PSMD14在胰腺癌中的表達分析及對胰腺癌細胞增殖的影響*

王 悅，徐恩君，楊玉萍，王中新

安徽醫科大學第一附屬醫院檢驗科，安徽合肥 230000

胰腺癌是一種具有高度侵襲性的腫瘤，嚴重威脅人類生命健康[1]。胰腺癌發病隱匿，早期診斷困難，僅15%～25%的患者確診時有機會接受手術治療[2]。絕大多數胰腺癌患者確診時已處于中晚期，5年生存率低至9%，預后極差[3]。缺乏早期檢測手段、腫瘤轉移及化療抵抗等多方面因素是患者預后不良的原因[1]。研究表明，胰腺癌中存在廣泛的基因和表觀遺傳學改變，導致腫瘤驅動基因異常激活[4-5]。因此，挖掘潛在的腫瘤驅動基因并探索其與胰腺癌的關系將有助于人們認識胰腺癌的進展機制，改善患者預后。泛素化是常見的轉錄后修飾方式，即泛素分子與底物蛋白賴氨酸殘基連接的過程。泛素化的蛋白通常被蛋白酶體識別并降解，而去泛素化則是將泛素分子從底物蛋白移除，從而維持蛋白的穩定性[6]。由于作用底物的多樣性，去泛素化酶在多種生物學進程中發揮重要調控作用，與腫瘤的發生密切相關[7-8]。蛋白酶體26S亞基非ATP酶14(PSMD14)是去泛素化酶中JAB1/MPN/Mov34金屬酶(JAMM)結構域蛋白酶家族的一員，在卵巢癌、肝癌和頭頸癌等多種腫瘤中表達上調[9-11]。其表達上調與病理高分期、血管侵襲和腫瘤增殖等多種預后不良因素有關[10-12]，而下調PSMD14表達則能誘導細胞凋亡、抑制細胞增殖和上皮間質轉化過程[9,13]。在結直腸癌中，PSMD14通過促進致癌基因ALK2的去泛素化而維持其蛋白穩定性，從而促進結直腸癌細胞增殖和化療抵抗[14]。在頭頸癌中，PSMD14則介導了SNAIL的去泛素化和蛋白的穩定性，從而促進腫瘤的侵襲轉移[15]。由此可見PSMD14通過作用于多種不同的底物在多種腫瘤中扮演了“促癌”的角色，而其在胰腺癌中的作用及機制尚不清楚。本研究旨在分析PSMD14在胰腺癌中的表達情況及與患者預后的關系，并初步探討其作用于胰腺癌細胞的分子機制。

1 資料與方法

1.1一般資料 6對胰腺癌組織和癌旁正常組織(距離腫瘤邊緣2 cm以上)來源于2020年4月至2020年12月于本院進行手術切除治療并經病理檢查確診為胰腺癌的患者。本研究經安徽醫科大學第一附屬醫院醫學倫理委員會批準。標本來源的患者均對本研究知情同意并簽署知情同意書。

1.2細胞與試劑 胰腺癌PANC-1和BxPC-3細胞購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心。DMEM培養基、胰酶及胎牛血清、Opti-MEM培養基為Gibco公司產品，鏈霉素-青霉素雙抗為Hyclone公司產品。Lip3000轉染試劑購自Invitrogen公司，PSMD14小干擾RNA(siRNA)和陰性對照siRNA購自Thermo Fisher Scientific公司。葡萄糖攝取試驗試劑盒、乳酸生成試驗試劑盒為Abcam公司產品。CCK-8試劑盒、組織總蛋白提取試劑盒、RIPA裂解液、BCA蛋白定量試劑盒、5×蛋白上樣緩沖液購自碧云生物技術公司。PSMD14、肝臟磷酸果糖激酶(PFKL)抗體購自Abcam公司，己糖激酶2(HK2)抗體、丙酮酸激酶2(PKM2)抗體、β-actin抗體購自Proteintech公司。PVDF膜、增強化學發光液購自Millipore公司。Trizol試劑購自Life technologies公司。PrimeScript反轉錄試劑盒、SYBR Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒購自Takara公司。

1.3方法

1.3.1PSMD14 mRNA表達分析 通過基因表達譜交互分析工具(GEPIA2，http://gepia2.cancer-pku.cn/#index)分析TCGA數據庫中PSMD14 mRNA在胰腺癌患者癌組織和正常組織中的表達差異，同時分析PSMD14 mRNA表達水平與患者總生存率和無病生存率的關系。對PSMD14表達可能參與調控的生物學過程進行基因富集分析，即GO功能注釋和KEGG通路富集分析。

