潰瘍性結腸炎患者血清Rac1、ACE2水平與腸道功能損害的相關性

王楊，田玉偉

潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis，UC)是一種慢性復發性結腸疾病，其特征是對腸道菌群的先天性和適應性免疫反應失調，導致腸道炎癥過程的持續存在，主要涉及直腸、結腸黏膜和黏膜下層等部位，以腹瀉、膿血便、腹痛為主要臨床表現，目前認為其機制與腸道屏障功能、遺傳環境及腸道感染等相關[1-3]。研究發現Ras相關的C3肉毒素底物1(Ras-related C3 botulinum toxin substrate 1，Rac1)是Rho GTP酶家族的Rac亞家族中的一員，具有多種生物學功能，如可調控細胞增殖與凋亡、吞噬作用、細胞遷移、侵襲與轉移、血管生成等，是一種關鍵信號傳感器，已被證明可控制細胞炎癥反應[4-5]。血管緊張素轉化酶2(angiotensin converting enzyme 2，ACE2) 主要在肺和腸的上皮細胞中表達，腸道可能是病毒襲擊的潛在靶器官[6]。ACE2不僅參與水鹽代謝以及血壓調節，在炎癥反應中也發揮關鍵作用，如申正杰等[7]研究發現腹瀉豬中ACE2水平顯著下調，導致炎性發展，進而導致死亡。腸道屏障功能可以防止毒素、細菌等有害物質穿過腸黏膜侵入人體內其他器官、組織，而炎癥級聯反應可能通過各種機制導致腸道屏障破壞，進而導致疾病的加重[8]。但ACE2與Rac1水平對腸道屏障功能的研究較少，因此本研究對UC患者血清中ACE2與Rac1水平進行檢測，分析其與腸道屏障功能的關系，現將相關結果報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2020年3月至2022年3月駐馬店中心醫院就診的UC患者60例，其中男28例，女32例，年齡18～68歲，平均年齡(45.22±4.52)歲，記為病例組。根據Mayo評分標準進行分組，0分：排便無出血現象且次數正常；1分：排便次數增加1～2次且不到一半時間內出現便中混血，內鏡檢測輕度病變；2分：排便次數增加3～4次，大多數大便中帶血，內鏡檢測中度病變；3分：排便次數增加5次及以上，一直存在出血，內鏡檢測重度病變。60例UC患者中Mayo評分≤2分為緩解期組、＞2分為活動期組，其中活動期組UC患者36例，男15例，女21例，年齡20～68歲，平均年齡(44.88±5.02)歲；緩解期組UC患者24例，男13例，女11例，年齡18～66歲，平均年齡(45.74±3.76)歲；選取同期健康體檢者40例，男19例，女21例，年齡21～66歲，平均年齡(44.28±4.27)歲，記為對照組。對比病例組、對照組在年齡、性別等方面差異無統計學意義，具有可比性(P＞0.05)。本研究患者均簽署知情同意書，并經駐馬店中心醫院醫院倫理委員會審核通過(批號：202020012)。

1.2 選取標準 UC患者診斷標準：符合《中國炎癥性腸病組織病理診斷共識意見》[9]中診斷標準；相關量表評估資料、就診資料等臨床資料保存完整。排除標準：哺乳期、妊娠期女性；患有其他疾病如免疫性疾病、心肺疾病、感染性疾病、肝腎疾病、精神疾病、腫瘤疾病、血液性疾病患者；合并腸梗阻、穿孔等結腸擴張；無法配合完成本研究者如認知功能障礙等。

1.3 主要試劑與儀器 美國羅氏公司提供熒光定量PCR 儀；北京索萊寶科技有限公司提供RT-PCR試劑盒；上海生工生物工程股份有限公司提供ACE2 ELISA試劑盒；Bio-Rad公司提供酶標儀(MODEL550型)；長沙英泰儀器有限公司提供TD5A自動離心機。

1.4 研究方法

1.4.1 樣本采集 60例UC患者及40例健康體檢者分別于清晨抽取空腹靜脈血9 mL，3 000 r/min離心10 min，將分離得到的血清置入-20 ℃冰箱保存。

