高通量測(cè)序技術(shù)在唐氏篩查臨界風(fēng)險(xiǎn)非高齡孕婦中的應(yīng)用研究*

郭 剛 王麗芳 王康英

莆田學(xué)院附屬醫(yī)院，福建省莆田市 351100

我國(guó)是出生缺陷高發(fā)國(guó)家，數(shù)據(jù)顯示染色體異常作為重要的遺傳缺陷，可能會(huì)影響1/200～1/150的新生兒[1]。目前尚無(wú)治療染色體疾病的有效方法，因此作為二級(jí)預(yù)防的產(chǎn)前篩查和產(chǎn)前診斷顯得尤為關(guān)鍵。胎兒染色體非整倍體異常在出生缺陷兒中的發(fā)病率較高，準(zhǔn)確篩查及診斷是臨床迫其需求的，目前臨床應(yīng)用最為廣泛的是血清學(xué)篩查，但篩查準(zhǔn)確性不可靠，漏診率高[2]，而介入性產(chǎn)前診斷，容易引起孕婦焦慮和恐懼，并有導(dǎo)致流產(chǎn)和宮內(nèi)感染的風(fēng)險(xiǎn)[3]。無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測(cè)(NIPT)技術(shù)僅需采取孕婦靜脈血，利用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)母體外周血漿中的游離胎兒DNA片段進(jìn)行測(cè)序，進(jìn)行生物信息分析，從中得到胎兒染色體非整倍體信息[4-5]。NIPT已經(jīng)成為一種新的篩查技術(shù)。本研究對(duì)2 464例血清學(xué)篩查臨界風(fēng)險(xiǎn)自愿進(jìn)行NIPT的孕婦進(jìn)行研究，結(jié)合介入性產(chǎn)前診斷的結(jié)果，分析NIPT對(duì)唐氏篩查臨界風(fēng)險(xiǎn)者的應(yīng)用價(jià)值。

1 資料和方法

1.1 背景資料 選取2017—2019年間在我院血清學(xué)篩查臨界風(fēng)險(xiǎn)且進(jìn)入無(wú)創(chuàng)DNA產(chǎn)前檢測(cè)的2 464例孕婦為研究對(duì)象。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)自愿NIPT；(2)1年內(nèi)沒(méi)有異體輸血、細(xì)胞治療等；(3)夫妻雙方無(wú)明確染色體異常；(4)超聲單胎；(5)預(yù)產(chǎn)年齡<35周歲；(6)體重指數(shù)<40等。對(duì)選擇NIPT的孕婦應(yīng)充分告訴該方法的適應(yīng)證、局限性等，并簽署知情同意書(shū)，對(duì)結(jié)果高風(fēng)險(xiǎn)者建議做介入性產(chǎn)前診斷，對(duì)納入對(duì)象隨訪(fǎng)其妊娠結(jié)局及產(chǎn)后胎兒情況。

1.2 方法

1.2.1 中孕唐氏篩查：空腹?fàn)顟B(tài)下抽取孕婦靜脈血2～3ml于空白管，離心盡快分離血清并及時(shí)檢測(cè)，未及時(shí)檢測(cè)的標(biāo)本需低溫保存。中孕期唐氏篩查采用血清學(xué)三聯(lián)篩查即AFP+ Free-βhCG+uE3。儀器為芬蘭PerkinElmer公司提供的DELFLA 1 235型號(hào)，試劑為其配套試劑盒。根據(jù)檢測(cè)值再結(jié)合孕婦孕產(chǎn)年齡、孕周、體重等利用分析軟件給出該孕婦懷染色體非整倍體胎兒的風(fēng)險(xiǎn)率。唐氏篩查臨界風(fēng)險(xiǎn)截?cái)鄻?biāo)準(zhǔn)：21-三體為1/1 000～1/271；18-三體為1/1 000～1/351。

1.2.2 無(wú)創(chuàng)基因產(chǎn)前檢測(cè)(NIPT)：抽取孕婦外周血10ml于康健游離核酸保存采血管(CFDNA)后，立刻顛倒混勻，常溫8～30℃保存，并于當(dāng)日送往福州博奧生物集團(tuán)有限公司。測(cè)序儀器為基因測(cè)序儀BES4000，分析軟件為無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前數(shù)據(jù)分析管理系統(tǒng)V3.0。通過(guò)高通量基因測(cè)序檢測(cè)孕婦外周血胎兒游離DNA并進(jìn)行生物信息分析。NIPT正常范圍為-3.0