1.3.2Western blot(WB)檢測蛋白表達水平 將組織進行充分研磨后，使用RIPA試劑在4 ℃條件下充分裂解細胞，按照組織蛋白提取試劑盒說明書中的步驟提取總蛋白。用BCA法測定蛋白濃度，取適量蛋白加入5×上樣緩沖液后于100 ℃水浴10 min使蛋白變性。將處理好的蛋白在10%SDS聚丙烯酰胺凝膠上電泳，然后電轉至PVDF膜，用含5%牛奶的緩沖液將膜封閉2 h,將PVDF膜與一抗(PSMD14 1∶1 000稀釋,HK2 1∶1 000稀釋,PFKL 1∶1 000稀釋，PKM2 1∶1 000稀釋,β-actin 1∶2 000稀釋)4 ℃孵育過夜。洗膜(10 min×3次)后，將膜與二抗(1∶3 000)室溫孵育1 h，再洗膜(10 min×3次)，最后用化學發光液顯影并用凝膠成像儀拍照。

1.3.3細胞培養和細胞轉染 人胰腺癌細胞PANC-1和BxPC-3用含1%雙抗、10%胎牛血清的DMEM培養基，在37 ℃、5%CO2條件下培養。取對數生長期的細胞計數，按2×105個細胞/孔接種于6孔板，待細胞融合度達50%～70%時進行轉染。按照Lip 3000轉染試劑說明書，將2.5 μg siRNA用125 μL無血清培養基稀釋，5 μL Lip3000用125 μL無血清培養基稀釋，兩者混合后加入細胞中，8 h后換液繼續培養至48 h。PSMD14 siRNA的序列如下，F：5′- GCCAUCUACCACUUGCAAUTT-3′，R：5′- AUU GCA AGUGGUAGAUGGCTT-3′。

1.3.4CCK-8試驗 細胞轉染48 h后按3 000個/孔接種于96孔板，每組設置5孔，分別培養0、24、48、72 h，每孔加入10 μL CCK-8試劑，孵育1 h，酶標儀測定450 nm處吸光度(A)值。

1.3.5葡萄糖攝取試驗、乳酸生成試驗及相關性分析 腫瘤細胞常通過增強糖酵解來保證細胞的快速增殖[16]，因此本研究對PSMD14是否通過調控胰腺癌細胞的糖酵解來促進細胞增殖進行研究。葡萄糖攝取試驗：將轉染的細胞以3 000個/孔接種于96孔板中，待細胞貼壁后，更換為無血清培養基使細胞饑餓過夜。PBS洗3次，加入2-脫氧葡萄糖。按照葡萄糖攝取檢測試劑盒說明書處理細胞，酶標儀測定412 nm處A值(可反映葡萄糖攝取量)。乳酸生成試驗：將轉染的細胞以3 000個/孔接種于96孔板中，待細胞貼壁后，更換為無血清培養基，于24 h收集細胞培養上清，離心去除細胞碎片，按照乳酸生成檢測試劑盒說明書加入試劑，酶標儀測定450 nm處A值(可反映乳酸生成量)。為了進一步探討PSMD14調控細胞糖酵解的機制，通過GEPIA2分析PSMD14 mRNA與糖酵解限速酶HK2、PFKL、PKM mRNA表達水平的相關性。

1.3.6RNA提取及反轉錄實時熒光定量聚合酶鏈反應(RT-qPCR) 按照試劑說明用Trizol提取細胞總RNA，并用核酸儀檢測RNA濃度。用PrimeScript RT kit將RNA反轉錄為cDNA，再用SYBR Premix Ex TaqTMⅡ Kit及相應引物對cDNA進行PCR擴增。反轉錄及qPCR在Bio-rad CFX96型PCR儀上進行。引物序列如下，PKM2正向為5′-TCGCATGCAGVACCTGATT-3′,反向為5′-CCTCGAATAGCTGCAAGTGGTA-3′;β-actin正向為5′-GGACTTCGAGCAAGAGATGG-3′,反向為5′-AGCACTGTGTTGGCGTACAG-3′。

2 結 果

2.1PSMD14在胰腺癌和癌旁正常組織中的表達情況及與患者預后的關系 TCGA數據分析顯示：PSMD14 mRNA在胰腺癌組織中的表達水平顯著高于癌旁正常組織(P<0.05)。WB顯示：PSMD14蛋白在胰腺癌組織中的表達水平高于癌旁正常組織(P<0.05)。以PSMD14 mRNA表達水平中位數為界，將胰腺癌患者分為PSMD14高表達組和低表達組，PSMD14高表達組的總生存率和無病生存率均明顯低于PSMD14低表達組(P<0.05)。見圖1。

