微量熱法研究MB/TiO2復合物對白色念珠菌的抑制行為

王智俊，劉東亮，付娌麗，饒 璐，李月生

(1.湖北科技學院藥學院，湖北咸寧 437100;2.湖北科技學院輻射化學與功能材料湖北省重點實驗室，湖北咸寧 437100;3.湖北省智慧康養產業技術研究院，湖北咸寧 437100)

0 引言

生物體內的化學反應一般在等溫狀態條件下進行，熱效應較小.如若能夠使用某種方法測量出生物體內化學反應所產生的熱效應，那就能對生物系統進行靜態(恒溫式)的連續跟蹤檢測.微量熱法是一種高靈敏度和高精準度的技術，是一種適合定性和定量研究生物活性的技術，是一種基于自動、連續監測變化過程的熱效應而建立的熱化學方法.該技術已廣泛應用于藥物與生物相互作用的研究.可通過分析生長代謝熱功率輸出曲線而得到生物機體生理活動的熱力學和動力學信息[1].實際上，微量熱法非常適合于測量輕微放熱或吸熱過程的熱輸出，如微生物細胞、細胞器、組織的產熱器官.近年來，微量熱法已廣泛應用于藥物和微生物細胞之間的相互作用[2].

亞甲基藍(MB，別名：堿性湖藍；次甲基藍；美藍，化學式為C16H18N3ClS)在抗菌領域的應用十分廣泛.Jian Ji團隊[3]基于MB和β-環糊精之間的主客體相互作用，開發了一種具有很大潛力的抑菌涂層，具有廣泛的應用場景，如醫療設備殺菌的替代品.Busi Siddhardha團隊[4]使用MB和Ag NPs的混合物，發現具有更高的抗菌活性，對革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細菌都更有效.此外，K Kholikov團隊[5]使用MB與石墨烯量子點(GQD)結合，可增強單線態氧的產生，從而提高細菌滅活率，以增強抗菌活性.

納米二氧化鈦由于其化學穩定性、生物相容性和抗菌性能，已成為抗菌材料領域的熱點之一.Sara Akhtar團隊[6]合成了納米TiO2膠體，對革蘭氏陽性和陰性致病菌進行了抑菌試驗，試驗結果表明TiO2納米膠體具有抗菌潛力.Yue-Sheng Li團隊[7]以聚乙烯醇(PVA)、羧甲基殼聚糖(CMCS)和納米TiO2為原料，通過凍融循環和電子束輻射制備了納米TiO2/CMCS/PVA三元納米復合水凝膠，具有顯著的抑菌活性.Seyed Mohammad Davachi團隊[8]采用殼聚糖/二氧化鈦納米復合材料制備了超疏水棉織物，發現納米復合涂層織物對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌具有良好的抗菌性能,所研制的納米復合涂層織物在抗菌方面具有廣闊的應用前景.

在全球范圍內真菌感染是傳染病導致死亡的一個最主要的原因.而念珠菌是侵襲性真菌感染最常見的原因之一，其中白色念珠菌又是侵襲性念珠菌病的主要原因[9].白色念珠菌在臨床上是一種重要的人體致病真菌，通常存在于人口腔、下呼吸道、腸道及陰道，一般可與宿主共生，不引起疾病，而當宿主免疫功能異常或正常菌群失調時就會引發急性、亞急性或慢性感染[10].

本文采用微量熱法，研究了MB/TiO2復合物對白色念珠菌的熱功率輸出曲線，直接測定白色念珠菌在MB/TiO2復合物作用下的生長代謝過程，并根據熱功率輸出曲線計算白色念珠菌在MB/TiO2復合物作用下的生長速率常數、傳代時間、抑制率、半抑制濃度等熱動力學參數，進一步揭示了白色念珠菌生長代謝過程的熱動力學規律.

