齊墩果酸-環金屬銥配合物的點擊化學合成及抗腫瘤性能

李世杰 錢曉婷 黃元鐳 薛旭玲 錢 勇 蘇 志 劉紅科

(南京師范大學材料與科學學院，南京 210023)

0 引言

癌癥由于具有高死亡率、易復發、侵襲和強轉移能力，已經成為威脅全球人類健康的主要公共衛生問題之一[1]。在癌癥的臨床治療中，以順鉑為代表的金屬藥物發揮著獨特的作用，并在化療藥物發展的舞臺上扮演著重要角色[2]。近些年來，與鉑類藥物相比，非鉑類金屬配合物具有多樣性的結構、多樣化的配位類型、豐富的光學性質及異于順鉑的抗腫瘤作用機理等優良特性，引起了科研工作者們的極大興趣[3?8]。其中，環金屬銥配合物表現出良好的光物理特性，這使其成為醫療試劑和成像劑的最佳候選者[9]。Mao等通過對環金屬銥配合物進行N?雜環卡賓修飾，實現了特定靶向線粒體的光動力治療[10]。Chao等通過調節環金屬銥配合物的相關配體來調節其親脂性[11]。本課題組設計的環金屬銥與大黃酸相結合后實現了克服順鉑耐藥性[12]，啟發我們將金屬前體與天然產物相結合，有望實現金屬藥物的多功能化應用[13]。

天然產物因其具有可修飾的活性位點、豐富的生物活性以及潛在的靶點等優勢，逐漸走入人們的視野。Liang課題組將天然存在的生物堿1，2，3，4?四氫異喹啉(THIQ)進行修飾后與有機金屬Au結合引起內質網應激，誘導癌細胞凋亡和自噬[14]。本課題組在天然產物的金屬化修飾方面做了一系列研究，并取得了較大的進展。我們發現，將天然產物與金屬配合物連接后能夠克服天然產物固有的缺陷。將姜黃素與半夾心Os（Ⅱ）芳烴偶聯，開辟了Os?芳烴配合物的光化學療法[15]。對天然產物阿魏酸進行化學修飾后，通過酰胺反應與環金屬釕連接，使其具有良好的熒光性能[16]，將紫蘇醇引入到芳基釕配合物中，克服了其劑量大、毒性大的缺點[17]。齊墩果酸(oleanolic acid)是廣泛存在于天然植物中的一種提取物，表現出較強的抗腫瘤活性，能抑制多種腫瘤細胞的增殖(如慢性粒細胞白血病細胞、人宮頸癌細胞及肝癌細胞株等)，通過調控細胞周期的停滯節點以達到殺死腫瘤的效果[18?21]。然而，由于齊墩果酸水溶性差、藥用劑量大及生物相容性差等缺陷，限制了其在臨床上的發展。因此，將其與水溶性、生物相容性好的環金屬銥結合，將有可能提高齊墩果酸的成藥性，同時也有助于提高配合物的生物活性。銅催化的疊氮?炔環加成(CuAAC)反應是諾貝爾化學獎得主K.Barry Sharpless于2001年提出的，其可在細胞內發生，具有反應速率快、副產物對細胞無毒、條件溫和、對水與氧等環境不敏感等特性，已廣泛應用于生物和化學領域[22]。

在本研究中，我們將齊墩果酸、環金屬銥分別通過化學修飾，制備出含有炔基或疊氮基團的前體，通過CuAAC反應得到了新型配合物。通過現代分析手段對化合物組成及脂溶性進行了表征和測試，同時研究了細胞毒性及抗癌機理。

1 實驗部分

1.1 實驗試劑和儀器

三氯化銥水合物(IrCl3·H2O)、4?疊氮基甲基?4′?甲基?2，2′?聯吡啶(N3?bpy)根據文獻路線合成[23]。其余試劑均為購買后直接使用，未進行任何提純。齊墩果酸、二氧化硒、五水合硫酸銅(CuSO4·5H2O)、抗壞血酸鈉、2?苯基吡啶、炔丙胺、1?(3?二甲氨基丙基)?3?乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDCI)、1?羥基苯并三氮唑(HOBT)、硼氫化鈉、疊氮化鈉購于天津希恩思。其余試劑購于南京晚晴。牛血清白蛋白(BSA)、Dulbecco′s Modified Eagle Medium 細 胞 培 養 基(DMEM)、雙抗(鏈霉素和青霉素)、胰蛋白消化酶、An?nexin V?FITC細胞凋亡檢測試劑盒、2′，7′?二氯熒光素二乙酸鹽(H2DCF?DA)試劑盒等生物試劑均購于南京凱基生物。

