甲、乙型流感病毒兩種方法檢測結果的一致性分析*

朱 旻，曹國君,2△，許 育，陳 瑜，陳 虹，武 媚，邢志芳，宋曉冬

1.復旦大學附屬華山醫院檢驗醫學科，上海 200040;2.中國科學院蘇州生物醫學工程技術研究所，江蘇蘇州 215163；3.復旦大學附屬華山醫院兒科，上海 200040

流行性感冒病毒是引起全球流行性感冒(以下簡稱流感)的病原體，主要通過飛沫傳播[1]，易感人群為老年人和兒童[2]。流感具有潛伏期短、發病迅速、呈季節性流行的特點[3-4]。流感患者臨床表現常為畏寒、頭痛等癥狀，兒童重癥病例可出現休克等并發癥[5-8]。由于流感病毒的高頻變異導致流感的精準診斷和疫情防控面臨諸多挑戰[9]。臨床上膠體金免疫層析(以下簡稱膠體金)法具有操作簡便、檢測時間短等優點，然而在檢測靈敏度和特異度方面存在缺陷，從而可能導致流感的漏診、誤診。隨著分子生物學技術的發展，聚合酶鏈反應(PCR)技術、質譜技術和測序技術等被陸續應用于病毒的檢測[10-13]。本研究擬將膠體金法和實時熒光定量PCR(qPCR)法同時應用于流感疑似患者標本的檢測，初步評估膠體金法和qPCR法在甲、乙型流感病毒檢測中的一致性，并評估C反應蛋白(CRP)、血清淀粉樣蛋白A(SAA)和白細胞計數等感染相關指標變化對于甲、乙型流感診斷的價值。

1 資料與方法

1.1一般資料 將2019年11月1日至2022年2月20日于復旦大學附屬華山醫院就診的、有流感樣癥狀的流感疑似患者300例納入研究并收集其口咽拭子標本。男143例、女157例，平均年齡(9.89±10.83)歲。流感樣癥狀的定義：(1)體溫≥38 ℃；(2)有頭痛、咳嗽、喉嚨痛、流涕、乏力中的一項癥狀。本研究獲得復旦大學附屬華山醫院倫理委員會的批準，所有納入研究者及其監護人均對本研究知情同意。

1.2儀器與試劑 DenoGen LunAmple48型自動核酸提取儀購自德諾杰億(北京)生物科技有限公司；SLAN-96S型全自動醫用PCR分析系統購自上海宏石醫療科技有限公司；甲型/乙型流感病毒核酸檢測試劑盒(PCR熒光探針法)購自北京卓誠惠生生物科技有限公司，流感病毒抗原檢測試劑盒(膠體金法)購自標準診斷(韓國)股份有限公司。

1.3方法 核酸提取與qPCR法檢測采用甲型/乙型流感病毒核酸檢測試劑盒，膠體金法檢測采用流感病毒抗原檢測試劑盒，具體作步驟和檢測結果的判讀嚴格按照試劑盒說明書進行。qPCR法檢測在3 h內完成檢測，膠體金法檢測在20 min內完成。采用測序法對檢測結果進行驗證，測序法作為結果判斷的“金標準”。根據測序結果，將受試者分為甲型流感病毒陽性組、乙型流感病毒陽性組和陰性組(甲、乙型流感病毒檢測均為陰性)。檢測并比較3組人群外周血CRP、SAA水平及白細胞計數、中性粒細胞絕對值、淋巴細胞絕對值、單核細胞絕對值。

2 結 果

2.1臨床標本的檢測情況及與測序法檢測結果的一致性分析 qPCR法檢出甲型流感病毒陽性45例(15.00%)，乙型流感病毒陽性124例(41.30%)；膠體金法檢測出甲型流感病毒陽性18例(6.00%)，乙型流感病毒陽性42例(14.00%)。將標本送第三方公司測序，測序法檢出甲型流感病毒陽性44例(14.67%)，乙型流感病毒陽性122例(40.67%)，陰性134例(44.67%)，見表1、2。以測序法檢測結果作為“金標準”，針對甲型流感病毒的檢測，qPCR法的檢測靈敏度、特異度、陽性預測值、陰性預測值分別為100.00%、99.61%、99.78%和100.00%，與測序法檢測結果一致性為99.67%(299/300)；膠體金法的檢測靈敏度、特異度、陽性預測值、陰性預測值分別為40.91%、100.00%、100.00%和90.78%，與測序法檢測結果一致性為91.33%(274/300)。針對乙型流感病毒的檢測，qPCR法的檢測靈敏度、特異度、陽性預測值、陰性預測值分別為100.00%、98.88%、98.39%和100.00%，與測序法檢測結果一致性為99.33%(298/300)；膠體金法檢測的靈敏度、特異度、陽性預測值、陰性預測值分別為34.43%、100.00%、100.00%和68.99%，與測序法檢測結果的一致性為73.33%(220/300)。

表1 qPCR法與測序法檢測結果的一致性分析(n)

表2 膠體金法與測序法檢測結果的一致性分析(n)

2.2qPCR法與膠體金法檢測結果的一致性分析 針對甲型流感病毒的檢測，qPCR法與膠體金法的檢測結果比較，差異有統計學意義(χ2=108.149，P<0.001)，兩種方法檢測結果的一致性一般(Kappa=0.531)。針對乙型流感病毒的檢測，qPCR法與膠體金法的檢測結果比較，差異有統計學意義(χ2=69.086，P<0.001)，兩種方法檢測結果的一致性差(Kappa=0.375)。見表3。