注：A為TCGA數據中PSMD14 mRNA在胰腺癌組織和癌旁正常組織中的表達水平比較，胰腺癌組織179例，癌旁正常組織171例，*表示兩組間比較P<0.05，以TPM表示mRNA的表達水平，縱軸數值為將TPM進行對數處理后的數值；B為WB檢測PSMD14蛋白在胰腺癌組織和癌旁正常組織中的表達水平，P1～P6為標本編號，T表示胰腺癌組織，N表示癌旁正常組織；C為PSMD14高、低表達組的總生存曲線和無病生存曲線。

2.2基因富集分析 GO功能注釋和KEGG通路富集分析顯示：PSMD14表達與細胞增殖的相關功能和通路有關，如DNA重組、細胞周期的正向調控等，提示PSMD14可能影響胰腺癌細胞的增殖。

2.3PSMD14對胰腺癌細胞增殖的作用 WB檢測顯示：轉染PSMD14 siRNA的細胞與轉染陰性對照siRNA的細胞相比，PSMD14蛋白表達水平明顯降低(P<0.05)。CCK-8試驗顯示：與轉染陰性對照siRNA的細胞相比，轉染PSMD14 siRNA的細胞增殖被明顯抑制(P<0.05)，說明PSMD14可以促進胰腺癌細胞的增殖。見圖2。

注：A為WB檢測各組細胞中PSMD14蛋白的表達水平及PSMD14蛋白表達水平的比較；B為CCK-8試驗檢測細胞的增殖能力；陰性對照表示轉染陰性對照siRNA，siRNA表示轉染PSMD14 siRNA。

2.4PSMD14促進細胞糖酵解 干擾PSMD14表達能顯著抑制細胞的葡萄糖攝取和乳酸生成(P<0.05)，見圖3。

注：A為葡萄糖攝取試驗；B為乳酸生成試驗;陰性對照表示轉染陰性對照siRNA，siRNA表示轉染PSMD14 siRNA；葡萄糖攝取量和乳酸生成量分別由相應的A值表示。

2.5PSMD14對糖酵解限速酶表達的影響 通過GEPIA2分析發現PSMD14 mRNA與糖酵解限速酶HK2、PFKL、PKM mRNA的表達水平呈正相關(r=0.30、0.25、0.41，P<0.05)。WB檢測顯示：干擾PSMD14表達能抑制PKM2蛋白的表達(P<0.05)，而對HK2和PFKL蛋白的表達無明顯影響(P>0.05)，說明PSMD14可能通過調控PKM2蛋白的表達影響胰腺癌細胞的糖酵解。RT-qPCR結果顯示：干擾PSMD14表達對PKM2 mRNA表達無明顯影響(P>0.05)，提示PSMD14可能通過轉錄后修飾的方式調控PKM2蛋白的表達。見圖4。

注：A為通過GEPIA2分析胰腺癌中PSMD14與HK2、PFKL和PKM2 mRNA表達水平的相關性，以TPM表示mRNA的表達水平，橫縱軸數值為將TPM進行對數處理后的數值；B為WB檢測各組細胞中HK2、PFKL和PKM2蛋白的表達水平及PKM2蛋白相對表達水平的組間比較；C為RT-qPCR檢測各組細胞中PKM2 mRNA的表達水平；陰性對照表示轉染陰性對照siRNA，siRNA表示轉染PSMD14 siRNA。

3 討 論

蛋白的泛素化和去泛素化是常見的轉錄后修飾過程，近年來越來越多的研究證實了其在腫瘤進展中發揮重要的調控作用[8]。PSMD14是去泛素化酶中JAMM家族成員之一，其在肝癌、肺癌、結直腸癌等多種腫瘤中表達上調，而且是影響預后的因素[10,12,14]。本研究首次探討了PSMD14在胰腺癌調控中的分子機制，發現PSMD14在胰腺癌組織中表達異常上調，其高表達與患者預后不良有關，這與其在其他多種腫瘤中的促癌作用一致[10,12,14]。

