通過CNV-seq檢測絨毛組織染色體畸變診斷稽留流產的價值分析

譚滿勝，謝清豐，唐玉芬，陳紅玲

（1. 茂名市婦幼保健院遺傳優生優育科，廣東 茂名 525000 ；2. 茂名市人民醫院檢驗科，廣東 茂名 525000）

稽留流產是指胚胎、胎兒死亡后未完全排出體外，仍在宮腔內有滯留的一種特殊情況自然流產，因此又被稱為過期流產[1]。稽留流產是婦科的常見病之一，在臨床妊娠中其發生率約占16%，而近年來由于環境、社會等因素的改變，其發生率呈逐年上升的趨勢[2]。因此明確稽留流產病因就顯得尤為重要，其可有利于為患者提供更科學、更全面的再生育風險指導，并可顯著減輕患者的心理負擔。而稽留流產的致病因素較為復雜，與自身、社會、環境中的多個因素有關，但近年來有研究表明其中胚胎或胎兒染色體異常是最為常見的因素，可達60%[3]。此外，隨著科學技術的發展，檢測染色體的方法也逐漸多樣化，但多數檢測手段局限性較大，所以目前醫學領域的工作重點之一就是探尋一種更有效，更便捷的染色體檢測方法。染色體拷貝數變異測序（Copy Number Vara- ition sequencing ，CNV-seq ）檢測是通過高通量測序技術來獲取樣本準確的基因信息，再通過生物信息分析有效發現染色體畸變的一種新型檢測手段。其具有分辨率高、兼容性好、流程簡單易操作等優點，可檢測絨毛組織、外周血 、臍血等樣本[4]。因此，本文就CNV-seq 檢測絨毛組織染色體畸變對稽留流產的診斷價值進行分析，為相關臨床檢測及病因分析提供理論基礎。

1 對象和方法

1.1 研究對象

對2019 年1 月至2021 年3 月期間來本院就診并采用CNV-seq 檢測絨毛組織染色體畸變的175 例稽留流產患者的臨床資料進行回顧性分析，其年齡22 ～45 歲，孕周7 ～13 周，孕次1 ～4 次，產次0 ～3次；其中首次流產者35 例，連續兩次自然流產者80 例，復發性流產者60 例。患者及家屬自愿接受檢測并簽署知情同意書，研究經我院醫學倫理委員會批準（符合相關倫理標準）。

1.2 病例納入標準和排除標準

納入標準：確診為稽留流產的患者；有陰道流血、閉經史、腹痛及血、尿HCG 呈陽性的患者；簽署同意書的患者。排除標準：有HIV 的患者；有精神病或精神病史的患者；有嚴重肝腎、心腦血管疾病的患者；有孕期感染的患者。

1.3 實驗試劑與儀器

CNV-seq 專用試劑盒、BES4000 高通量測序平臺和數據分析系統（均為博奧生物集團有限公司生產）。

1.4 檢測方法

1）絨毛組織收集及送檢：對患者的外陰、陰道、宮頸進行消毒后，收集其流產絨毛組織，取約60g 放入生理鹽水中漂洗至無血液成分，然后放入裝有生理鹽水的10mL 離心管密封后連同檢測申請單一起送至廣東省婦幼保健院進行檢測。2）CNV-seq 檢測流程：對送檢的絨毛組織用CNV-seq 專用試劑盒提取基因組DNA 并進行DNA 建庫，用BES4000 高通量測序平臺進行測序，最后對測序數據進行生物信息學分析并判斷結果，詳見圖1。

圖1 CNV-seq 檢測流程圖

2 結果

2.1 CNV-seq 檢測結果

175 例患者中，成功檢測173 例，失敗2 例（樣本質量差，做退費處理），檢測成功率為98.86%，檢測出染色體畸變108 例，陽性檢出率為62.43%（108/173）。

2.2 CNV-seq 陽性數目異常檢測結果

在染色體畸變中，陽性數目異常共91 例，其中包括特納綜合征6 例，同源二倍體6 例，三倍體15 例，2- 三體2 例，3- 三體5 例，22- 三體10 例等，詳見表1。

表1 CNV-seq 陽性數目異常檢測結果

2.3 CNV-seq 陽性其他異常檢測結果

染色體畸變除去單純的數目異常外，其他異常共17 例，其中包括復合異常類/ 嵌合類8 例，占7.41%（8/108），缺失類/ 重復類9 例，占8.33%（9/108），詳見表2。