1H NMR波譜使用Bruker Avance Ⅱ 400 MHz光譜儀檢測。電噴霧電離質譜(ESI?MS)使用LCQ光譜儀(Thermo Scientific)質譜儀檢測。UV?Vis光譜使用Lambda 365紫外可見分光光度計測得。熒光光譜使用FS5熒光分光光度計(Edinburgh Instrument)獲得。細胞毒活性通過多功能酶標儀LabServ K3測定。用激光共聚集顯微鏡(A1，Nikon)測試配合物在細胞內的共定位成像。應用流式細胞儀(BD FACSverse，美國)進行細胞凋亡、周期及活性氧等分析測定。

1.2 配體及配合物的合成

1.2.1 配體OA?alkyne的合成

在冰浴和氬氣保護條件下，將齊墩果酸(0.91 g，2.0 mmol)與 EDCI(0.38 g，4 mmol)溶于 50 mL 無水DMF中，緩慢滴加300μL三乙胺，并在0℃下攪拌20 min，隨后加入含有HOBt(0.21 g，1.6 mmol)的無水DMF溶液，繼續攪拌20 min。最后，加入炔丙胺(0.13 g，2.4 mmol)，反應16 h。然后加入50 mL水，用二氯甲烷(3×20 mL)萃取，合并有機層，用無水硫酸鈉干燥，旋蒸除去二氯甲烷，粗產物經柱層析純化(DCM/MeOH，200∶1，V/V)，得到0.47 g白色固體產物OA?alkyne(產率 50%)。1H NMR(400 MHz，DMSO?d6)：δ 7.68(q，J=5.7 Hz,1H)，5.21(d，J=3.4 Hz,1H)，4.30(d，J=5.1 Hz,1H),3.88～3.70(m,2H)，3.03～2.97(m，1H)，2.96(t，J=2.5 Hz，1H)，2.79(dd，J=13.6，4.5 Hz，1H)，1.93～1.20(m,21H),1.14～1.02(m，6H)，0.87(dd，J=11.1，7.6 Hz，16H)。

1.2.2 橋聯配體N3?bpy的合成

在氬氣的保護下，向150 mL 1，4?二氧六環中加入4，4′?二甲基?2，2′?二聯吡啶(8.0 g，43.0 mmol)和二氧化硒(8.0 g，71 mmol)，將該混合物回流24 h。使其冷卻到室溫，過濾，旋轉蒸發，干燥，加入三氯甲烷，得到黃色固體，將所得的固體溶于50 mL甲醇中，并置于冰浴中，繼續用溶解有2.8 g NaBH4的20 mL氫氧化鈉(0.1 mol·L?1)溶液滴加到上述混合物中，在室溫下攪拌1 h，旋轉蒸發除去甲醇，剩余的水溶液用飽和碳酸氫鈉溶液稀釋后用三氯甲烷萃取。用無水硫酸鈉干燥，旋轉蒸發除去溶劑，并通過柱層析法純化(DCM/MeOH，110∶1，V/V)，得到白色固體L1(4.0 g，47%)。

在40 mL的48%溴化氫溶液中添加上述獲得的L1(2.0 g，10.0 mmol)，再將10 mL濃硫酸加至該溶液中，回流過夜。待冷卻到室溫后，將該混合物倒入100 mL的冰水中，用碳酸鈉調整pH值到8.0，然后用三氯甲烷萃取無色的有機層，然后用無水硫酸鈉干燥，旋轉蒸發除去溶劑；經柱層析純化(DCM/MeOH，50∶1，V/V)，獲得 L2(2.4 g，93%)。將 L2(5 g，19 mmol)和疊氮化鈉(6.4 g，86 mmol)溶解在 DMF/H2O(10∶1，V/V，50 mL)中，并將混合物在70 ℃下攪拌過夜，真空除去溶劑，用二氯甲烷萃取并用水洗滌，無水硫酸鈉干燥后除去溶劑，用柱色譜純化(DCM/TEA，40∶1，V/V)后得到白色油狀固體N3?bpy(4.0 g，87%)。1H NMR(400 MHz，DMSO?d6)：δ 8.68(dd，J=4.9，0.8 Hz，1H)，8.55(dd，J=5.0，0.8 Hz，1H)，8.38(dd，J=1.7，0.9 Hz，1H)，8.26(dt，J=1.7，0.9 Hz，1H)，7.44～7.41(m，1H)，7.31(ddd，J=5.0，1.8，0.8 Hz，1H)，4.70(s，2H)，2.42(d，J=0.7 Hz，3H)。