1 實驗部分

1.1 實驗樣品及儀器

1.1.1儀器 LKB-2277生物活性檢測系統(瑞典)，熱穩定性好，可穩定在±1×10-4℃，恒溫工作范圍在20～80 ℃，熱功率最小檢測極限為0.12 μW，24 h內基線漂移為0.2 μW，實驗時系統控溫于37.00 ℃；X射線衍射分析儀(XRD-600，日本島津)；掃描電鏡(VEGA 3 SBH，TESCAN公司，捷克).

1.1.2材料 TiO2(Degussa P-25,Germany)；MB(Sigma,St.Louis,MO,USA)；白色念珠菌(ATCC 64550)；培養基(營養肉汁培養基)：取NaCl 0.5 g，蛋白胨1 g，牛肉膏0.6 g，溶于100 mL二次蒸餾水中，pH=7.0，120 ℃，1.034×105Pa高壓滅菌30 min，冰箱中放置備用；LB(Luria-Bertani)培養基：取NaCl 5 g，蛋白胨10 g，酵母粉5 g，溶于1000 mL二次蒸餾水中，pH=7.0，120 ℃，1.034×105Pa高壓滅菌30 min，冰箱中放置備用.

1.2 MB/TiO2復合物的制備

根據文獻[11-12]，在pH為7.4±0.1的PBS緩沖溶液中制備MB/TiO2納米復合懸浮液，靜置8 h后，離心，干燥，即得MB/TiO2復合物.所有溶液均用雙蒸餾水配制，樣品質量在微天平上精確稱重.

1.3 實驗方法

用X射線衍射分析儀(XRD)和掃描電鏡(SEM)分析MB/TiO2復合物樣品的結合情況.

使用停流法進行檢測.檢測前先用0.1 mol·L-1NaOH溶液清洗管道和流通池，再用0.1 mol·L-1HCl溶液清洗，接著使用體積分數為75%的乙醇溶液清洗，最后使用無菌水清洗管道和流通池.待基線穩定之后，用蠕動泵以50 mL·h-1的流速將菌液和樣品的混合液泵入生物活性檢測系統中，當樣品充滿流通池(約0.6 mL)后停泵，記錄儀自動跟蹤記錄流通池內細菌的生長代謝熱功率輸出曲線(P-T曲線)，當記錄筆返回基線后，實驗結束.

TiO2和MB/TiO2復合物按實驗要求用二次蒸餾水配制成溶液，實驗前先將細菌接種于5 mL的新鮮的LB培養基中，接種量為106cfu/mL，后將用二次蒸餾水溶解后的待測樣品加入LB培養基中，在振蕩器上搖勻.整個操作過程均在超凈工作臺里進行.

2 結果與討論

2.1 樣品的表征

2.1.1 X射線衍射(XRD)分析 將TiO2、MB以及合成的MB/TiO2復合物研磨、壓片，用X射線衍射分析儀進行分析.如圖1所示，在25.2°、38.6°、53.9°、55.1°處出現了TiO2的特征峰，說明MB的復合沒有改變TiO2的晶型結構.

2.1.2 掃描電鏡(SEM)分析 通過SEM對MB/TiO2復合物的表面形貌進行觀察與分析.如圖2(a.b)所示，TiO2存在明顯的聚集現象，如圖2(c.d)所示，發現MB已附著在TiO2表面，與之結合，同時可以看出MB/TiO2復合物比單一的TiO2具有更好的分散性.

圖1 MB、TiO2、MB/TiO2復合物的XRD分析Fig.1 XRD analysis of MB, TiO2 and MB/TiO2 composites圖2 TiO2的SEM分析(a,b);MB/TiO2復合物的SEM分析(c,d)Fig.2 SEM analysis of TiO2(a,b);SEM analysis of MB/TiO2 composites(c,d)

2.2 白色念珠菌生長代謝熱功率輸出曲線

近似生理條件下,用停流法測定了白色念珠菌生長代謝熱功率輸出曲線(P-T)，如圖3所示.生長代謝熱功率輸出曲線與傳統生物學方法所獲得的典型細菌生長曲線結果能很好的吻合，也包括四個主要時期：停滯期(I)、指數生長期(II)、非指數生長期(III)、衰亡期(IV).