1.2.3 染色體核型分析：對(duì)NIPT異常結(jié)果經(jīng)臨床醫(yī)生咨詢(xún)后自愿選擇介入性產(chǎn)前診斷的孕婦，在超聲的引導(dǎo)下經(jīng)腹行羊膜腔穿刺，抽取25ml，送實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)、收獲、固定、G顯帶等，計(jì)數(shù)2個(gè)獨(dú)立培養(yǎng)瓶的40個(gè)細(xì)胞，分析20個(gè)細(xì)胞，分辨率達(dá)320～400條帶水平。以人類(lèi)細(xì)胞遺傳學(xué)命名的國(guó)際體制(ISCN)2016作為核型分析的標(biāo)準(zhǔn)。

1.3 后續(xù)追蹤和隨訪(fǎng) 對(duì)NIPT低風(fēng)險(xiǎn)的孕婦后續(xù)追蹤其彩超情況并隨訪(fǎng)其妊娠結(jié)局及新生兒情況，NIPT高風(fēng)險(xiǎn)孕婦建議進(jìn)入產(chǎn)前診斷，關(guān)注其診斷結(jié)果并隨訪(fǎng)妊娠結(jié)局，對(duì)拒絕介入性產(chǎn)前診斷的應(yīng)隨訪(fǎng)其妊娠結(jié)局及產(chǎn)后新生兒表現(xiàn)。

2 結(jié)果

本文通過(guò)研究2 464例唐氏篩查臨界風(fēng)險(xiǎn)自愿行NIPT的孕中期孕婦，結(jié)果為NIPT提示高風(fēng)險(xiǎn)24例，篩查陽(yáng)性率為0.97%(24/2 464)。其中6例21-三體(T21)高風(fēng)險(xiǎn)，5例18-三體(T18)高風(fēng)險(xiǎn)，1例T18和T13共同高風(fēng)險(xiǎn)，7例性染色體異常，其他異常5例。對(duì)結(jié)果異常者的孕婦，電話(huà)通知至本院遺傳咨詢(xún)門(mén)診，經(jīng)咨詢(xún)并同意選擇介入性產(chǎn)前診斷的孕婦19例，核型分析結(jié)果11例異常(其中確診4例21-三體，5例性染色體，其他核型異常2例)，核型正常8例。經(jīng)分析NIPT的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為57.89%(11/19)，具體見(jiàn)表1。

表1 24例NIPT高風(fēng)險(xiǎn)及核型分析結(jié)果

NIPT高風(fēng)險(xiǎn)拒絕介入性產(chǎn)前診斷的5例孕婦進(jìn)行隨訪(fǎng)，其中3例18-三體高風(fēng)險(xiǎn)者因彩超提示多發(fā)畸形而選擇直接引產(chǎn)，其他2例隨訪(fǎng)孕婦自述胎兒無(wú)明顯形態(tài)異常。2 440例NIPT低風(fēng)險(xiǎn)隨訪(fǎng)至分娩后，其中59例隨訪(fǎng)不到，隨訪(fǎng)率97.58%，隨訪(fǎng)中發(fā)現(xiàn)3例流產(chǎn)，4例胎死宮內(nèi)，7例不同程度彩超異常而引產(chǎn)，其余均未發(fā)現(xiàn)有明顯染色體異常新生兒。

3 討論

1997年，香港中文大學(xué)羅玉明教授首次證明孕婦外周血中有胎兒游離DNA，來(lái)源于胎盤(pán)，開(kāi)辟了無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測(cè)(NIPT)的新方法。迄今為止，它已在世界許多國(guó)家得到廣泛應(yīng)用[6]。無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測(cè)采用新一代高通量測(cè)序技術(shù)，基于母體血漿檢測(cè)游離胎兒DNA。經(jīng)過(guò)生物信息學(xué)分析，檢測(cè)出胎兒染色體異常，國(guó)內(nèi)外研究表明NIPT具有無(wú)創(chuàng)、安全、快速、準(zhǔn)確性和可靠性高等特點(diǎn)[7-8]。NIPT篩查具有一定的臨床實(shí)用價(jià)值[9]。

