)的 mRNA 與MDCC-MSB1細(xì)胞代謝是密不可分的。

圓圈的顏色表示每個(gè)信號(hào)通路相應(yīng)的顯著性P值，圓圈大小表示每個(gè)信號(hào)通路上出現(xiàn)的差異基因數(shù)

2.7 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果的實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證

選取了IDH1、FGL2、RAC2、BACH1、HSPD1和TAF11等6個(gè)差異表達(dá)基因qRT-PCR驗(yàn)證結(jié)果顯示，所選擇的差異表達(dá)基因qRT-PCR結(jié)果和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果上調(diào)和下調(diào)表達(dá)趨勢(shì)相同(圖5，表3)，表明轉(zhuǎn)錄組測(cè)序篩選的差異基因是可信的。

*.P<0.05, **.P<0.01

表3 選取的差異表達(dá)基因的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果

2.8 低表達(dá)基因與gga-miR-155的靶關(guān)系分析

針對(duì)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果，篩選gga-miR-155模擬物組表達(dá)量顯著下調(diào)且與代謝相關(guān)的候選基因，通過(guò)Targetscan和miRada軟件共同對(duì)測(cè)序低表達(dá)基因結(jié)果進(jìn)行 gga-miR-155的靶基因預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示雞BACH1基因?yàn)榉蠗l件的直接靶基因，TargetScan預(yù)測(cè)gga-miR-155靶向結(jié)合BACH1 3′UTR的種子區(qū)(589—596位)，如圖6所示。

圖6 gga-miR-155的靶基因預(yù)測(cè)

3 討 論

在腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中涉及多種分子的調(diào)控，研究表明，miRNA水平的失調(diào)與腫瘤發(fā)生有關(guān)，越來(lái)越多的miRNA被證實(shí)對(duì)腫瘤的發(fā)生有重要影響，腫瘤細(xì)胞的增殖、分化、凋亡、轉(zhuǎn)移等多種生物學(xué)過(guò)程都與miRNA 密不可分[15-16]。因此，miRNA對(duì)腫瘤的調(diào)控作用仍是學(xué)術(shù)界研究的熱點(diǎn)之一，詳細(xì)了解miRNAs在腫瘤發(fā)生中的調(diào)節(jié)機(jī)制對(duì)于理解其生理作用至關(guān)重要。

有研究報(bào)道在腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，miRNA-155可作為癌基因或抑癌基因，通過(guò)調(diào)控細(xì)胞的侵襲與遷移來(lái)影響腫瘤轉(zhuǎn)移，miRNA-155已被認(rèn)為是許多腫瘤性疾病的標(biāo)記物[17]。miRNA作為轉(zhuǎn)錄后調(diào)控表觀變化的關(guān)鍵因子，在基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮重要的協(xié)作作用[18]。通過(guò)表達(dá)載體或使用合成miRNA模擬物過(guò)表達(dá)miRNA，然后通過(guò)mRNA微陣列或RNA測(cè)序(RNA-seq)對(duì)基因表達(dá)變化進(jìn)行高通量分析，可以直接評(píng)估目標(biāo)基因。為了探究gga-miR-155在MD腫瘤發(fā)生中可能參與的調(diào)控作用，本研究中通過(guò)在MDCC-MSB1細(xì)胞中過(guò)表達(dá)gga-miR-155后進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，以期篩選到gga-miR-155直接或間接調(diào)控的基因，結(jié)果顯示，在MDCC-MSB1細(xì)胞中過(guò)表達(dá)gga-miR-155后篩選到87個(gè)有差異表達(dá)的基因。由于MiRNAs是作用到相應(yīng)靶基因的3′-UTR的種子序列區(qū)而發(fā)揮相應(yīng)的調(diào)控作用，每個(gè)miRNA可以調(diào)控多個(gè)靶基因，每個(gè)特定的靶基因可以同時(shí)被多個(gè)miRNA所調(diào)控, Baek等[2]發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)miRNA對(duì)內(nèi)源蛋白的抑制率一般小于50%。單一miRNA的過(guò)表達(dá)可能無(wú)法導(dǎo)致某一靶基因轉(zhuǎn)錄和蛋白水平的過(guò)度波動(dòng)[19]，這可能是本研究中篩選得到的差異表達(dá)基因沒(méi)有其他類似研究[20- 21]多的主要原因。