圖3 白色念珠菌的生長代謝熱功率輸出曲線Fig.3 The power-time curves of Candida albicans growth

同時測定了TiO2和MB/TiO2復合物作用下的白色念珠菌的生長代謝的熱功率輸出曲線，圖4a為白色念珠菌在不同濃度的TiO2作用下的生長代謝的熱功率輸出曲線.隨著濃度的增加白色念珠菌的停滯期變長，生長期的最大產熱功率(Pm)減小.在相同的實驗條件下，其結果有非常好的重現性.

圖4b反映了白色念珠菌在不同濃度MB/TiO2復合物作用下生長代謝熱功率輸出曲線情況.將白色念珠菌在TiO2樣品和MB/TiO2復合物的熱功率輸出曲線進行比較，可以看到白色念珠菌在MB/TiO2復合物作用下，傳代時間tG延長，生長代謝熱功率輸出曲線上的停滯期變長，生長峰后移，生長期的最大產熱功率Pm減小，而且這個趨勢隨著MB/TiO2復合物濃度的逐漸增大，變化會愈加明顯，表面MB/TiO2復合物對白色念珠菌的生長代謝的抑制作用且比單獨使用TiO2效果更好.

圖4 白色念珠菌在不同濃度的TiO2作用下的生長代謝熱功率輸出曲線(a);白色念珠菌在不同濃度的MB/TiO2復合物作用下的生長代謝熱功率輸出曲線(b)Fig.4 The power-time curves of Candida albicans growth in the presence of TiO2 at different concentrations(a);The power-time curves of Candida albicans growth in the presence of MB/TiO2 composites at different concentrations(b)

2.3 白色念珠菌的生長速率常數k和傳代時間tG的計算

在細胞的指數生長期中，產熱功率Pt與生長速率常數k之間有如下關系[13]：

Pt=P0exp(kt)或LnPt=LnP0+kt

(1)

將生長代謝熱功率輸出曲線上指數生長期的Pt，t值代入式(1)中，用計算機進行線性擬合分別得到白色念珠菌在TiO2和MB/TiO2復合物作用下生長速率常數k.

另外，傳代時間tG與生長速率常數k之間有如下關系：

tG=(ln2)/k

(2)

通過式(2)可以得到白色念珠菌在不同濃度的TiO2和MB/TiO2復合物樣品作用下的傳代時間tG(如表1所示).表1顯示白色念珠菌的生長速率常數k隨著TiO2和MB/TiO2復合物樣品濃度的增加而減小，細胞的傳代時間tG相應延長.

2.4 生長速率常數k與濃度c的關系

由表1可以得到生長速率常數k隨著MB/TiO2復合物和TiO2樣品濃度c的增大而減小，表明MB/TiO2復合物和TiO2樣品對細菌均產生較大影響.TiO2樣品濃度較低時，生長速率常數k隨著藥物濃度的增大而顯著下降；而濃度較高時，隨著樣品濃度的逐漸增大，生長速率常數k下降速度逐漸減緩.而MB/TiO2復合物則沒有這種趨勢，可見對于TiO2和MB/TiO2復合物，白色念珠菌的生長速率常數k隨樣品濃度的變化不完全相同，說明TiO2和MB/TiO2復合物對白色念珠菌的生長代謝過程的影響也不完全一樣，也許是因為它們的結構導致與微生物中酶的結合各不相同，從而使它們對微生物生長代謝過程的作用不同.

以k對c進行線性擬合，則得k與各樣品濃度c的關系分別為:

TiO2k=0.911 3-0.001 4c+9.313 0×10-7c2R2=0.956 5

MB/TiO2k=0.982 65-6.777 06cR2=0.867 7

表1 白色念珠菌在不同濃度MB/TiO2復合物和TiO2作用下的熱動力學參數Tab.1 Thermokinetic parameters of Candida albicans in the presence of MB/TiO2 complexes and TiO2 at different concentrations

通過k-c圖形可以更直觀的看到，隨著樣品濃度的增加，細菌的生長受到的抑制越大，由方程tG=(ln2)/k得到的傳代時間tG也逐漸增加.如圖5a和圖5b所示.

