串聯質譜技術在河源地區新生兒遺傳代謝性疾病篩查中的臨床應用價值分析

張 旻，劉曉燕，凌振威，鄧順娣

（河源市婦幼保健院醫學遺傳科，廣東 河源 517000）

遺傳代謝疾病是影響新生兒出生質量的一大因素，目前發現的已達1000 多種。該類疾病的主要癥狀為不明原因抽搐、嘔吐、呼吸困難、肝脾腫大、生長遲緩、發育不良和精神行為異常等[1-2]。目前廣東河源地區每年仍有罹患遺傳代謝疾病的新生兒，因此，有待于臨床探索更佳的早期篩查手段和診療手段。近幾年隨著疾病篩查技術的迅速發展，用于遺傳代謝疾病篩查的方法也逐漸多樣化，其中被逐漸應用于臨床遺傳病篩查領域的串聯質譜技術（MS/MS）受到廣泛認可[3]。該技術的原理是通過將檢測樣本中的物質進行電離，從而形成各種不同質荷比的離子，利用電磁場分離后，對各種物質的峰強度進行精確測量，并通過比較待測物質與標準液來進行定性和定量分析。此技術方法有效做到了同時對一種樣本進行多種代謝物檢測，經微觀分析得到血液中的多種化合物數據，可有效提高檢測效率、靈敏度和準確性[4-5]。我院是河源地區首家開展串聯質譜技術應用的醫療機構，并且利用其對在我院出生的新生兒進行相關篩查的覆蓋率達到了100%。基于此，本文選取河源地區2021 年2月至2021 年8 月出生的3632 例新生兒作為篩查對象，探討串聯質譜技術在廣東省河源地區新生兒遺傳代謝性疾病篩查中的應用價值，以期將其在臨床中推廣應用，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取河源地區2021 年2 月至2021 年8 月出生的3632 例新生兒作為篩查對象。其中男性與女性的例數分別為1978 例、1654 例，出生時間最短為1d，最長為14d，平均出生時間為（5.2±1.7）d。早產新生兒與足月分娩新生兒的例數分別為203 例（5.59%）、3429 例（94.41%）。正常出生體重兒有3353 例，占總體的92.31% ；巨大兒105 例，占總體的2.89% ；低體重新生兒有174 例，占總體的4.79%。本研究經我院倫理委員會批準，所選取的新生兒家屬均知情同意。所納入的對象均為我院普通體檢新生兒，接受新生兒遺傳代謝性疾病篩查時新生兒已充分哺乳，哺乳次數在8 次以上。

1.2 研究方法

1.2.1 篩查標本的采集與保存 所用濾紙均為國際通用標準濾紙S＆S903。首先選擇新生兒的足跟內側或外側位置進行血液采集，采集前需注意酒精消毒，其中第一滴血液需棄用，將第二滴血液滴到檢測濾紙上，依次采集血液，待血斑濾紙自然晾干后，放入密封袋中置于4℃冰箱保存，并及時送檢。

1.2.2 實驗檢測 串聯質譜檢測儀器選用美國SCIEX公司的三重四極桿質譜儀（AB SCIEX API 3200MD），串聯質譜測定試劑盒購自華大基因生物科技有限公司，包含了多種穩定同位素標記的氨基酸、酰基肉堿代謝物，用MS/MS 系統進行分析。新生兒濾紙干血片和質控血片經萃取后直接上機測定，用內標的溶劑萃取濾紙干血片中的氨基酸、酰基肉堿代謝物。具體步驟為：1）在新篩信息系統上編輯好實驗清單，并打印出來；2）準備標本: 按照實驗清單的順序在濾紙上打下3mm 直徑的氨基酸質控、肉堿質控以及標本，并依次放置到96 孔過濾板內；3）提前一天配制內標溶液：一瓶內標粉末加入100 μL 內標溶解液，輕輕搖勻溶解，低溫超聲處理1.5h，置于4 ～8℃密封、避光環境下保存；4）配制內標工作液：內標溶液使用前用旋渦振蕩器混勻，按照內標溶液：萃取液=1:99的比例配制工作液；5）萃取: 在96 孔過濾板內加入100 μL 內標工作液，將過濾板與反應板用橡皮筋綁在一起，封膜靜置或用振蕩器振蕩30min，振蕩頻率為750 次/min；6）吹干: 反應完成后，用離心機（轉速2000 r/min）離心2 min ；將反應板取下，放置在氮氣吹掃儀上，設置氮氣流速為0.7 ～1.0，主板溫度50℃，吹掃時間20 min；7）衍生：在吹干的反應板內加入60 μL 的衍生試劑，貼上封膜，60℃下靜置孵育30min，然后取下封膜，將反應板置于氮氣吹掃儀上，在50℃氮氣流下進行吹干，時間約為20 min；8）復溶：反應板每孔加入100 μL 流動相，用離心機（轉速4000 r/min）離心5min 后即可上機檢測。

