慢性牙周炎患者血清STAT6 mRNA、HMGB1、MMP-13水平分析及臨床意義探討*

司 玲，崔 蕾，邊百川，韓 雪，趙 歡

河北省直屬機關第二門診部口腔科，河北石家莊 050000

慢性牙周炎是發生在牙周組織的慢性炎癥性疾病，由牙周細菌感染與宿主免疫功能失調引起，不及時治療可導致牙槽骨、牙骨質、牙齦和牙周韌帶等組織發生炎癥變化，甚至引起牙齒脫落[1]，為控制牙周炎進展應及早進行診治。宿主免疫反應失調、過度炎癥反應可引起組織損傷并影響細菌的有效清除，是慢性牙周炎組織損傷和疾病進展的主要原因[2]。信號轉導和轉錄激活因子6(STAT6)是炎癥反應的關鍵轉錄因子，STAT6信號傳導誘導巨噬細胞的表型轉化，調控炎癥反應[3]。高遷移率族蛋白B1(HMGB1)是一種重要的晚期炎癥反應介質，研究發現HMGB1可激活炎癥反應下游信號通路中的核因子-κB(NF-κB)導致炎癥級聯反應[4]?；|金屬蛋白酶-13(MMP-13)是基質金屬蛋白酶家族重要成員，通過切割Ⅱ型膠原參與軟骨降解過程，與骨關節炎發生密切相關[5]。STAT6 mRNA、HMGB1、MMP-13在慢性牙周炎中的報道并不多見，其臨床意義和價值尚不清楚，本研究擬檢測慢性牙周炎患者血清STAT6 mRNA、HMGB1、MMP-13，分析其與病情嚴重程度、炎癥反應和牙周臨床指標的相關性，為臨床診治提供參考。

1 資料與方法

1.1一般資料 將2019年2月至2022年2月本院收治的156例慢性牙周炎患者納入研究作為牙周炎組，男81、女75例，年齡41～69歲、平均(53.02±6.49)歲。納入標準：(1)符合第4版《牙周病學》中慢性牙周炎診斷標準[6]；(2)至少存留20顆牙齒；(3)年齡18周歲以上，對本研究知情同意。排除標準：(1)有種植牙、佩戴義齒；(2)近1周接受過去腐治療、根管治療、正畸治療及抗菌藥物和免疫抑制劑治療；(3)頜面創傷；(4)合并惡性腫瘤、自身免疫疾病。另外，選取72例于本院進行體檢的無口腔疾病的健康者作為對照組，男41例、女31例，年齡40～67歲、平均(52.95±6.01)歲。牙周炎組、對照組年齡、性別比較差異無統計學意義(P>0.05)。本研究已經獲得本院倫理會批準。

1.2儀器與試劑 Trizol試劑購自美國Invitrogen公司；Superscript Ⅲ cDNA擴增系統購自美國Invitrogen公司；Prism 9700 PCR儀購自美國Applied公司；FK-SY96S全自動酶標儀購自山東方科儀器有限公司；酶聯免疫吸附法(ELISA)檢測試劑盒購自上海酶聯生物科技有限公司。

1.3方法

1.3.1標本采集 所有受試者入組后后于次日清晨采集空腹靜脈血3 mL于無抗凝劑的試管，待血液凝固后取上層液體于離心管，以2 500～3 000 r/min的速度離心，取試管最上層液體(血清)作為待測標本，于-20 ℃保存。

1.3.2STAT6 mRNA的檢測 采用實時熒光定量聚合酶鏈反應(qPCR)檢測STAT6 mRNA水平。Trizol法提取總RNA，Superscript Ⅲ cDNA擴增系統將RNA反轉錄為cDNA。采用PCR儀進行檢測，反應條件：95 ℃ 30 s，然后95 ℃ 15 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s共45個循環。反應體系：Power SYBR?Green PCR Master Mix 2.5 μL，2 μL cDNA(12.5 ng)特異引物，RNase-Free ddH2O 21 μL。STAT6引物序列，正向：5′-TTCTGCCAAAGACCTGTCCAT-3′，反向:5′-CTGTCCTCTACCATAGTCACA-3′；GAPDH引物序列，正向：5′-CCACTCACGGCA AATTCAAC-3′，反向：5′-GGAGAAGGCGTTTGC TTAGTT-3′。采用2-ΔΔCt法，以GAPDH為內參，計算STAT6 mRNA的相對表達水平。