1.2.3 CycloIr?N3的合成

將 IrCl3·H2O(0.31 g，1 mmol)與2?苯基吡啶(ppy，0.62 g，4 mmol)溶解在 2?乙氧基乙醇(20 mL)和水(10 mL)混合溶劑中，加熱回流過夜。反應完成后，冷卻至室溫過濾，再將沉淀物溶于40 mL二氯甲烷中離心，取上清液。將20 mL的甲苯和10 mL的正己烷添加到濾液中，旋蒸將溶劑量減少至10 mL，在4℃冰箱靜置一晚，獲得[Ir(ppy)2Cl]2。在氬氣保護條件下，稱取[Ir(ppy)2Cl]2(1.07 g，1.0 mmol)和 N3?bpy(0.55 g，2.2 mmol)溶解于二氯甲烷與甲醇(3∶1，V/V，24 mL)中，將混合物在40℃下回流攪拌過夜。旋轉蒸發去除溶劑，將固體溶于15 mL甲醇，向上述甲醇溶液中緩慢加入飽和六氟磷酸銨溶液，收集得到的黃色固體沉淀，用硅膠柱層析(DCM/MeOH，100∶1，V/V)，得到0.61 g黃色固體產物CycloIr?N3，產率約為35%。1H NMR(400 MHz，CDCl3)：δ 8.60(d，J=1.7 Hz，1H)，8.54(s，1H)，7.96～7.88(m，3H)，7.82～7.75(m，3H)，7.70(dt，J=8.0，1.5 Hz，2H)，7.54(ddd，J=7.5，5.8，1.3 Hz，2H)，7.43(dd，J=5.7，1.6 Hz，1H)，7.23～7.20(m，1H)，7.06(dtdd，J=13.1，7.1，5.7，1.4 Hz，4H)，6.93(tdd，J=7.5，3.2，1.3 Hz，2H)，6.32(ddd，J=7.7，3.4，1.2 Hz，2H)，4.81(s，2H)，2.62(s，3H)。MS(m/z)：[CycloIr?N3?PF6]+理論值726.2，實驗值726.1。

1.2.4 配合物CycloIr?OA的合成

在氬氣保護下，將配合物CycloIr?N3(0.029 g，0.04 mmol)、配體 OA?alkyne(0.024 g，0.05 mmol)、CuSO4·5H2O(0.002 g，0.01 mmol)與 抗 壞 血 酸 鈉(0.001 g，0.01 mmol)加入到5 mL無水DMF中，在室溫和黑暗條件下，將混合物攪拌8 h，旋蒸除去溶劑DMF，通過硅膠柱層析純化(DCM/MeOH，200∶1，V/V)，得到黃色配合物 CycloIr?OA(0.017 g，32%)。1H NMR(400 MHz，DMSO?d6)：δ 8.86(dd，J=19.8，1.7 Hz，1H)，8.31～8.22(m，2H)，8.00(d，J=9.3 Hz，1H)，7.97～7.76(m，6H)，7.70(d，J=5.6 Hz，1H)，7.66～7.51(m，3H)，7.17(dddd，J=14.5，11.5，5.8，1.5 Hz，3H)，7.01(tdd，J=7.2，5.8，1.3 Hz，2H)，6.95～6.82(m，2H)，6.23～6.10(m，2H)，5.83(d，J=5.2 Hz，2H)，5.13(q，J=3.1 Hz，1H)，4.33(d，J=5.0 Hz，1H)，4.24(q，J=7.5，5.4 Hz，2H)，2.97(t，J=7.0 Hz，1H)，2.77～2.71(m，1H)，2.55(s，3H)。MS(m/z)：[CycloIr?OA?PF6]+理論值 1 220.62，實驗值1 219.65。