1.2.3 可疑陽性情況處理 當出現可疑陽性情況則需針對性對該例樣本進行再次檢測，若經過兩次復查后仍為陽性，即轉入專科進行專項檢查。

1.3 觀察指標

本研究主要通過串聯質譜技術檢測新生兒遺傳代謝性疾病篩查相關的氨基酸、酰基肉堿代謝產物濃度，根據各種氨基酸、酰基肉堿同位素內標的離子峰強度,由已知濃度的內標, 自動計算出所測樣品中氨基酸、酰基肉堿的濃度。分析初篩陽性結果與最后診斷的結果，并綜合分析陽性病例的基因檢測結果和尿代謝物檢測結果。

2 結果

采用串聯質譜技術檢測的3632 例新生兒中有105 例初篩可疑陽性患兒，其中病情為氨基酸代謝異常的48 例、為酰基肉堿缺陷的57 例。對105 例患兒進行后期回訪確診，其中20 例進行遺傳病基因分析，有12 例異常；9 例進行尿液氣相色譜質譜分析，有4例異常。因患兒早期得到了持續監測，及時指導喂養與治療干預，目前并無其他嚴重影響，最后確診出苯丙酮尿癥1 例，該患兒實驗室診斷發現PAH 基因點突變陽性。

2.1 3632 例新生兒實施串聯質譜技術篩查結果的分析

在遺傳代謝病篩查陽性病例中，發現氨基酸代謝障礙類遺傳代謝病48 例，其中高苯丙氨酸血癥13 例、甲硫氨酸血癥6 例、高甘氨酸血癥6 例、酪氨酸血癥6 例、Citrin 蛋白缺乏癥4 例、多種氨基酸升高4 例、楓糖尿病3 例、組氨酸血癥3 例、多種氨基酸降低2 例、苯丙酮尿癥1 例。

在遺傳代謝病篩查陽性病例中，發現酰基肉堿缺陷類遺傳代謝病57 例，其中肉堿棕櫚酰轉移酶-1 缺乏癥35 例、酰基輔酶A 脫氫酶缺乏癥11 例、原發性肉堿缺乏癥5 例、β- 酮硫解酶缺乏癥4 例、肉堿棕櫚酰轉移酶-2 缺乏癥2 例。

2.2 篩查陽性病例進行基因檢測和尿代謝物檢測結果的分析

在105 例篩查陽性病例中，有20 例新生兒進行基因檢測，初步分析結果發現12 例陽性患兒，肝豆狀核變性（Het）并Gilbert 綜合征/Crigler-Najjar 綜合征1 例，Gilbert 綜合征/Crigler-Najjar 綜合征（Het）4 例，Gilbert 綜合征/Crigler-Najjar 綜合征（Hom）1例，苯丙酮尿癥1 例，丙酮酸羧化酶缺乏癥（Het）1 例，常染色體隱性耳聾1A 型并氨基糖苷類藥物敏感性耳聾1 例，克拉伯病（Het）1 例，糖原累積病Ⅱ型（Het）1 例，肝豆狀核變性（Het）1 例。

對9 例新生兒尿代謝物檢測結果進行初步分析發現，其中有4 例陽性患兒，甲基丙二酸、戊二酸略高1 例，輕度酮尿1 例，輕度酮尿伴甘油增高1 例，酮性雙羧酸尿伴3 羥基丙酸略高1 例。