1.4.2 ELISA法檢測血清ACE2水平 收集1.4.1中血清樣本，嚴格按照ACE2 ELISA試劑盒操作步驟嚴格進行檢測血清中ACE2水平。

1.4.3 腸道功能指標檢測 收集1.4.1中血清樣本，送至駐馬店中心醫院檢驗科檢測腸道屏障指標(血清二胺氧化酶、細菌內毒素、D-乳酸)。

1.4.4 qRT-PCR檢測血清中Rac1 mRNA表達水平

收集1.4.1中血清樣本，采用Ficoll密度梯度分離法分離血清中單核細胞，加入TRIzol試劑充分吹打混勻使其裂解，制備細胞懸液進行提取RNA，具體操作：加入氯仿溶液，室溫靜置片刻后進行離心，3 500 r/min離心15 min，將上層水相轉移至離心管中，之后加入異丙醇溶液，按照上述操作再次離心，離心后棄上清，管底沉淀即為RNA。加10 μL的RNase free H2O，充分溶解RNA，將RNA在PCR儀中，于85 ℃下5 s，37 ℃下15 min逆轉錄合成cDNA。配制定量20 μL PCR體系，于熒光定量PCR儀上進行擴增反應，設置條件：95 ℃下預變性5 min，95 ℃下變性10 s，退火30 s，72 ℃下延伸1 min。采用2-△△Ct法計算Rac1 mRNA表達量。其中Rac1引物序列及相應內參GAPDH引物序列，見表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.5 統計學方法 數據均采用SPSS 23.0處理，計量資料如血清中Rac1、ACE2水平以及腸道屏障指標(血清二胺氧化酶、細菌內毒素、D-乳酸)等以均數±標準差(±s)表示，行t檢驗；Pearson法分析UC患者血清中Rac1、ACE2水平與腸道功能損害的相關性。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組血清中ACE2、Rac1 mRNA水平比較 與對照組相比，病例組患者血清中ACE2、Rac1 mRNA水平顯著下降(P＜0.05)，見表2。

表2 兩組血清中ACE2、Rac1 mRNA水平比較(±s)

表2 兩組血清中ACE2、Rac1 mRNA水平比較(±s)

注：ACE2＝血管緊張素轉化酶2，Rac1＝Ras相關的C3肉毒素底物1；下同。

組別 例數 ACE2/(pg·mL-1) Rac1 mRNA對照組 40 322.24±32.23 1.02±0.11病例組 60 267.96±26.80 0.81±0.08 t值 9.143 11.050 P值 ＜0.001 ＜0.001

2.2 病例組中緩解期組和活動期組血清中ACE2、Rac1 mRNA水平比較 與緩解期組相比，活動期組患者血清中ACE2、Rac1 mRNA水平顯著下降(P＜0.05)，見表3。

表3 病例組中緩解期組和活動期組血清中ACE2、Rac1 mRNA水平比較(±s)

表3 病例組中緩解期組和活動期組血清中ACE2、Rac1 mRNA水平比較(±s)

組別 例數 ACE2/(pg·mL-1) Rac1 mRNA緩解期組 24 291.18±29.12 0.89±0.09活動期組 36 252.48±25.25 0.75±0.08 t值 5.469 6.316 P值 ＜0.001 ＜0.001

2.3 兩組血清中腸道屏障指標水平比較 與對照組相比，病例組患者血清中二胺氧化酶、細菌內毒素、D-乳酸水平顯著增加(P＜0.05)，見表4。

表4 兩組血清中腸道屏障指標水平比較(±s)

表4 兩組血清中腸道屏障指標水平比較(±s)

?組別 例數 二胺氧化酶/(U·mL-1) 細菌內毒素/(EU·mL-1) D- 乳酸/(μg·mL-1)對照組 40 2.48±0.25 0.45±0.05 7.24±0.73病例組 60 3.15±0.32 0.58±0.06 8.78±0.88 t值 11.159 11.325 9.160 P值 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

