室旁核TLR4阻斷改善2型糖尿病大鼠糖代謝及機制

梁偉 陳艷妹 齊杰 康玉明

(1西安醫學高等專科學校醫學技術學院，陜西 西安 710309；2西安交通大學醫學部基礎醫學院)

糖尿病(DM)是以機體常年糖代謝紊亂為典型癥狀的代謝性疾病〔1，2〕。目前有證據顯示DM 及其并發癥的生理病理性發展與Toll樣受體(TLR)4密切相關：DM時機體存在 TLR4 高表達，激活的 TLR4 及其相關信號通路可通過調控多種炎性細胞因子的釋放參與 DM 病理性進展，也可通過介導氧化應激和細胞異常凋亡引發DM不良轉歸〔3～5〕。特異性阻斷 TLR4 或敲除相關基因，DM 時期的胰島素抵抗得以改善〔6～8〕。然而相關研究多集中于外周，中樞研究較少。下丘腦室旁核(PVN) 是調節機體能量代謝的主要中樞核團之一〔9～12〕。然而PVN TLR4 是否參與DM不良病變，將其阻斷后能否成為治療 DM 的新靶點，目前尚未見到相關研究報道。本研究以2型DM(T2DM) 大鼠為實驗對象，通過PVN靶向給予TLR4特異性抑制劑(TAK-242)，研究PVN TLR4 阻斷對T2DM大鼠糖代謝的影響，并從神經-內分泌角度探討可能的相關機制。

1 材料與方法

1.1動物及分組 健康雄性、體重160～180 g的SD大鼠由西安交通大學實驗動物中心購入。基礎飼料飼喂大鼠1 w后，利用隨機數表法將大鼠分為：正常對照(NC+PVN vehicle)組、正常干預(NC+PVN TAK-242)組、DM(DM+PVN vehicle)組、DM干預(DM+PVN TAK-242)組。

1.2主要試劑儀器 TAK-242購自美國MCE公司；鏈脲佐菌素(STZ)購自美國Sigma公司；葡萄糖和丙酮酸購自上海金賽醫藥化工有限公司；胰島素購自賽諾菲。大鼠腦立體定位儀MP-8003和動物手術顯微鏡 XTL-3400購自深圳瑞沃德生命科技有限公司；穩豪/倍易型血糖儀和血糖試紙購自強生(中國)醫療器材有限公司；冷凍切片機 CM1900購自德國 LEICA；Western印跡電泳槽、轉膜機、成像分析儀等購自美國伯樂公司。

1.3主要實驗方法

1.3.1T2DM大鼠模型制備 高脂高糖飼料〔13〕飼喂SD大鼠4 w。飼喂結束后大鼠禁食 12 h，腹腔注射小劑量 STZ(35 mg/kg) 1次，3 d 后經尾靜脈采血檢測大鼠空腹血糖(FBG)，血糖水平 ≥11.1 mmol/L的大鼠認為建模成功。正常組大鼠則飼喂正常飼料，根據體重給予同等體積比例的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液。

1.3.2PVN插管術及給藥 大鼠稱重后施行腹腔麻醉(鹽酸氯胺酮90 mg/kg 和乙酰丙嗪7.5 mg/kg)，剃毛后將頭部固定在腦立體定位儀上，參照 Paxinos 和 Watson 的大鼠腦立體定位圖譜定位PVN區域(前囟后 1.6～2.1 mm，中線兩側0.3～0.5 mm，垂直7.0～8.0 mm)，將套管植入大鼠PVN中，并利用樹脂膠和螺釘在頭蓋骨上固定，微型滲透微泵(2006型)連接PVN套管后埋入皮下。手術成功率約為68%，術后大鼠分籠飼養，以 0.11 μl/h連續28 d輸注TAK-242或人工腦嵴液(ACSF)。經PVN輸注治療的大鼠用于研究分析。

1.3.3大鼠體重和FBG監測 在大鼠開始給藥后每周固定時間測量各組體重和FBG。利用體重計稱取大鼠體重；大鼠禁食不禁水12 h，尾靜脈取血測量大鼠FBG。測量4 w。

