VEGF及VEGF受體-2基因多態性與阿爾茨海默病患者腦微出血的相關性研究*

張金彪 孫海榮 李夢凡 沈騰群 王 彤 趙俊武 李 芳 李振光

1 威海市立醫院神經內科，山東省威海市 264200； 2 錦州醫科大學附屬第一醫院神經內科

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是最常見的癡呆形式，其特征是大腦的退行性變，但越來越多的證據表明血管疾病也可能起作用[1]。腦微出血(Cerebral microbleeds, CMBs)反映了腦小血管滲漏引起的局灶性含鐵血黃素沉積，在AD患者中比一般老年人群更常見[2]。CMBs的發病機制包括血管危險因素引起的內皮功能障礙、血腦屏障(Blood-brain barrier, BBB)損傷以及β-淀粉樣蛋白沉積[3]。因此，CMBs可能有助于解釋AD的神經退行性病理機制和腦血管機制的重疊。

血管內皮生長因子(Vascular endothelial growth factor, VEGF)是一種血管生成糖蛋白，在血管生成的生理和病理過程中發揮重要作用。我們既往研究發現，血清VEGF水平與AD患者中CMBs的出現相關[4]。眾所周知，VEGF基因缺乏會影響VEGF蛋白水平，并破壞血管的發育和維持[5]。VEGF與其受體酪氨酸激酶、VEGF受體-1和VEGF受體-2(VEGFR2)結合，其中VEGFR2是介導血管生成的關鍵受體[6]，對內皮細胞的生存和完整性的維持起著重要作用[7]。我們的研究評估了VEGF和VEGFR2基因變異對VEGF蛋白循環水平的影響，以及對AD患者CMBs的影響。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取2016年12月—2020年12月在威海市立醫院神經內科就診的406例散發性AD(Sporadic AD, SAD)患者設為病例組，其中AD患者又分為伴CMBs的AD患者121例和不伴CMBs的AD患者285例。根據美國國家神經病、語言交流障礙和卒中研究所以及阿爾茨海默病及相關疾病協會(NINCDS-ADRDA)的標準對可能的AD進行診斷。CMBs定義磁敏感加權成像(SWI)序列上的圓形、低強度均勻病灶，病灶大小達10mm[8]。從威海市立醫院門診部招募年齡和性別匹配的332例非AD患者為對照組，進行標準健康檢查，并通過長谷川癡呆量表(HDS)和簡易精神狀態檢查(MMSE)確認健康和認知正常。對所有受試者進行了醫學訪談、體格檢查、神經心理評估、血液標本留取和腦核磁共振成像。患者排除標準：(1)有神經退行性疾病或其他癡呆癥的家族史；(2)癌癥；(3)先前有卒中或頭部外傷史；(4)嚴重的心臟、腎臟或肝臟疾?。?5)近期感染或炎癥病史。研究對象均為中國北方漢族人群。本研究獲得威海市醫院倫理委員會批準。書面同意由受試者或受試者的監護人簽署。

1.2 方法

1.2.1 臨床資料收集：記錄完整的臨床和家族史以及常規血管危險因素：飲酒、吸煙、收縮壓和舒張壓以及體重指數。高血壓定義為不同時間的3次血壓≥140/90mmHg(1mmHg=0.133kPa)或應用降壓藥。糖尿病的診斷是基于降糖治療或反復抽血化驗提示空腹血糖水平≥7 mmol/L(126mg/dl)或口服葡萄糖2h后餐后血糖值≥11.1mmol/L(200mg/dl)?？偰懝檀肌?00mg/dl或低密度脂蛋白膽固醇≥130mg/dl為高脂血癥。記錄吸煙史、飲酒史。

1.2.2 生化指標測定：患者在夜間禁食后，于早上6～8點采集血液樣本。樣品離心(400g,10min)，分離血清和細胞層，然后保存在-70℃等待分析。生化指標(甘油三酯、總膽固醇、高密度脂蛋白膽固醇和空腹血糖)使用自動分析儀(日立7600，東京，日本)測定。采用標準的酶聯免疫吸附法(ELISA)測定血清VEGF和VEGFR2水平。VEGF和VEGFR2免疫檢測試劑盒使用R&D系統(Minneapolis,MN,USA)。

1.3 磁共振成像(MRI)評估 MRI檢查采用Magnetom Trio全身3.0-T MR掃描儀(Siemens, Erlangen, Germany)，梯度為40mt/m。采用集成并行采集技術，所有采集均采用僅接收8通道相控陣頭部線圈。收集T1和T2加權成像、彌散加權成像(DWI)、流體衰減反轉恢復序列成像(FLAIR)和磁敏感加權成像(SWI)。經DWI確診為急性缺血性梗死。CMBs定義：SWI序列上的圓形、低強度均勻病灶，病灶大小達10mm[8]。如果出現血管流空現象(基于溝的位置或線形)、基底神經節鈣化或來自鄰近骨或竇的偽影，則排除低信號病變。2名經驗豐富的神經影像科醫生分別確定SWI成像中CMBs的數量，并一致確定。