既往的研究表明，PSMD14可通過促進細胞增殖、促進上皮間質轉化、介導侵襲轉移過程、促進血管侵襲等多種方式促進腫瘤進展[12,17-18]，而PSMD14導致胰腺癌患者預后不良的分子機制尚不清楚。本研究通過基因富集分析挖掘了PSMD14在胰腺癌中可能參與的生物學過程，發現其富集的功能和通路與細胞增殖有關，提示PSMD14可能參與調控胰腺癌細胞增殖。進一步的實驗驗證發現，干擾PSMD14表達可抑制胰腺癌細胞增殖。在其他多種腫瘤中，靶向抑制PSMD14表達也能明顯抑制腫瘤進展。在黑色素瘤中，靶向抑制PSMD14可導致SMAD3的聚集和鋅指轉錄因子(SLUG)的減少，從而抑制腫瘤細胞的增殖和遷移[19]。JING等[11]研究發現，PSMD14抑制劑可拮抗E2F1/Akt/SOX2信號介導的腫瘤干性，從而逆轉化療抵抗現象。以上研究說明PSMD14可能作為腫瘤治療的潛在靶點。然而，在胰腺癌中PSMD14調控細胞增殖的機制尚不清楚，進一步闡明其機制將有助于評估其作為胰腺癌精準治療靶點的潛力。

無氧糖酵解，也稱為“Warburg效應”，是腫瘤的重要代謝重塑方式之一，腫瘤細胞因此可快速獲得能量供給并產生有利于腫瘤生長的微環境[20]。有研究表明，泛素化和去泛素化可調控腫瘤細胞的無氧糖酵解，并導致細胞增殖、遷移和侵襲能力等生物學行為的改變[21]。泛素化酶TRIM47通過增加果糖-1,6-二磷酸酶1(FBP1)的泛素化降解而促進細胞糖酵解，導致胰腺癌進展[22]，去泛素化酶OTUB2通過調控U2AF2的去泛素化維持其穩定性，從而促進肺癌細胞的糖酵解[23]。本研究結果顯示：干擾PSMD14表達能抑制胰腺癌細胞的葡萄糖攝取和乳酸生成，提示PSMD14可抑制細胞糖酵解。SUN等[9]研究發現PSMD14可促進卵巢癌細胞糖酵解進而加速腫瘤進展，使用PSMD14抑制劑可抑制腫瘤生長，與本研究結果一致。本研究發現，干擾PSMD14可抑制胰腺癌細胞增殖，但其對胰腺癌細胞侵襲能力的影響及在體內的效應仍需進一步地研究。

研究證實PSMD14可催化多種底物的去泛素化過程[10,14-15]，通過相關性分析，本課題組發現PSMD14與糖酵解關鍵酶HK2、PFKL和PKM存在共表達，提示PSMD14可能參與調控這3種酶的表達。進一步地發現，干擾PSMD14表達可降低PKM2蛋白表達水平，而對HK2和PFKL蛋白表達水平無影響，說明PKM2是PSMD14的調控靶點，此結果與在卵巢癌中的研究結果一致[9]。PKM2是糖酵解限速酶之一，參與調控包括胰腺癌在內的多種腫瘤細胞的糖酵解過程，能顯著影響腫瘤進展[24-25]。多種泛素化酶，如LHPP、Parkin、TRIM58等[26-28]，以及多種去泛素化酶，如OTUB2和USP20，可調控PKM2的泛素化和去泛素化過程[26-30]。LHPP、TRIM58和OTUB2調控PKM2的泛素化及蛋白的穩定性[26,28-29]。CHEN等[31]研究發現，Parkin調控PKM2的泛素化及降解過程，而LIU等[27]研究表明Parkin促進PKM2的泛素化并抑制酶活性，但不影響蛋白穩定性。USP20促進PKM2的去泛素化但不影響蛋白穩定性[30]。本研究結果發現干擾PSMD14表達能抑制PKM2蛋白的表達，但不影響PKM2 mRNA表達。因此，筆者推測PSMD14可能通過促進PKM2的去泛素化而增加其蛋白穩定性，但仍有待進一步的實驗研究來證實。鑒于泛素化和去泛素化對PKM2的蛋白穩定性和活性的調控機制復雜多變，結合本研究結果，下一步仍需要繼續研究PSMD14調控PKM2蛋白表達的具體機制，如明確PSMD14對PKM2的泛素化調控位點以及這種調控是否影響PKM2進入細胞核，是否影響PKM2的聚合形式等。

綜上所述，本研究證實了PSMD14在胰腺癌組織中高表達，PSMD14高表達與患者預后不良有關。PSMD14促進胰腺癌細胞糖酵解和增殖，這可能與其上調PKM2蛋白表達有關，而這也可能是其導致患者預后不良的原因之一。