腫瘤的形成是一個(gè)多步驟過(guò)程，在這一過(guò)程中獲得了多個(gè)特征，細(xì)胞內(nèi)能量代謝異常是腫瘤的十大重要特征之一，miRNA可能通過(guò)調(diào)節(jié)有氧糖酵解相關(guān)酶的表達(dá)來(lái)介導(dǎo)有氧糖酵解，從而調(diào)控腫瘤細(xì)胞代謝和增殖[22]。核糖體負(fù)責(zé)細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的合成，研究表明核糖體生物發(fā)生的異常與腫瘤性的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[23]。本研究中差異基因的GO功能富集分析結(jié)果顯示，有很多差異蛋白主要與代謝過(guò)程和蛋白結(jié)合有關(guān)。差異表達(dá)基因的KEGG信號(hào)通路富集結(jié)果顯示，差異表達(dá)基因與真核生物核糖生物合成、吞噬體、嘧啶代謝、碳代謝、氨基酸代謝、類固醇生物合成等信號(hào)通路有關(guān)，表明gga-miR-155參與調(diào)控的與代謝和蛋白結(jié)合有關(guān)的基因會(huì)引起這些代謝調(diào)節(jié)通路的異常，從而與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。

BACH1是一種轉(zhuǎn)錄抑制因子，在哺乳動(dòng)物組織中廣泛表達(dá)，已有大量研究證實(shí)BACH1是一個(gè)促腫瘤轉(zhuǎn)移因子，高表達(dá)的BACH1提高了乳腺癌、食管癌、結(jié)直腸癌等細(xì)胞的遷移活性[24]。近年研究發(fā)現(xiàn)BACH1參與腫瘤代謝重編程，促進(jìn)腫瘤血管和淋巴管的新生和重構(gòu)，從而增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移[25-26]。在三陰性乳腺癌中，BACH1高表達(dá)能靶向線粒體代謝，降低三羧酸循環(huán)中的葡萄糖利用率，負(fù)調(diào)節(jié)電子傳遞鏈基因轉(zhuǎn)錄[27]。Pulkkinen等[28]研究顯示，抑制腎癌細(xì)胞中miR-155水平可上調(diào)BACH1的表達(dá)水平，同時(shí)細(xì)胞的增殖和侵襲能力下降，凋亡水平增加。谷仕艷等[29]研究表明ATO可通過(guò)抑制miR-155的表達(dá)水平，激活BACH1蛋白，抑制 NQO1和 HO-1蛋白的表達(dá)，從而削弱細(xì)胞的總抗氧化能力，最終誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。研究顯示miR-155是BACH1表達(dá)水平的負(fù)調(diào)控因子，BACH1是其靶基因之一[27, 29-30]，而本研究通過(guò)采用Targetscan和miRada均預(yù)測(cè)BACH1是gga-miR-155的靶基因，結(jié)合差異表達(dá)基因GO功能和KEGG信號(hào)通路富集分析，推測(cè)gga-miR-155可通過(guò)調(diào)控BACH1基因的表達(dá)而參與調(diào)控MDCC-MSB1的代謝過(guò)程，但其具體的功能還需進(jìn)一步的驗(yàn)證。

4 結(jié) 論

本研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染gga-miR-155模擬物可導(dǎo)致MDCC-MSB1細(xì)胞中g(shù)ga-miR-155的表達(dá)量顯著增加，通過(guò)RNA-seq在gga-miR-155轉(zhuǎn)染組與對(duì)照組細(xì)胞中共檢測(cè)到87個(gè)差異表達(dá)基因，其主要與代謝和蛋白結(jié)合相關(guān)。綜合分析發(fā)現(xiàn)，差異表達(dá)基因中的BACH1基因在gga-miR-155的作用下可能參與調(diào)控了MDCC-MSB1細(xì)胞中的代謝過(guò)程，可作為進(jìn)一步功能驗(yàn)證的關(guān)鍵基因。