1.4 基因變異選擇和基因分型 根據HapMap基因型數據和潛在的生物學功能，選擇啟動子區中4個影響VEGF表達的標記變異，包括rs157036(-116G>A)、rs833061 (-460T>C)、rs2010963 (405G>C)、rs3025039(+936C>T)。我們選擇了VEGFR2的外顯子變異體rs2305948，該變異體可導致Val297Ile(對配體受體結合很重要)的非同義氨基酸轉化。選擇啟動子區域rs2071559(-604T>C)和rs1870377(-1719T>A)(可能影響VEGFR2表達)。所有單核苷酸多態性(Single nucleotide polymorphism,SNP)序列均來自HapMap數據庫(www.hapmap.org)。使用DNA分離試劑盒(Thermo Fisher Scientific,USA)按照制造商的流程從外周血樣本中分離基因組DNA。在Sequenom MassARRAY平臺(Sequenom,San Diego,CA,USA)上使用384孔板進行VEGF和VEGFR2多態性的基因分型。使用Sequenom Assay Design 3.1軟件(Sequenom)設計用于聚合酶鏈反應(PCR)擴增和單堿基延伸試驗的引物。引物購自生工生物技術(上海)有限公司?；蚍中陀蓪嶒炇胰藛T進行，實驗人員對受試者狀況一無所知。為進行質量控制，隨機抽取10%的受試者進行重復樣本基因分型，結果符合率為100%。兩位作者獨立審查了所有基因分型結果。

所有研究對象均使用之前描述的標準Sanger測序方法進行APOE基因分型[9]。

2 結果

2.1 臨床特征 對照組和AD患者的人口學統計學資料和臨床特征見表1，AD患者根據是否合并CMBs進行分組。與對照組相比，AD組患者受教育時間更短，糖尿病患病率更高，更有可能攜帶至少一個APOEε4等位基因。伴CMBs的AD患者與不伴CMBs的AD患者相比，年齡、高血壓患病率以及攜帶至少一個APOEε4等位基因存在顯著差異。然而，AD伴CMBs組與AD不伴CMBs組在性別、受教育時間、糖尿病、高血脂、吸煙、飲酒或BMI方面均無顯著差異。

2.2 對照組和AD組VEGF和VEGFR2 SNPs基因型和等位基因頻率的關系 VEGF和VEGFR2 SNPs在對照組和AD組中的基因型和等位基因頻率見表2。在所有受試者中，VEGF和VEGFR2基因中所有變異的頻率分布均未明顯偏離Hardy-Weinberg平衡。校正年齡、性別、高血壓、糖尿病、高脂血癥、吸煙、飲酒、BMI或攜帶至少一個APOEε4等位基因后，所有檢測的VEGF變異均與AD無關。在VEGFR2基因中，變異型-1719T>A與AD易感性增加相關(TA:OR 1.798，95%CI 1.287～2.514，P= 0.001;AA:OR 2.207，95% CI 1.332～3.657，P=0.002;TT/TA+AA顯性:OR 1.798，95%CI 1.307～2.475，P<0.001)。在校正年齡、性別、腦血管危險因素和至少攜帶一個APOEε4等位基因后，rs2305948多態性的llelle和Vallle+llelle(攜帶lle-等位基因)基因型頻率與AD相關(llelle:OR 5.720，95%CI 1.885～17.360，P=0.002;ValIle+IleIle隱性:OR 0.242，95%CI 0.088～0.666，P=0.006)。

表2 對照組和AD組VEGF和VEGF受體- 2 SNPs基因型和等位基因頻率

2.3 伴或不伴有CMBs的AD患者中VEGF和VEGFR2基因變異的關系 AD伴或不伴CMBs患者中VEGF和VEGFR2 SNPs的基因型和等位基因頻率見表3。在校正了年齡、性別、高血壓、糖尿病、高脂血癥、吸煙、飲酒、BMI和攜帶至少一個APOEε4等位基因后，所有檢測到的VEGF變異與AD患者CMBs無關。在校正了年齡、性別、腦血管危險因素和攜帶至少一個APOEε4等位基因后，與野生基因型相比，VEGFR2基因中的297Ile基因型與AD患者對CMBs的易感性增加相關(Vallle: OR 2.252，95%CI 1.355～3.743，P=0.002，llelle:OR 4.016，95%CI 1.598～10.093，P=0.003，Vallle+llelle 顯性:OR 2.486，95% CI 1.538～4.021，P<0.001；Vallle+llelle 隱性:OR 0.341，95% CI 0.139～0.837，P=0.019)。