1.3.3炎癥因子的檢測 取血清標本，采用ELISA檢測血清HMGB1、MMP-13、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素(IL)-1α、IL-1β、IL-6水平。檢測步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.3.4牙周臨床指標評估 對牙周炎患者進行牙周臨床指標的評估。牙周臨床指標包括出血指數(BI)、探診深度(PD)和附著喪失(AL)。采用牙周探針(購自廣州市福星旺貿易有限公司)進行操作。探針與牙長軸平行，探針尖端緊貼牙面，探入牙袋底后記錄從袋底到齦緣的距離，即PD。AL指的是釉牙骨質界至袋底的距離，能客觀反映出牙周組織的破壞程度。參考文獻[7]評估BI，BI分為1～5級；1級：齦溝無出血；2級：輕探齦溝后出血；3級：探診后明顯出血，未溢出齦溝；4級：探診出血溢出齦溝；5級：齦溝自發性出血。1級賦值1分，以此類推。

1.3.5病情評估和分組 輕度牙周炎：牙齦有炎癥，BI<2，PD3～≤4 mm，AL 1～2 mm，X線片提示牙槽骨吸收<根長的1/3；中重度牙周炎：BI≥2，PD≥5 mm，AL≥3 mm，X線片提示牙槽骨吸收超過根長的1/3[6]。根據牙周炎病情嚴重程度將患者分為輕度組(80例)和中重度組(76例)。

2 結 果

2.1牙周炎組和對照組血清STAT6 mRNA、HMGB1、MMP-13及炎癥因子水平比較 牙周炎組血清STAT6 mRNA、HMGB1、MMP-13、TNF-α、IL-1α、IL-1β、IL-6水平均高于對照組(P<0.05)，見表1。

表1 兩組血清STAT6 mRNA、HMGB1、MMP-13及炎癥因子水平比較

2.2不同病情牙周炎患者血清STAT6 mRNA、HMGB1、MMP-13、炎癥因子及牙周臨床指標比較 中重度組血清STAT6 mRNA、HMGB1、MMP-13、TNF-α、IL-1α、IL-1β、IL-6水平及PD、BI、AL均高于輕度組(P<0.05)，見表2。

表2 不同病情牙周炎患者血清STAT6 mRNA、HMGB1、MMP-13、炎癥因子水平及牙周臨床指標比較

組別nIL-1β(pg/mL)IL-6(pg/mL)PD(mm)BI(分)AL(mm)輕度組80100.99±6.85123.86±10.124.01±0.631.52±0.262.02±0.37中重度組76116.24±10.05147.26±12.396.02±0.983.02±0.654.52±0.63t11.12312.94815.31519.09830.403P<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001

2.3牙周炎組STAT6 mRNA、HMGB1、MMP-13和炎癥因子、牙周臨床指標的相關性 牙周炎組STAT6 mRNA、HMGB1、MMP-13與TNF-α、IL-1α、IL-1β、IL-6水平及PD、BI、AL均呈正相關(P<0.05)，見表3。

表3 STAT6 mRNA、HMGB1、MMP-13和炎癥因子、牙周臨床指標的相關性分析

2.4STAT6 mRNA、HMGB1、MMP-13診斷慢性牙周炎的價值 STAT6 mRNA、HMGB1、MMP-13診斷慢性牙周炎的臨界值分別為2.31、76.09 ng/mL、201.41 pg/mL，ROC曲線的AUC分別為0.739、0.687、0.684，STAT6 mRNA、HMGB1和MMP-13聯合用于診斷慢性牙周炎的AUC為0.911，大于STAT6 mRNA、HMGB1和MMP-13單項檢測(Z=4.830、5.257、6.009，P<0.05)，見表4、圖1。

表4 STAT6 mRNA、HMGB1、MMP-13用于慢性牙周炎診斷的價值分析

圖1 STAT6 mRNA、HMGB1、MMP-13單項及聯合用于診斷慢性牙周炎的ROC曲線

3 討 論

慢性牙周炎是人類最常見的口腔疾病，也是導致牙齒脫落的主要原因，影響著全球約20%～50%的人口，已知吸煙、口腔衛生差、糖尿病、藥物、年齡、遺傳和心理壓力等是慢性牙周炎發病的高危因素，慢性牙周炎不僅可導致牙周組織炎性損傷，還可引起心血管疾病、糖尿病、癌癥、阿爾茲海默癥等全身性疾病[8-9]。慢性牙周炎發病機制復雜，目前認為是口腔菌群失調及先天和適應性免疫功能障礙介導的炎癥反應導致，牙周組織慢性炎癥由多種促炎細胞因子參與，包括IL-1α、IL-1β、TNF-α、IL-6和IL-17等大量炎癥因子釋放，炎癥反應失控導致牙周組織的慢性炎癥性損傷，最終引起骨吸收和牙齒的脫落[10]。