表2 CNV-seq 陽性其他異常檢測結果

3 討論

自從進入工業時代，自然環境被破壞得越來越嚴重，環境也隨之被污染，同時現代社會各方面競爭極為激烈，使得社會壓力越來越大，在這兩重因素促使下，稽留流產的發生率也隨之升高[5]。稽留流產是孕早期引起自然流產的主要原因之一，而患者的年齡、內分泌、感染、遺傳等自身因素同樣會導致稽留流產的發生。稽留流產若不及時治療，嚴重時甚至會威脅孕婦生命，因此，對稽留流產早預防、早診斷并明確其病因就顯得尤為重要[6-7]。有報道顯示，染色體異常是引起胚胎停育的主要原因，所以可通過對流產物進行遺傳學檢測的方法來明確流產原因[8]。CNV-seq是一種新型染色體畸變檢測手段，其已被研究證實在疑似染色體疾病患者的染色體異常檢測、流產原因排查、產前診斷等方面具有較高的應用價值[9]。因此，本文就CNV-seq 檢測絨毛組織染色體畸變對稽留流產的診斷價值進行分析，為相關臨床檢測及病因分析提供參考。

本文研究發現，175 例患者中，成功檢測173例，失敗2 例，檢測成功率為98.86%，檢測出染色體畸變108 例，陽性檢出率為62.43%；在染色體畸變中，陽性數目異常共91 例，其中包括特納綜合征6 例，同源二倍體6 例，三倍體15 例，2- 三體2 例，3- 三體5 例，22- 三體10 例等。其他異常共17 例，其中包括復合異常/ 嵌合類8 例，占7.41%（8/108）；缺失類/ 重復類9 例，占8.33%（9/108）。這說明CNV-seq 的異常檢出率較高，不僅可以檢測一般的染色體數目異常、缺失和重復，而且對染色體微缺失、微重復的檢測具有較高的敏感性，具有染色體核型分析無法比擬的優勢，另外對于一定比例的嵌合體和一些復合類的異常也有較高的檢出率。本次研究中，有2 例樣本檢測失敗，經反饋為標本質量差，原因一方面可能與樣本的取材不當有一定的關系，一方面可能與樣本保存不當或者長途運輸歷時過長造成標本質量下降有關。因此，CNV-seq 檢測除了做好檢測中、檢測后的質量控制，檢測前的質量控制例如準確取樣、正確保存、縮短轉運時間等也是檢測成功不可忽視的重要環節。

目前對于稽留流產的遺傳學檢測手段很多，如G顯帶染色體核型分析、基因芯片法技術、多重探針擴增技術等，但其檢測時間長，操作復雜，對樣本要求高，這極大提高了技術難度及成本，限制其在臨床中的廣泛應用[10]。CNV-seq 是通過高通量測序技術來幫助臨床逐漸明確各種染色體拷貝數變異與疾病關聯的遺傳學檢測技術，與其他檢測手段相比，其具有通量高、操作簡單易上手、檢測周期短、樣本要求低等優點，其明顯更具優勢。CNV-seq 最小可檢測到100kb的CNV，這極大提高了基因組的陽性檢出率及不平衡異常的檢出率，打破了疾病研究過程中的通量限制[11]。同時其超高的精準性還可以使假陽性率顯著降低，不過目前CNV-seq 檢測還存在一些局限，如不能檢出染色體平衡易位、倒位等，但相信隨著對其技術的深入研究及資料的不斷累積，CNV-seq 檢測將會為臨床提供更客觀、更準確的診斷信息。

范寶光等[12]的研究表明，通過高通量基因測序技術檢測稽留流產絨毛組織染色體差別，對53 例患者檢測均成功，其中19 例染色體未見異常，27 例染色體數目異常，7 例染色體結構異常，這說明高通量基因測序技術能發現稽留流產絨毛染色體微小結構異常。趙少翠等[13]的研究表明，對孕早期胚胎稽留流產絨毛應用高通量測序技術進行遺傳學診斷分析，除了可以檢測染色體數目及結構異常，還可以檢測100kb 以上的染色體微缺失、微重復，同時其可有效提高臨床診斷準確性，促使臨床醫生為患者提供更科學的再生育風險評估指導。研究[14-15]表明，高通量測序技術可有效檢測出稽留流產患者絨毛組織的染色體異常。這說明高通量測序技術具有較好的技術優勢，可為臨床診斷及治療提供依據，這與本文結果類似。

綜上所述，CNV-seq 檢測絨毛組織染色體畸變對稽留流產具有較高的診斷價值，在明確稽留流產遺傳學病因、預防疾病、減輕患者負擔、為再孕夫婦提供指導等方面都具有重要意義，值得臨床應用及推廣。