2.3 1 例確診苯丙酮尿癥患兒的基因分析

通過對1 例苯丙酮尿癥患兒實施基因分析可知，此患兒在PAH 基因2 個位置發生基因突變，都是錯義突變，分別是：1）NM_000277.1:c.721C＞T：為錯義 (missense) 變異，導致該基因轉錄本編碼的蛋白質中第 241 號氨基酸由精氨酸變為半胱氨酸。該變異在ExAC 東亞人群中發生頻率為 0.001278。在 Clinvar 中這個變異為致病變異，對應的疾病為 Phenylketonuria。在 HGMD 專業版中這個變異為致病變異，對應的疾病為 Phenylketonuria。根據 ACMG 指南， 這個變異是致病變異。2）NM_000277.1:c.611A＞G：為錯義 (missense)變異，導致該基因轉錄本編碼的蛋白質中第 204 號氨基酸由酪氨酸變為半胱氨酸。該變異在 ExAC 東亞人群中發生頻率為 0.000231。在 Clinvar 中這個變異為致病變異，對應的疾病 為 Phenylketonuria。在HGMD 專業版中這個變異為致病變異，對應的疾病為Phenylketonuria。根據 ACMG 指南， 這個變異是致病變異。詳見表1。

表1 1 例苯丙酮尿癥患兒的基因分析結果

3 討論

隨著醫療科技水平的提升，新生人口素質的提高逐漸成為了預防醫學的主要攻關方向[6-7]。相關研究[8]表明，先天性的遺傳代謝性疾病在很大程度上導致了新生兒較差的身體素質，嚴重影響后期發育，需對兒童采取相應篩查工作，以便于在疾病出現前對其作出明確的診斷。因此，對遺傳疾病的控制與治療具有重要意義。串聯質譜技術的原理主要是通過對樣品中的物質進行質荷比檢測，定性和定量分析物質成分和結構，在其臨床應用中可實現對液體樣本中幾十種物質的準確檢測，包括脂肪酸、氨基酸、酰基肉堿等常見代謝物，能有效實現快速篩查與診斷30 多種代謝性疾病，有效提高了此類疾病的早期發現率，使疾病篩查從傳統模式中的“一種實驗檢測一種疾病”轉變到了“一種實驗檢測多種疾病”的現代化高效篩查模式，使得臨床上對于遺傳代謝疾病的篩查與診斷效率得到了顯著的提高[9-11]。

本研究的結果顯示，河源地區新生兒遺傳代謝病篩查的陽性率約為2.89%（105/3632），檢出結果為氨基酸代謝障礙類遺傳代謝病和酰基肉堿缺陷類遺傳代謝病。在遺傳代謝病篩查陽性病例中，發現氨基酸代謝障礙類遺傳代謝病48 例，酰基肉堿缺陷類遺傳代謝病57 例，充分證明了串聯質譜技術對于新生兒遺傳代謝疾病有較強的檢測效果，可為后續疾病確診提供有效資料。同時，通過對患兒實施進一步確診，分別發現12 例基因結果異常和4 例尿代謝物結果異常，從側面反映了質譜檢測技術對于遺傳代謝疾病的檢測效果。

在后期的基因確診中檢出苯丙酮尿癥1 例。PAH基因變異與苯丙酮尿癥相關，遺傳方式為常染色體隱性。這例苯丙酮尿癥患兒主要發現2 個有臨床意義的基因變異，分別為蛋白質中第241 號及第204 號氨基酸發生變異， PAH 基因雙雜合致病的變異增高了新生兒患苯丙酮尿癥的風險，在后續檢測中，經過此檢測結果提示，盡快完善了該患兒的相關臨床檢查，綜合分析了患兒的臨床表型從而確診疾病，明確了串聯質譜技術在此類遺傳代謝病篩查中的應用價值。目前的研究顯示，遺傳代謝病具有明顯的種族和區域性差異，表現多樣且缺乏特異性, 易誤診，常伴高血苯丙氨酸、高尿苯丙酮酸，該病危害較大，會對中樞神經系統造成損害。如果不及時治療，會導致身體生長發育遲緩，特別是精神發育遲緩。其表現是兒童的智商低于同齡正常兒童，因此該病在本地區遺傳代謝病篩查中應加以重視[12-15]。筆者認為，通過串聯質譜技術對新生兒進行遺傳代謝性疾病篩查，能夠在早期及時準確地發現遺傳異常情況，為早期發現新生兒遺傳代謝性疾病、改善新生兒生存質量和提高人口素質提供可靠保障，并能有效降低先天性疾病對新生兒及其家庭造成的負擔。

綜上所述，串聯質譜技術在新生兒遺傳代謝性疾病篩查中具有較高的應用價值，可實現對氨基酸代謝障礙類遺傳代謝病和酰基肉堿缺陷類遺傳代謝病的精準檢測，值得推廣應用。