1.3.4大鼠糖代謝水平監測 葡萄糖耐量試驗(GTT)、胰島素耐量試驗(ITT)和丙酮酸耐量試驗(PTT)檢測各組大鼠體內糖代謝水平。大鼠禁食不禁水 12 h，腹腔注射15%葡萄糖(2 g/kg)、胰島素(1 U/kg)、丙酮酸(2 g/kg)，鼠尾靜脈采血記錄各組大鼠0、15、30、60、120 min 的血糖值，計算相對血糖變化比值(相對血糖變化=即時血糖/0 min血糖)，以算出的數值為統計值繪制曲線，以血糖曲線下面積進行統計學意義比較。

1.3.5腎交感神經放電(RSNA)檢測 大鼠稱重后施行腹腔麻醉，剃毛、固定、消毒后，右側腰部縱形切口后清楚暴露腎臟，分離腎交感神經并浸潤石蠟油后，將分離出的腎交感神經懸空掛于銀絲電極，利用BL-420S 監測記錄RSNA。實驗結束時，滴加硝普鈉測量最大RSNA，后切斷腎交感神經，記錄背景噪音。實際RSNA減去背景噪音后占最大RSNA的百分比，用作統計學意義比較。

1.3.6Western印跡檢測 Western印跡檢測PVN中還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶(NOX)4(Santa Cruz)、Cu-Zn 超氧化物歧化酶(SOD,Santa Cruz)、酪氨酸羥化酶(TH，Abcam)、谷氨酸脫羧酶67(GAD67，Abcam)蛋白表達。參照Kang等〔14〕所述提取PVN中總蛋白，將稀釋的總蛋白載入十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)上，電泳分離目的蛋白，采用半干轉的方法將目的蛋白轉置聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，5%牛血清白蛋白封閉后孵育一抗(β-actin 1∶2 000，NADPH 1∶1 000，Cu-Zn SOD 1∶800，TH 1∶1 000，GAD67 1∶800)過夜，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌(6 min×4次)，用稀釋的二抗(1∶2 000)孵育2 h，洗滌后滴加現配的電化學發光(ECL)液并置于Western成像分析儀中發光、觀察并保存結果。采用 NIH ImageJ軟件進行圖像灰度分析，以目的蛋白占β-actin的百分比用作統計學意義比較。

1.3.7二氫乙啶(DHE)、免疫熒光和免疫組化 參照Kang〔14〕所述收集各組大鼠PVN區域的腦部切片，DHE(sigma，1∶300)檢測活性氧簇(ROS)水平，免疫熒光檢測TLR4(abcam，1∶50)和TH(1∶200)陽性神經元表達，免疫組化檢測神經元激活標志物(c-FOS，Santa Cruz，1∶100)、NF-κB通路激活標志物(p-IKKβ，Santa Cruz，1∶100)。在Nikon 熒光顯微鏡下觀察組織各抗體陽性神經元數量表達并拍照記錄。對腦組織切片PVN核團部位5個視野進行熒光強度分析作為DHE數據結果，對腦組織切片PVN核團部位5個視野進行TLR4、TH、c-FOS、p-IKKβ陽性神經元計數作為免疫熒光和免疫組化數據結果。

1.4統計學方法 采用SPSS13.0 統計軟件進行兩兩比較的方差分析，所有定量資料正式統計分析之前，均經正態性檢驗和方差齊性檢驗。

2 結 果

2.1慢性輸注TAK-242對T2DM大鼠PVN中TLR4陽性神經元的影響 如圖1、表1所示：與NC+PVN vehicle和NC+PVN TAK-242組相比，DM+vehicle和DM+TAK-242組PVN中TLR4陽性神經元顯著高表達(P<0.05)。DM+PVN TAK-242相比于DM+PVN vehicle組，PVN中TLR4陽性神經元數目顯著降低(P<0.05)，表明TLR4被有效阻斷。

圖1 免疫熒光檢測各組PVN中TLR4 陽性神經元表達(×200)

2.2PVN阻斷TLR4對T2DM大鼠體重的影響 如表1所示：DM+PVN vehicle組和 DM+PVN TAK-242組給藥后2～4 w體重較NC+PVN vehicle和NC+PVN TAK-242組顯著下降(P<0.05)。DM+PVN TAK-242組較DM+PVN vehicle組給藥后體重下降減緩，并在給藥后4 w時體重有顯著差異(P<0.05)。表明PVN靶向給TAK-242可有效控制T2DM大鼠體重的減少。