STAT是Janus激酶(JAK)下游信號傳遞細胞因子，JAK激活后細胞溶質STAT會發生酪氨酸磷酸化并二聚化，以響應各種外部刺激發生絲氨酸磷酸化，增強轉錄反應，JAK-STAT通路響應細胞內細胞因子和生長激素的信號傳導，啟動典型的信號級聯反應，參與造血、細胞生長、組織修復、免疫調控等生理過程，JAK-STAT信號傳導通路異常可引起癌癥、炎癥以及自身免疫性疾病[11]。STAT6是STAT家族成員之一，可被多種細胞因子以及JAK激活，參與免疫反應調控過程，研究顯示STAT6基因多態性與嗜酸性粒細胞增多、總免疫球蛋白E水平增高以及哮喘發病有關[12]。本研究發現，牙周炎患者血清STAT6 mRNA表達增高與牙周炎病情嚴重程度、炎癥因子、牙周炎指標有關，表明STAT6表達上調可能誘導牙周組織炎癥，加劇病情進展。分析原因：在牙周病原菌刺激下，JAK激活，誘導STAT6表達上調，STAT6二聚化并在細胞核內易位，刺激細胞凋亡、免疫調節和基因轉錄，激活單核細胞、中性粒細胞和T淋巴細胞，促使促炎細胞因子和趨化因子大量釋放，誘導炎癥反應發生[13]，加劇牙周炎病情進展。

HMGB1是一種高度保守的DNA結合蛋白，可通過與免疫細胞表面受體結合實現免疫調節，從而調控炎癥反應過程，在炎癥反應過程中HMGB1可通過激活其內源性配體——Toll樣受體4，激活NF-κB，進而誘導IL-1β、TNF-α、IL-6和IL-8等炎癥因子釋放和級聯反應，導致過度炎癥損傷[14-15]。本研究發現，HMGB1與慢性牙周炎也存在密切關系，表現牙周炎組血清HMGB1水平高于對照組(P<0.05)，且HMGB1水平隨著牙周炎病情的加重而增高，HMGB1與TNF-α、IL-1α、IL-1β、IL-6水平，PD、BI、AL呈正相關，說明HMGB1可能參與牙周局部炎癥損傷過程。推測其機制如下，首先，HMGB1通過與Toll樣受體相互作用促使炎性細胞因子的產生增加，誘導牙周炎癥反應和組織損傷[15]；其次，HMGB1通過與其配體-晚期糖基化終末產物受體結合會激活轉錄因子NF-κB，促使促炎因子TNF-α、IL-6等釋放，引起牙周組織炎癥[16]，繼而導致慢性牙周炎及病情的進展。

MMP-13也稱為膠原酶3，是Ⅱ型膠原蛋白裂解的關鍵酶，主要通過特定信號通路直接或間接啟動下游基質和膠原蛋白降解，MMP-13過度表達可導致上皮間質轉化，在癌癥侵襲、轉移、生長調節、免疫逃避、細胞凋亡和血管生成中具有重要作用[17]，MMP-13表達上調還可導致細胞外基質過度降解，誘導骨關節炎的發生[18]。本研究結果顯示：MMP-13過表達與慢性牙周炎發病有關，MMP-13表達越高牙周炎病情越重，牙周損傷越明顯，相關性分析結果顯示MMP-13與TNF-α、IL-1α、IL-1β、IL-6呈正相關，表明MMP-13可能調控炎癥反應參與慢性牙周炎發病過程，MMP-13過表達可能導致炎癥反應和牙周組織破壞。相關報道也指出：炎癥環境下NF-κB信號通路激活可誘導MMP-13表達上調，導致細胞外基質降解和骨代謝異常，進一步加劇炎癥反應[19]。抑制MMP-13表達可減輕脂多糖誘導的牙周炎小鼠模型中炎癥介質釋放和骨吸收[20]。

ROC曲線分析顯示：STAT6 mRNA、HMGB1、MMP-13在慢性牙周炎診斷方面具有一定價值， STAT6 mRNA、HMGB1、MMP-13聯合診斷的效能明顯提高，表明STAT6 mRNA、HMGB1、MMP-13可作為慢性牙周炎臨床診斷的輔助指標。

綜上所述，慢性牙周炎患者血清STAT6 mRNA表達上調，HMGB1、MMP-13水平增高，且中重度組血清STAT6 mRNA表達和HMGB1、MMP-13水平高于輕度組。STAT6 mRNA、HMGB1、MMP-13與血清炎癥細胞因子、PD、BI、AL呈正相關，提示STAT6、HMGB1、MMP-13可能通過調節牙周局部炎癥反應參與牙周組織破壞過程，STAT6 mRNA、HMGB1、MMP-13是慢性牙周炎診斷中頗具應用前景的指標。本研究局限之處在于樣本例數偏少，未觀察STAT6 mRNA、HMGB1、MMP-13與慢性牙周炎治療療效和預后的關系，尚待進一步擴大樣本量，增加觀測時間點加以證實。