1.3 配合物的光物理性質檢測

使用紫外可見分光光度計檢測配合物前體和配合物的紫外可見吸收光譜。將配體和配合物溶于 DMSO 中，配制出 20 mmol·L?1的濃儲液，再用Milli?Q超純水將配合物前體和配合物的濃儲液稀釋成 30 μmol·L?1的樣品溶液(H2O/DMSO，99∶1，V/V)，并在實驗時將吸收波長采集范圍設為250～600 nm。

使用熒光分光光度計檢測前體CycloIr?N3和配合物CycloIr?OA在298 K下的熒光發射光譜。用水將前體CycloIr?N3和配合物CycloIr?OA的濃儲液分別稀釋成10 μmol·L?1的樣品溶液(H2O/DMSO，99∶1，V/V)，并記錄下400～800 nm范圍內的發射光譜(激發波長為 405 nm)。

1.4 細胞毒性研究

用 MTT 法對 OA?alkyne、CycloIr?N3、配合物CycloIr?OA以及陽性對照藥物順鉑(cisplatin)進行細胞毒活性測定。選取人源癌細胞A2780、A549、HeLa以及正常人肺成纖維HLF細胞。細胞在DMEM中培養。將對數生長期的細胞接種在96孔板(每孔5 000個)中，在CO2體積分數5%、310 K條件下培養過夜，然后加入不同濃度的待測藥物(DMEM/DMSO，99∶1，V/V)繼續孵育48 h。每孔加入20 μL MTT(5 mg·mL?1)，繼續孵育4 h。小心地將培養液吸出，溶解在150μL的DMSO中，使用LabServ K3酶標儀進行振蕩混勻后，讀取590 nm處吸光度值，計算半抑制濃度(IC50)。

1.5 配合物的脂溶性測試

使用搖瓶法[24]測試并計算 CycloIr?N3和CycloIr?OA的脂水分配系數lg Po/w。將等體積的正辛醇與0.9%的氯化鈉溶液振搖2 d，使兩相之間混合充分，將配體和配合物分別溶解在氯化鈉溶液中，然后加入等量的正辛醇，在37 ℃、500 r·min?1下搖動6 h，將樣品在 8 000 r·min?1的轉速下離心 8 min，用分液漏斗將兩相分離，使用紫外可見分光光度計分別測試有機相和水相中的吸光度，利用對數求出lg Po/w。最后結果用3次獨立實驗的平均值表示。

1.6 配合物的細胞定位檢測

分別使用線粒體探針Mito?green，溶酶體探針Lyso?blue和細胞核探針Hoechst33342檢測A2780細胞的3種亞細胞器中CycloIr?OA的分布情況。將A2780細胞以5×105mL?1的密度接種于4孔板中，在CO2體積分數5%、310 K條件下孵育12 h，以保證其貼壁生長。然后向其中加入含2 μmol·L?1CycloIr?OA的DMEM培養基(DMEM/DMSO，99∶1，V/V)溶液繼續孵育12 h。將培養基吸出，用磷酸鹽緩沖溶液(PBS)洗滌 3 次，分別加入 2 μmol·L?1探針避光孵育 30 min，用PBS洗滌3次，在共聚焦顯微鏡下進行測試。

1.7 配合物誘導細胞凋亡檢測

利用細胞凋亡檢測試劑盒探究配合物CycloIr?N3和CycloIr?OA誘導A2780細胞的死亡方式。在6孔板中接種上密度為1.5×106mL?1的A2780細胞，在CO2體積分數5%、310 K條件下孵育12 h，以保證其貼壁生長。然后向每孔中加入只含有1%DMSO的DMEM培養基(DMEM/DMSO，99∶1，V/V)以及含有不同濃度梯度的配合物培養基繼續孵育24 h。收集細胞，用1×PBS緩沖液清洗細胞2次，加入500μL的Binding buffer，重懸細胞。將5μL的V?FITC和5μL的PI加入到每個孔中后，在黑暗條件下染色20 min，并使用流式細胞儀對樣品進行檢測。