表3 伴或不伴CMBs的AD患者VEGF及VEGF受體-2 SNPs基因型及等位基因頻率

2.4 血清VEGF及VEGFR2水平比較 為了探討VEGF多態性與循環VEGF水平的關系，根據VEGF多態性對AD患者血清VEGF水平進行分類。攜帶+936CT+TT基因型的AD患者平均VEGF水平低于VEGF+936CC基因型AD患者[(217.5±17.7)pg/ml VS(223.4±20.5)pg/ml,P=0.022]，見圖1。包括VEGF rs157036(-116G>A)、rs833061(-460T>C)和rs2010963(405G>C)在內的VEGF不同基因型間的VEGF水平在AD患者中差異無統計學意義(P>0.05)。檢測AD患者血清VEGFR2水平，結果顯示包括VEGFR2 rs2071559(-604T>C)、rs1870377(-1719T>A)和rs2305948(Val297Ile)在內的不同基因型VEGFR2無統計學差異(P>0.05)。

圖1 攜帶rs3025039(+936C > T)基因型的AD患者血清VEGF水平的比較箱式圖中間的橫線代表中位數

3 討論

在中國北方漢族人群中，我們發現VEGFR2基因rs2305948 (Val297Ile)不僅與散發性AD的易感性相關，而且在校正年齡、性別、腦血管危險因素以及攜帶至少一個APOEε4等位基因后，與野生基因型相比，AD患者對CMBs的易感性增加。

血管系統功能障礙直接導致阿爾茨海默病的發生和發展。VEGF參與血管生成、內皮細胞增殖和遷移，增加血管通透性，高水平的VEGF已被證明可通過誘導血腦屏障功能障礙而損害中樞神經系統內穩態[10]。有研究報道，VEGF基因啟動子的遺傳變異與VEGF啟動子激活和反應性顯著不同相關，這可能影響VEGF表達水平[11]。VEGF啟動子多態性可能與AD風險相關的VEGF表達水平不同相關。VEGF rs699947 (-2578A/A)基因型與意大利人群中散發的阿爾茨海默病風險增加相關，同時不受載脂蛋白E基因型的影響[12]。在ApoEε4缺失的情況下，VEGF啟動子的-1154G等位基因和-2549D/-1154G單體型可能增加中國北方漢族人群散發型阿爾茨海默病的風險[13]。然而，在我們的研究中，只有+936C>T多態性與AD患者血清VEGF水平有弱相關。在校正了年齡、性別、高血壓、糖尿病、高脂血癥、吸煙、飲酒、BMI和攜帶至少一個APOEε4等位基因后，-116G>A、-460T>C、405G>C、+936C>T多態性與散發型AD無關。

腦血管網絡對于維持正常的大腦功能至關重要，由于衰老和某些神經退行性疾病(如AD)導致的認知功能下降與大腦微血管的缺失有關。VEGFR2是VEGF的主要信號換能器。VEGF的結合導致受體二聚化以及受體激酶區自磷酸化高度激活[14]。VEGFR2介導內皮細胞的增殖、遷移、通透性和存活，VEGFR2信號在調節微血管阻塞和促進年齡相關的微血管數量減少方面起著關鍵作用[15]。Ahmed-Jushuf等人[16]研究表明，在老年人的深部灰質中，小動脈中的肌細胞VEGFR2呈強陽性，其表達程度與年齡有關，可能是年齡相關腦血管改變的一個因素。我們的研究發現，在VEGFR2基因中，變異體rs1870377(-1719T>A)與AD易感性增加相關。rs2305948 (Val297Ile) 變異不僅與散發性AD易感性相關，而且與AD患者CMBs易感性增加有關。Val297Ile是VEGFR2基因編碼區突變所致，位于受體蛋白的關鍵區域。rs2305948(Val297Ile)多態性等位基因與VEGFR2的結合親和力降低相關[17-18]。因此，297lle等位基因可能下調VEGF/VEGFR2信號通路的功能，導致血管壁發育異常，影響內皮細胞的完整性和修復，增加CMBs的風險。

本研究有幾個局限性：首先，數據質量可能受到樣本量小、單一醫院病例對照設計和缺乏重復研究的限制；其次，研究對象僅包括中國北方漢族人群，無法將研究結果推廣到其他民族群體；其他可能的局限性包括低估了個體風險因素的實際影響，如暴露于不同的環境因素、潛在的種族差異和額外的遺傳因素。

綜上所述，rs2305948(Val297Ile)多態性不僅增加了散發性AD的易感性風險，而且增加了AD患者患CMBs的風險。今后的研究希望著手于對其他種族人群和VEGFR2的生物學功能進行進一步的遺傳學研究，以提高我們對VEGFR2多態性在確定AD或CMBs發生風險方面作用的理解。