目前臨床常用的產(chǎn)前診斷模式是血清學(xué)篩查高風(fēng)險(xiǎn)建議進(jìn)入介入性產(chǎn)前診斷，這種模式還是會(huì)導(dǎo)致30%～40%的缺陷兒漏診[10]，為此有學(xué)者提出臨界風(fēng)險(xiǎn)的定義，研究報(bào)道有一定比例的漏篩出現(xiàn)在血清學(xué)篩查臨界風(fēng)險(xiǎn)的孕婦中[11]，因此對(duì)這部分人群的篩查很有必要的。且羊膜穿刺術(shù)有嚴(yán)格的適應(yīng)證和禁忌證[12-13]這種方法可能會(huì)帶來(lái)胎兒宮內(nèi)感染和羊水漏出的風(fēng)險(xiǎn)，同時(shí)增加孕婦的心理壓力，因此在孕婦中接受率不高。在一定程度上限制了臨床應(yīng)用。因此，尋求一種合理實(shí)用的產(chǎn)前篩查診斷方法，實(shí)現(xiàn)胎兒染色體疾病的準(zhǔn)確檢測(cè)，對(duì)于降低出生缺陷的發(fā)生率具有重要意義。

本文選取2017年1月—2019年12月在本院血清學(xué)篩查結(jié)果臨界風(fēng)險(xiǎn)經(jīng)咨詢(xún)自愿選擇NIPT的單胎非高齡孕婦為研究對(duì)象，篩查出24例NIPT高風(fēng)險(xiǎn)孕婦，21-三體6例，18-三體5例，性染色體異常7例，T18和T13共同高風(fēng)險(xiǎn)1例，其他異常5例。咨詢(xún)建議行介入性產(chǎn)前診斷的19例，經(jīng)核型及芯片結(jié)果確診符合的有11例，21-三體4例，18-三體0例，性染色體異常5例，其他異常2例。本文研究了2 464例孕婦，其中NIPT低風(fēng)險(xiǎn)的孕婦中59例沒(méi)有隨訪(fǎng)到。所以統(tǒng)計(jì)人數(shù)按2 405計(jì)。敏感性=真陽(yáng)性病例數(shù)/(真陽(yáng)性病例數(shù)+假陰性病例數(shù))，特異性=真陰性病例數(shù)/(真陰性病例數(shù)+假陽(yáng)性病例數(shù))，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值=真陽(yáng)性病例數(shù)/(真陽(yáng)性病例數(shù)+假陽(yáng)性病例數(shù))，本研究中未出現(xiàn)假陰性病例。所以該方法對(duì)21-三體的敏感性為100%，特異性均為99.9%(2 403/2 405)，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為66.67%(4/6)，性染色體的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為71.43%(5/7)，而18-三體陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為0，可能因?yàn)閿?shù)據(jù)不足和18-三體綜合征的胎兒往往表現(xiàn)多種臟器畸形，孕婦直接選擇引產(chǎn)。血清學(xué)臨界風(fēng)險(xiǎn)者相對(duì)高風(fēng)險(xiǎn)者基數(shù)較大，對(duì)其均行介入性產(chǎn)前診斷是不可取的，隨著技術(shù)的發(fā)展，2015年專(zhuān)家提出了NIPT可以應(yīng)用于中風(fēng)險(xiǎn)人群的共識(shí)[14]。有研究表明，臨界風(fēng)險(xiǎn)的孕婦中生育唐氏兒的風(fēng)險(xiǎn)為0.46%[13]，本文確診4例21-三體，故唐氏兒的風(fēng)險(xiǎn)率為0.17%(4/2 405)的唐氏缺陷兒。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)NIPT應(yīng)用于血清學(xué)篩查臨界風(fēng)險(xiǎn)的單胎非高齡的報(bào)道較少，本研究表明對(duì)于唐氏篩查臨界風(fēng)險(xiǎn)的單胎非高齡孕婦進(jìn)行NIPT篩查是具有意義的，篩查陽(yáng)性率為0.97%(24/2 464)。特殊病例討論：本研究出現(xiàn)1例NIPT提示T21/Chr4+/Chr8+異常的孕婦最終核型發(fā)現(xiàn)是正常的，后續(xù)隨訪(fǎng)發(fā)現(xiàn)孕婦本身患有白血病，因?yàn)閻盒阅[瘤干擾胎兒游離DNA的檢測(cè)，影響檢測(cè)結(jié)果[15]。

綜上所述，妊娠女性外周血胎兒游離DNA的高通量測(cè)序技術(shù)可用于臨界風(fēng)險(xiǎn)妊娠女性胎兒染色體疾病的產(chǎn)前篩查，具有較高的敏感性和特異性。可以作為產(chǎn)前診斷的重要補(bǔ)充，可以降低血清學(xué)臨界風(fēng)險(xiǎn)孕婦的穿刺率，降低出生缺陷的發(fā)生。但 NIPT 存在一定程度的假陽(yáng)性，并且NIPT作為一種篩查技術(shù)，篩查異常者仍需結(jié)合傳統(tǒng)的羊水細(xì)胞核型分析，以提高對(duì)胎兒染色體疾病的診斷效能。