1.8 配體和配合物誘導細胞內活性氧檢測

將 A2780 細胞以 1.5×106mL?1的密度接種于 6孔板中，在CO2體積分數5%、310 K條件下孵育12 h。然后向其中加入只含有DMSO的DMEM培養基(DMEM/DMSO，99∶1，V/V)以及含有不同濃度梯度CycloIr?N3和CycloIr?OA的培養基繼續孵育12 h，用1×PBS緩沖液洗滌3次，在避光條件下，加入無血清DMEM稀釋的H2DCF?DA探針(10 μmol·L?1)孵育25 min。收集細胞，用1×PBS洗滌2次，加入500μL并重懸。通過流式細胞儀在對樣品進行分析，并使用FlowJo 10.1處理數據。

將A2780細胞以5×105mL?1的密度接種于共聚焦小皿中，在CO2體積分數5%、310 K條件下孵育12 h，接著將含2 μmol·L?1待測藥物的 DMEM培養基(DMEM∶DMSO，99∶1，V/V)溶液加入到皿中，繼續孵育12 h。在避光條件下，使用H2DCF?DA(10μmol·L?1)探針染色 25 min，用 1×PBS 緩沖液洗滌 2次，通過共聚焦成像進行監測。λex=488 nm，λem=(510±20)nm。

1.9 配合物阻滯細胞周期檢測

使用細胞周期檢測試劑盒研究配合物CycloIr?N3和CycloIr?OA對A2780細胞周期的影響。在6孔板中接種上密度為1.5×106mL?1的A2780細胞，在CO2體積分數5%、310 K條件下孵育12 h。接著將含有不同濃度梯度的配合物孵育細胞24 h。收集細胞，用1×PBS(4℃)洗滌2次，加入體積分數為70%的冰乙醇來重懸細胞，并置于4℃的冰箱中固定過夜。將固定的細胞離心收集細胞(5 000 r·min?1，5 min，4 ℃)，并將染色液(PI/RNase A，9∶1，V/V)加入到細胞中繼續孵育30 min。用流式細胞儀對樣品進行檢測(λex=488 nm，λem=620 nm)。

2 結果與討論

2.1 合成與表征

選取齊墩果酸進行化學修飾得到炔端配體OA?alkyne[25]，將橋聯配體 N3?bpy 與銥二聚體[Ir(ppy)2Cl]2進行反應得到含有疊氮端的環金屬銥配合物前體CycloIr?N3，將CycloIr?N3與OA?alkyne在銅催化的條件下進行CuAAC反應[26]，得到新配合物CycloIr?OA，合成路徑如圖1所示，并通過1H NMR及 ESI?MS 對配合物進行了表征(圖 S1～S4，Support?ing information)。

圖1 通過CuAAC反應合成CycloIr?OA的路線Fig.1 Synthetic routes for complex CycloIr?OA

2.2 配合物前體和配合物的光學性質

金屬配合物所具有的光物理性質有助于實現在體內進行跟蹤檢測，并進一步探索其在細胞中的生理功能[27]。圖 2A、2B 分別為前體 CycloIr?N3、配合物CycloIr?OA的紫外吸收及熒光發射光譜。CycloIr?N3的紫外吸收波長主要在250 nm，熒光發射波長在600 nm，這與CycloIr?OA的紫外吸收和熒光發射波長基本吻合。CycloIr?OA在250～450 nm的吸收峰歸屬于金屬到配體的電荷轉移(1MLCT及3MLCT)，及配體到配體的電荷轉移(LLCT)[28]。CycloIr?OA用405 nm的光激發時，在600 nm處有較強的熒光發射峰，為在體內進行可視追蹤提供了可能。

圖2 CycloIr?N3(A)及CycloIr?OA(B)在298 K時水溶液(20 μmol·L?1)中的紫外可見吸收和熒光發射譜圖Fig.2 UV?Vis absorption and emission spectra of 20 μmol·L?1solution of ligand CycloIr?N3(A)and complex CycloIr?OA(B)at 298 K

2.3 配合物的脂水分配系數

藥物的親水性或親脂性過高或低會對藥效產生不利影響[29]。這種性質常用lg Po/w表示，其值越大，化合物越容易透過細胞膜進入細胞內，反之化合物易溶于水。我們使用搖瓶法對CycloIr?N3和CycloIr?OA的脂溶性進行了測試，并用lg Po/w說明化合物的親脂性能。CycloIr?N3和 CycloIr?OA 的lg Po/w分別為1.82±0.03和0.8±0.05，這表明引入齊墩果酸后有效加強了配合物CycloIr?OA的水溶性，克服了齊墩果酸原有的水溶性差等缺陷，使其與人體環境更好地適配，增加了藥物的吸收速度。