表3 qPCR法與膠體金法檢測結果的一致性分析(n)

2.3感染相關指標的組間比較 3組人群外周血CRP和SAA水平比較，差異無統計學差異(P>0.05)。白細胞計數、中性粒細胞絕對值、淋巴細胞絕對值和單核細胞絕對值比較，差異均有統計學意義(P<0.05)，陰性組上述4項指標水平均高于甲型流感病毒陽性組和乙型流感病毒陽性組(P<0.05)，但乙型流感病毒陽性組與甲型流感病毒陽性組比較，差異均無統計學意義(P>0.05)。見表4。

表4 3組人群外周血標本感染相關指標的比較

3 討 論

流感的大流行通常具有暴發突然、傳染性強和流行性廣等特點，為社會和家庭帶來沉重的負擔，甚至危及到患者生命安全。對流感進行早期、快速、準確的實驗室診斷不僅有助于臨床醫生盡早地控制患者病情，減少流感相關的死亡事件，減少陰性患者不必要的經驗性用藥，節約醫療資源，還有助于及時隔離流感患者，切斷傳染源，早期遏制疫情的蔓延，避免疫情的擴大。

流感相關的實驗室檢測方法多種多樣。常見的血常規檢測可通過不同功能細胞的數量與形態的變化對患者的病情進行初步評估。CRP和SAA都是由肝細胞產生的急性時相反應蛋白，當機體發生感染或損傷時其水平會迅速升高，已被臨床廣泛用作非特異的炎癥標志物。CRP水平升高見于細菌感染，病毒及支原體等病原體感染，其水平的升高早于血常規相關炎癥指標異常的出現[14]，具有更好的靈敏度。機體內SAA的水平升高常見于細菌、病毒、真菌和支原體等感染[15]，尤其是多見于病毒感染性疾病，其升高的速度和幅度顯著高于CRP，48 h可升高數百倍以上，因此SAA比CRP反應更靈敏。現有研究已表明，血常規感染相關指標、CRP和SAA等不同指標的聯合檢測對于提高流感的實驗室診斷率具有重要意義[15-17]。白細胞在機體的免疫防御中發揮著重要作用，而流感病毒為了更好地“生存”，可能會通過引起淋巴細胞凋亡和白細胞總數降低等方式抑制機體的免疫[18]。本研究結果顯示：與陰性組相比，甲型流感病毒陽性組和乙型流感病毒陽性組白細胞計數、中性粒細胞絕對值、淋巴細胞絕對值、單核細胞絕對值均有明顯的降低，其對于臨床流感的鑒別診斷具有一定的幫助，此結論與陳小橋等[19]的研究結果基本一致。然而與之前的文獻[15-17]不同的是：本研究中未發現3組間CRP和SAA水平差異有統計學意義(P>0.05)，因此某些情況下依靠CRP和SAA兩個指標并不能很好地區分甲型流感、乙型流感和其他病原體引發的呼吸道感染，流感的準確診斷仍要依賴于更加特異的實驗室檢測指標。針對流感病毒進行靶向檢測的技術包括病毒分離培養法、膠體金法、qPCR法、測序法、質譜技術、恒溫擴增技術和芯片技術等[10-13,20]，其中以膠體金法和qPCR法在臨床實驗室中的應用最為廣泛，而測序技術多被用作“金標準”方法。由于測序技術檢測成本高、檢測周期長、檢測通量低而難以被臨床實驗室廣泛應用。本研究發現，針對甲型流感病毒和乙型流感病毒的檢測，膠體金法的檢測靈敏度不足50.00%，而特異度很好，達到了100.00%；qPCR法的靈敏度達到100.00%，特異度達到98.00%以上，qPCR法所檢測到的1例甲型流感假陽性和2例乙型流感假陽性均為弱陽性，推測并不是真正的假陽性結果，而是由于測序法的檢測靈敏度低于qPCR法所致，鑒于本實驗的樣本量有限，未來的研究中將擴大樣本量，對目前的研究結論作進一步的驗證。造成膠體金法靈敏度差的主要原因：(1)qPCR法檢測是通過保守區域序列擴增來實現病毒核酸檢測的，在流感病毒HA和NA核酸序列發生變異時對檢測結果影響較小，但核酸序列變異會引起病毒抗原漂移，導致抗原檢測出現假陰性結果[21]。(2)抗原檢測受抗原表達情況的限制，感染初期和后期受免疫清除的影響，抗原表達水平低，而核酸可以大量游離于外周血中，因此qPCR檢測相比于抗原檢測具有更早、靈敏度更高的特點，同時可以對治療效果進行監測。與qPCR技術相比，膠體金法操作簡便、檢測成本低、檢測速度快、無需輔助設備和專門的實驗室，標本隨到隨檢，具有更多的靈活性，能幫助部分病毒載量高的患者就診當天就可以實現流感的快速、準確診斷，對于患者病情的控制具有重要意義，對于流感疫情的防控工作也具有不可忽略的價值。

綜上所述，為了實現流感病毒的快速、準確診斷，臨床實驗室可以采用膠體金法、qPCR法和實驗室常規感染指標聯合使用的策略。多種檢測方法的聯合使用有助于兼顧臨床工作中對報告時間與檢測結果準確性的要求，提高實驗室診斷率，減少流感的漏診和誤診。