2.3PVN阻斷TLR4對T2DM大鼠空腹血糖的影響 如表2所示：DM+PVN vehicle組和 DM+PVN TAK-242組較NC+PVN vehicle組和NC+PVN TAK-242組給藥期間FBG顯著升高(P<0.01)。DM+PVN TAK-242組較DM+PVN vehicle組，慢性輸注TAK-242后3～4 w時，FBG并未繼續升高并且逐漸趨于平穩，但血糖值沒有出現顯著差異，表明PVN給予TAK-242一定程度上可控制T2DM大鼠FBG的上升。

2.4PVN阻斷TLR4對T2DM大鼠糖代謝的影響 與NC+PVN vehicle和NC+PVN TAK-242組比較，DM+PVN vehicle組和 DM+PVN TAK-242組在空腹注射15%葡萄糖60 min和120 min時，相對血糖變化值出現顯著性差異(P<0.05)，在空腹注射胰島素30 min、60 min和120 min時，相對血糖變化值出現顯著性差異(P<0.05)，表明T2DM大鼠體內存在胰島素抵抗。DM+PVN TAK-242組相比DM+PVN vehicle組，在空腹注射15%葡萄糖120 min時相對血糖變化值出現顯著性差異(P<0.05)，表明PVN給予TAK-242可有效增加T2DM大鼠機體內胰島素敏感性，抑制胰島素抵抗，然而在空腹注射胰島素后的各時間點的相對血糖變化值無統計學差異，表明PVN給予TAK-242對T2DM大鼠肌肉等組織攝取葡萄糖的敏感性改善作用不顯著。與NC+vehicle和NC+TAK-242組比較，DM+PVN vehicle和 DM+PVN TAK-242組在空腹注射丙酮酸60 min和120 min時，相對血糖變化值出現顯著性差異(P<0.05)，表明T2DM大鼠體內存在糖異生。與DM+PVN vehicle組比較，DM+PVN TAK-242組在空腹注射丙酮酸后的120 min相對血糖變化值出現顯著性差異(P<0.05)，表明PVN給予TAK-242可顯著降低T2DM大鼠體內的糖異生能力。見圖2。

表1 各組PVN中TLR4陽性神經元表達及給藥后不同時間體重比較

表2 各組給藥不同時間FBG比較

(a)各組不同時刻GTT變化；(b) 各組不同時刻葡萄糖耐量變化；(c)各組不同時刻PTT變化； NC+PVN vehicle組， NC+PVN TAK-242組， DM+PVN vehicle組， DM+PVN TAK-242組圖2 室旁核TLR4阻斷對T2DM大鼠胰島素抵抗的影響

2.5PVN阻斷TLR4對T2DM大鼠腎交感神經活性的影響 與NC+vehicle和NC+TAK-242組比較，DM+PVN vehicle和 DM+PVN TAK-242組RSNA最大百分比顯著增加(P<0.05)，表明T2DM大鼠體內存在交感神經激活；與DM+PVN vehicle 組比較，DM+PVN TAK-242 組RSNA最大百分比顯著降低(P<0.05)，表明PVN阻斷TLR4可降低T2DM大鼠交感神經活性。見表3、圖3。

表3 各組RSNA最大百分比、PVN中NOX4、Cu-Zn SOD蛋白相對表達、ROS活性、TH及 GAD67蛋白表達

圖3 各組RSNA

2.6PVN阻斷TLR4對T2DM大鼠中樞氧化應激的影響 與NC+vehicle和NC+TAK-242組比較，DM+PVN vehicle和 DM+PVN TAK-242組NOX4 蛋白表達水平顯著升高，Cu-Zn SOD 蛋白表達水平顯著降低，ROS活性顯著升高(P<0.05)，表明T2DM

大鼠PVN中存在氧化應激。與DM+vehicle組比較，DM +TAK-242組NOX4 蛋白表達和ROS活性顯著降低(P<0.05)。表明PVN阻斷TLR4可降低T2DM大鼠中樞氧化應激。見表3、圖4、圖5。

圖4 各組PVN中NOX4、Cu-Zn SOD蛋白表達

圖5 各組PVN中ROS活性表達(DHE，×40)