2.4 UC患者血清中ACE2、Rac1 水平的相關性

Pearson法結果顯示，UC患者血清中Rac1 mRNA與ACE2呈正相關(r＝0.390，P＜0.05)，見圖1。

圖1 UC患者血清中ACE2、Rac1水平的相關性

2.5 UC患者血清中ACE2、Rac1mRNA與腸道屏障指標水平的相關性 UC患者血清中Rac1 mRNA、ACE2分別與二胺氧化酶、細菌內毒素、D-乳酸水平呈負相關(P＜0.05)，見表5。

表5 UC患者血清中ACE2、Rac1 mRNA與腸道屏障指標水平的相關性

3 討論

UC是一種復發和緩解的炎癥性腸病，其特征是黏膜炎癥，從遠端開始，可向近端延伸，累及整個結腸，其發病率和患病率均在增加[10]。雖然皮質類固醇、益生菌、5-氨基水楊酸、免疫抑制劑和生物制劑已成功緩解癥狀，但依然存在高復發率以及不可避免的副作用如惡心、嘔吐、骨髓抑制、感染概率和致癌風險等，因此需要進一步關注UC進展中的指標變化，對于其臨床治療意義重大[11]。

腸道是全身性菌血癥和毒血癥的發源地，也是多器官功能障礙綜合征的樞紐器官，是炎癥介質的擴增器，而許多重癥患者的預后往往與腸道屏障功能密切相關[12]。如周文浩等[13]研究發現乙型肝炎肝硬化患者存在腸道屏障功能被破壞，關注患者血清中胰島素樣生長因子Ⅰ水平變化，有助于判斷腸道屏障功能損傷。二胺氧化酶、細菌內毒素、D-乳酸是目前臨床上多采用間接反映胃腸黏膜細胞功能的方法[14]。二胺氧化酶主要存在小腸黏膜上層絨毛中，當腸道屏障功能被破壞時，在外周血中的二胺氧化酶的含量便會由穩定狀態急劇增加，進入血液中循環。D-乳酸是細菌代謝產物，當腸黏膜受損時，便會引發細菌大量滋生，致使D-乳酸在腸道內積累。而內毒素在機體正常情況下僅僅存在于腸道內，腸道屏障功能一旦被破壞，便會穿過腸黏膜進入血液循環，導致內毒血癥發生。因此本實驗對UC患者血清中二胺氧化酶、細菌內毒素、D-乳酸含量進行了檢測，結果顯示UC患者血清中二胺氧化酶、細菌內毒素、D-乳酸含量較健康體檢者顯著增加，表明UC患者均存在腸道屏障功能破損。

ACE2主要分布在腎臟、心臟等主要器官，是一種金屬蛋白酶，具有緩解炎癥、舒張血管的作用[15]。ACE2受體也在腎臟和胃腸道中表達，研究發現冠狀病毒患者出現腹瀉，且在呼吸道分泌物和糞便中檢測到病毒存在，提示腸- 肺軸很可能受損[16]。楊旭輝等[17]研究發現在急性胰腺炎患者血清中ACE2水平顯著降低，隨著患者病情加重，ACE2水平也會持續降低，可作為預測該疾病的標志物。楊舒鈞等[18]研究也證明了重癥急性胰腺炎患者血清中ACE2水平較輕癥患者下降。本研究發現UC患者血清中ACE2水平較健康者下降，且活動期患者ACE2水平較緩解期患者水平降低，提示ACE2水平與UC發展有關。Pearson法分析顯示UC患者血清中ACE2水平與二胺氧化酶、細菌內毒素、D-乳酸呈負相關，表明UC患者血清中ACE2水平對評估腸道功能損害具有一定的臨床價值。

Rac1基因作為一種轉錄因子，具有GTPase酶活性，可發揮參與腫瘤發病、調節免疫細胞等生物學功能[19]。研究發現在哮喘患者血清中，Rac1水平顯著下降，水平越低，氣道炎癥越嚴重[20]。本研究發現UC患者血清中Rac1表達水平顯著下降，隨著病情的加重，其表達水平越降低，表明UC患者可能通過Rac1表達調節炎癥反應。經Pearson法分析發現UC患者血清中Rac1表達與ACE2水平呈現正相關，共同參與UC發展。除此之外，UC患者血清中Rac1 表達還與二胺氧化酶、細菌內毒素、D- 乳酸呈負相關，提示評估UC患者血清Rac1、ACE2水平，可反映患者腸道功能損害，為更進一步治療提供參考。

綜上所述，UC患者血清中ACE2與Rac1水平顯著下降，兩者呈正相關，且均與腸道屏障指標呈負相關，表明檢測兩者水平可大致反映腸道功能損害狀況，具有一定的臨床價值。但本研究僅局限本醫院調查，且樣本數據偏少可能對結果造成偏倚，還需在后期研究中繼續擴大樣本、多中心進行分析。