2.4 細胞毒性活性研究

采用MTT法測定了OA?alkyne、CycloIr?N3和CycloIr?OA對腫瘤細胞A2780、A549、HeLa及正常細胞HLF的細胞毒性，以順鉑為對照化合物。由IC50值(表1)可以看出，配體OA?alkyne對上述腫瘤細胞表現出較低毒性，其中對A2780細胞的IC50為40.5 μmol·L?1；CycloIr?N3對上述腫瘤細胞均表現出較好的抗腫瘤活性，尤其對A2780細胞的毒性最好，IC50低至 5.6 μmol·L?1。而當兩者通過CuAAC 反應結合后，得到的新配合物CycloIr?OA對上述腫瘤細胞的毒性有了明顯的提升，優于臨床藥物順鉑：對A2780 細 胞 的 IC50僅 為 1.6 μmol·L?1，比 前 體CycloIr?N3的活性提高了2.5倍，僅為順鉑的IC50的五分之一。這一結果表明，天然產物齊墩果酸的引入可以較大地提升金屬配合物的抗腫瘤活性，為高活性抗癌金屬藥物的研制提供了新途徑。由于配合物CycloIr?OA對A2780細胞的抗癌活性最佳，我們選用A2780細胞進行抗癌作用機理研究。

表1 化合物OA?alkyne、CycloIr?N3、CycloIr?OA對癌細胞A2780、A549、HeLa和正常細胞HLF 48 h的IC50值Table 1 IC50values of OA?alkyne,CycloIr?N3,and CycloIr?OA against A2780,A549,HeLa cancer,and normal HLF cell lines for 48 hμmol·L?1

2.5 配合物的亞細胞器分布

激光共聚焦成像是探索藥物亞細胞器定位常用的方法[30]。配合物CycloIr?OA具有良好的熒光性質，因此我們使用3種商用的細胞器探針Mito?green( 線 粒 體)、Lyso?blue(溶 酶 體) 及Hoechst33342(細胞核)，通過共聚焦顯微鏡分析了CycloIr?OA在A2780細胞內的分布情況。如圖3所示，CycloIr?OA的紅色熒光與線粒體探針Mito?green的熒光信號有較好的重疊，處理分析后得到CycloIr?OA與線粒體共定位系數為0.92，與溶酶體的共定位系數為0.52，基本不定位在細胞核，結果說明CycloIr?OA靶向A2780細胞的線粒體。線粒體是細胞和生物體內穩態的重要調節者，涉及許多復雜的癌癥生物學過程，如細胞信號傳遞、細胞代謝和細胞死亡等。因此，線粒體成為抗腫瘤的重要靶點[31]。靶向線粒體是一種可行、有效和安全的抗腫瘤靶向策略。

圖3 配合物CycloIr?OA與A2789細胞于37℃孵育24 h后的共聚焦顯微鏡圖,圖中可以看到CycloIr?OA主要分布在線粒體Fig.3 Confocal micrograph of complex CycloIr?OA and A2789 cells incubated at 37 ℃ for 24 h shows that CycloIr?OA is mainly distributed in mitochondria

2.6 配合物CycloIr?OA誘導細胞內活性氧的產生

正常細胞通過控制細胞內活性氧(ROS)水平來調控細胞內信號傳導、細胞增殖及細胞死亡等生理過程。據文獻報道，促進癌細胞產生ROS是金屬藥物殺傷腫瘤細胞的作用機制之一[32]。因此為了進一步研究配合物CycloIr?OA誘導細胞死亡的作用機理，我們使用商業化的ROS探針H2DCF?DA檢測了腫瘤細胞中的ROS水平[33]。細胞中產生的ROS可以將探針氧化為有熒光的DCF，可以通過觀察熒光強度表示細胞內ROS水平。CycloIr?N3處理后A2780細胞的綠色熒光強度沒有明顯增強，流式細胞術結果也證實了CycloIr?N3處理后細胞內ROS增加并不明顯(圖S5)。CycloIr?OA處理后的A2780細胞與未加藥的對照組相比綠色熒光強度增強(圖4A)，表明齊墩果酸的引入可誘導細胞產生過量的ROS。流式細胞術也證實了CycloIr?OA處理后細胞內ROS的增加(圖4B)，并呈現出配合物的濃度依賴性，說明ROS的產生可能是誘導癌細胞死亡的原因之一。