2.7PVN阻斷TLR4對T2DM大鼠中樞神經遞質的影響 與NC+vehicle和NC+TAK-242組比較，DM+PVN vehicle和 DM+PVN TAK-242組TH蛋白表達水平顯著升高，GAD67蛋白表達水平顯著降低，TH陽性神經元數量顯著增多(P<0.05)。表明T2DM大鼠PVN中樞存在興奮性神經遞質和抑制性神經遞質的失平衡。與DM+vehicle組比較，DM+TAK-242組TH蛋白表達水平降低，GAD67蛋白表達水平升高，但差異無統計學意義(P>0.05)；TH陽性神經元數量顯著減少(P<0.05)，表明PVN阻斷TLR4可改善T2DM大鼠中樞神經遞質的失平衡，進而降低外周交感神經活性。見表3、圖6、圖7。

圖6 各組PVN中TH、GAD67蛋白表達

2.8PVN阻斷TLR4對T2DM大鼠中樞神經元凋亡的影響 DM+PVN vehicle組和 DM+PVN TAK-242組相比于NC+vehicle和NC+TAK-242組PVN 中 P-IKKβ、c-FOS陽性神經元數目明顯增多(P<0.05)，提示T2DM時 PVN 神經元中 TLR4/NF-κB信號通路被顯著激活，神經元出現大范圍凋亡；DM+PVN TAK-242組P-IKKβ、c-FOS陽性神經元數目顯著低于DM+PVN vehicle組(P<0.05)。見圖8、表4。

圖7 免疫熒光檢測各組PVN中TH陽性神經元表達(×400)

圖8 免疫組化檢測各組PVN中P-IKKβ、c-FOS陽性神經元表達

表4 各組PVN中P-IKKβ、c-FOS陽性神經元 表達

3 討 論

本研究結果表明PVN TLR4阻斷改善T2DM大鼠糖代謝。PVN是交感神經系統重要的整合中樞，直接或者間接參與交感神經的調控〔14～16〕，提示PVN可能通過調控交感神經活性影響DM進程。本研究結果發現，T2DM 大鼠腎交感神經存在過度激活，證明了外周交感神經激活是 T2DM 發病的重要機制之一，這與以往學者的觀點是相一致的〔17,18〕；特異性阻斷T2DM大鼠PVN TLR4后，可顯著降低外周交感神經活性，改善T2DM大鼠糖代謝。

交感神經活性受中樞各種神經內分泌因素調控。氧化應激是ROS蓄積損傷組織的病理狀態。機體ROS的產生主要依賴機體細胞利用葡萄糖時進行的氧化磷酸化反應，NADPH參與其中主要擔當遞氫體的角色；ROS的清除則主要依賴于SOD、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-px)等抗氧化酶系。本研究結果說明PVN TLR4阻斷能降低中樞氧化應激，進而降低交感神經活性。

中樞神經遞質的異常紊亂可以造成機體交感神經活性發生異常。去甲腎上腺素是一種重要的興奮性神經遞質，體內調控去甲腎上腺素合成的關鍵限速酶之一是TH，腦內TH含量可以反映去甲腎上腺素能神經纖維終末中樞分布情況。γ-氨基丁酸是一種重要的抑制性神經遞質，始終貫穿于神經系統發育過程中并控制γ-氨基丁酸合成的關鍵限速酶之一是GAD67。本研究結果表明，T2DM大鼠PVN內興奮性神經遞質和抑制性神經遞質發生紊亂；PVN TLR4阻斷對中樞神經遞質有影響，但不明顯。

中樞神經元非正常、大范圍的凋亡是DM引發的神經退行性疾病的重要發病機制〔19,20〕。TLR4/NF-κB信號通路激活可誘導細胞凋亡〔20〕，P-IKKβ是NF-κB活化經典途徑的關鍵亞基；神經元c-Fos表達一定程度上可預測細胞凋亡即將發生。本研究發現T2DM大鼠相比于正常大鼠TLR4/NF-κB信號通路過度激活、PVN神經元凋亡異常。特異性阻斷T2DM大鼠室旁核TLR4后發現，T2DM大鼠中樞TLR4/NF-κB信號通路不能建立，PVN神經元異常凋亡現象被逆轉。

綜上，下丘腦PVN TLR4阻斷可一定程度改善T2DM大鼠糖代謝，其可能通過抑制中樞氧化應激和神經元凋亡，平衡興奮性神經遞質和抑制性神經遞質，降低外周交感神經活性機制展開。本研究為中樞使用TLR4特異性抑制劑治療T2DM提供了相應實驗證據。