圖5 白色念珠菌在不同濃度的TiO2作用下的生長速率常數k(a);b:白色念珠菌在不同濃度的MB/TiO2復合物作用下的生長速率常數k(b)Fig.5 The growth rate constant (k) of Candida albicans growth in the presence of TiO2at different concentrations(a);The growth rate constant (k) of Candida albicans growth in the presence of MB/TiO2 composites at different concentrations(b)

2.5 抑制率I和半抑制濃度IC50

樣品對白色念珠菌的抑制率可通過下面公式得到：

I=[(k0-kC)/k0]×100%

(3)

式中k0為細胞未受到抑制時生長速率常數，kC為細胞受到濃度為c的樣品抑制作用時的生長速率常數.半抑制濃度IC50為抑制率為50%時所對應的樣品濃度.根據式(3)，得出了白色念珠菌在MB/TiO2復合物和TiO2樣品不同濃度作用下的抑制率I及半抑制濃度IC50，結果如表1所示.半抑制濃度IC50體現細菌被樣品抑制的敏感性：IC50值越小，表示細菌對樣品越敏感，也就是樣品的抑制作用就越大.由表1可得出：白色念珠菌對MB/TiO2復合物最敏感，對TiO2敏感的程度其次.

2.6 抑制率I與濃度c的關系

由表1可以得到抑制率I與樣品濃度c的關系，抑制率I隨樣品濃度的不斷增加而增加，說明樣品濃度越高，對白色念珠菌的抑制作用越強，當抑制率為100%時說明大腸桿菌被完全抑制，二者線性擬合方程為：

TiO2I=0.064 04+5.945 29cR2=0.927 59

MB/TiO2I=-0.077 54+6.777cR2=0.931 49

通過I-c圖形(圖6a和6b)可以很直觀的看到，隨著樣品濃度的增加，細菌生長所受到的抑制越大.

2.7 MB/TiO2復合物抑制白色念珠菌生長代謝的機理

MB/TiO2復合物比單一的TiO2具有更好的分散性和晶體特性.而白色念珠菌細胞膜上存在數個作用位點，MB/TiO2復合物因其更佳的分散性和晶體特性，更易與白色念珠菌細胞膜上的多個位點發生相互作用[14]，導致白色念珠菌細胞膜破損，從而導致細胞內的細胞質外泄，最終導致細菌死亡.而TiO2因其出現的聚集現象，不易與白色念珠菌上的多個作用位點同時結合，抑制白色念珠菌生長代謝的效果自然不如MB/TiO2復合物.MB/TiO2復合物導致白色念珠菌細胞膜破損，也進一步驗證了納米粒子與生物體細胞膜相互作用的觀點[15].

圖6 白色念珠菌在不同濃度的TiO2作用下的抑制率I(a);白色念珠菌在不同濃度的MB/TiO2復合物作用下的抑制率I(b)Fig.6 The inhibitory ratio (I) of Candida albicans growth in the presence of TiO2at different concentrations(a); The inhibitory ratio (I) of Candida albicans growth in the presence of MB/TiO2 composites at different concentrations(b)

3 結論

在近似生理條件下，采用微量熱法研究MB/TiO2復合物對白色念珠菌的抑制行為，并與TiO2對白色念珠菌的抑制進行對比.實驗結果表明：首先，MB/TiO2復合物對白色念珠菌的抑制效果強于TiO2.其次，MB/TiO2復合物的生長速率常數(k)和最大產熱功率(Pm)隨著其濃度的增加而下降，而傳代時間(tG)和抑制率(I)隨著其濃度的增加而增加.MB/TiO2復合物的生長速率常數(k)和抑制率(I)均與其濃度成一定的線性關系.

總之，這項工作表明微量熱法可以為納米復合材料對細菌的抑菌作用的研究提供一個很好的，且不能用常規方法獲得各項動態信息的方法，解決了當前分析納米生物技術難的問題.這項工作有效提供了研究納米材料作為抗菌，抗病毒和污染控制的新平臺.