圖4 CycloIr?OA誘導A2780細胞產生ROS:(A)CycloIr?OA(2 μmol·L?1)處理A2780細胞12 h后ROS生成的共聚焦圖像;(B)CycloIr?OA(control和1、2、4 μmol·L?1)處理A2780細胞12 h后ROS生成的流式細胞圖Fig.4 ROS generation induced by CycloIr?OA in A2780 cells:(A)confocal images of ROS generation in A2780 cells treated with CycloIr?OA(2 μmol·L?1)for 12 h;(B)ROS generation in A2780 cells treated with different concentrations of CycloIr?OA(control and 1,2,4 μmol·L?1)for 12 h by flow cytometry

2.7 配合物誘導A2780細胞周期阻滯和凋亡

通過流式細胞儀研究了CycloIr?OA對細胞周期的影響，結果如圖5所示。與未加藥物的對照組相比，當將不同濃度的CycloIr?OA孵育A2780細胞24 h后，配合物誘導的S期的細胞比例隨藥物濃度的增大而增大；用6 μmol·L?1CycloIr?OA處理后S期細胞數量由13.2%增長到34.9%，而G0/G1期細胞數量從64.5%減少至38.4%，說明CycloIr?OA以濃度依賴的方式將細胞周期阻滯在S期，從而誘導細胞死亡。經不同濃度前體配合物CycloIr?N3處理后的細胞，隨著藥物濃度的增加，未能對A2780細胞起到阻滯作用(圖S6)。上述結果說明將齊墩果酸引入到環金屬銥中，增強了其對細胞阻滯的效果。

圖5 CycloIr?OA(control和2、4、6 μmol·L?1)和A2780孵育24 h后并用PI染色，通過流式細胞術測定細胞周期Fig.5 Cell cycle assay of A2780 cells by flow cytometry after incubation with CycloIr?OA(control and 2,4,6 μmol·L?1)for 24 h and stained with PI

細胞凋亡揭示了一種廣泛的免疫病的致病機理，尤其是凋亡與腫瘤的相關性越來越受到關注[34?35]。通過流式細胞儀對配合物CycloIr?OA誘導細胞凋亡的情況進行檢測，結果如圖6所示。在二維散點圖上，Annexin V是x軸，PI是y軸，十字門將圖片分為4個象限：左上象限Q1區域的細胞為壞死細胞；右上象限Q2區域的細胞為晚期凋亡細胞；右下象限Q3區域的細胞為早期凋亡細胞；左下象限Q4區域的細胞為活細胞[36]。可以看出，隨著濃度的增加，處于壞死區域的細胞比例在逐漸增加。在用4 μmol·L?1的藥物處理24 h后，壞死細胞的含量由2.20%增加到75.2%。而經同樣濃度的CycloIr?N3處理后，壞死細胞含量僅由9.34%增加到12.1%(圖S7)，由此可見，環金屬銥連接齊墩果酸后，使腫瘤細胞壞死數量有了明顯提高。因此，CycloIr?OA主要以誘導腫瘤細胞壞死的方式導致細胞的死亡。

圖6 CycloIr?OA(control和1、2、4 μmol·L?1)和A2780孵育24 h并用Annexin V?FITC和PI染色后,通過流式細胞術進行凋亡測定Fig.6 Apoptotic assays of A2780 cells by flow cytometry after incubation with CycloIr?OA(control and 1,2,4 μmol·L?1)for 24 h and stained with Annexin V?FITC and PI

3 結論

我們通過點擊反應將無毒性的五環三萜類化合物齊墩果酸引入到環金屬銥配合物中，配合物CycloIr?OA的抗腫瘤活性有較大提升，明顯優于臨床藥物順鉑，對A2780細胞的IC50為1.6 μmol·L?1，僅為順鉑的五分之一。CycloIr?OA主要富集在線粒體中，通過產生大量活性氧殺傷腫瘤細胞，并將腫瘤細胞周期阻滯在S期，誘導腫瘤細胞的壞死。將天然產物引入到金屬前體中，不僅提高了配合物的抗腫瘤活性，而且拓展了天然產物在金屬藥物中的應用，為新型高活性金屬配合物的設計、合成提供了指導。

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