重組分泌型Fas配體對肝癌細胞株HepG2凋亡的影響*

尚小玲，汪宏良，馮琴琴，胡 芳，楊 浩，諶章舟

1.黃石市中心醫院/湖北理工學院附屬醫院醫學檢驗科，湖北黃石 435000；2.湖北理工學院醫學院，湖北黃石 435003；3.腎臟疾病發生與干預湖北省重點實驗室，湖北黃石，435003；4.黃石市婦幼保健院產科，湖北黃石 435003

Fas/Fas配體(FasL)是一個重要的凋亡途徑，對維持機體穩態起著非常重要的作用，可以激活胞內Caspase級聯反應，促進細胞骨架降解和DNA片段化，導致細胞凋亡的發生。凋亡受體Fas即CD95，是一個重要的TNF受體家族成員，正常情況下在細胞表面跨膜表達，其蛋白相對分子質量為36×103[1-3]。FasL是一種可以與死亡受體TNFRSF6/Fas結合的細胞因子，它可以通過細胞毒作用誘導T細胞凋亡[4]。在人體內，Fas與其配體FasL結合后促使Fas陽性的細胞迅速凋亡。Fas與其配體FasL的結合可使正常細胞及腫瘤細胞發生細胞凋亡，細胞凋亡是機體抵御癌癥的重要防御手段，這種現象最常見于細胞毒性T細胞之中，這種現象是機體排除異常的細胞、清除異物的主要方式。Fas與其配體FasL都參與維持機體免疫環境的穩定[5-7]。免疫抑制治療是通過阻滯某些特定的通路來抵抗腫瘤。T細胞是殺滅腫瘤的主力軍，其表面可表達多種免疫抑制受體，而腫瘤細胞表面可以產生相應配體。配體通過與T細胞表面受體因子的結合，如Fas/FasL的結合，抑制T細胞的活化來抑制免疫應答反應[8-10]。Fas/FasL凋亡系統是誘導腫瘤細胞凋亡的重要途徑。將分泌型FasL轉染至人肝癌細胞后，分泌到細胞外的FasL可反作用于肝癌細胞表面凋亡受體Fas，觸發肝癌細胞內的凋亡信號通路。本研究構建了含有IL2信號肽序列的FasL基因重組慢病毒表達載體pCDH-IL2sig-FasL,利用磷酸鈣轉染技術將重組慢病毒載體及另外2個輔助質粒共轉染至HEK293細胞中，制備出具有感染性的缺陷型活病毒粒子，直接感染HepG2細胞,然后檢測外源性FasL基因的分泌性表達對對人肝癌細胞HepG2凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1材料 人肝癌細胞HepG2細胞株、人胚腎細胞HEK293細胞、大腸桿菌Top10為腎臟疾病發生與干預湖北省重點實驗室所有；真核表達載體pCDH-CMV-MCS-EF1-GFP+Puro(簡稱pCDH)、pcDNA3、psPAX2、pMD2.G購自湖南豐暉生物科技有限公司；Fas及FasL單克隆抗體購自Cell Signaling公司，Caspase-8及Actin單克隆抗體購自武漢三鷹生物公司；PrimeSTAR?HS DNA Polymerase、TRIzol RNA、RNA to cDNA EcoDry premix (oligo dT)、內切酶-BamHⅠ、XbaⅠ、NotⅠ、DNA連接酶等分子克隆相關試劑購自TaKaRa公司；2×Sybr Green 實時熒光定量PCR(qPCR)混合液購自上海翊圣生物公司；胎牛血清購自Biological Industries公司；嘌呤霉素購自武漢益易普公司；胰酶、雙抗、DMEM培養基購自美國Gibco公司；人FasL酶連免疫吸附測法(ELISA)試劑盒購自江蘇酶標生物科技有限公司公司；MTT試劑盒購自碧云天公司；二抗-HRP山羊抗兔IgG(H+L)抗體和HRP山羊抗鼠IgG(H+L)抗體購自安迪福諾生物科技武漢有限公司；RIPA裂解緩、ECL超敏發光液購自北京普利萊公司；引物均由武漢奧科公司合成。

1.2方法

1.2.1細胞培養 人肝癌細胞HepG2及人胚腎細胞HEK293分別用含10%胎牛血清、1%雙抗(P/S)的DMEM培養液置于37 ℃、5%CO2條件下培養，0.25%胰蛋白酶(含0.02%EDTA)消化傳代。

1.2.2重組慢病毒載體pCDH-IL2sig-FasL的構建與鑒定 以pcDNA3-IL2sig-FasL質粒為模板，設計引物擴增IL2sig-FasL cDNA片段，引物序列F：CTAGTCTAGAATGTACAGGATGCAACTCCT，R：CGCGGATCCTTAGAGCTTATATAAGCCGA。利用XbaⅠ和BamHⅠ兩種限制性內切酶同時酶切pCDH和擴增片段，分別純化和回收雙酶切后的載體pCDH和IL2sig-FasL片段，在DNA連接酶作用下將帶有缺口的pCDH載體和IL2sig-FasL片段連接(16 ℃連接4 h)，轉化到感受態細胞Top10中，37 ℃過夜培養。經雙酶切、菌液PCR及瓊脂糖凝膠電泳鑒定重組質粒pCDH-IL2sig-FasL，最后將重組質粒送武漢奧科公司測序。

1.2.3重組慢病毒LV-IL2sig-FasL和陰性對照病毒的制備及對HepG2細胞的感染 培養HEK293細胞，長滿后接種到8個直徑為10 cm的培養皿中，待其生長至密度約為60%左右開始轉染，其中4個培養皿用于重組慢病毒載體轉染，4個培養皿轉染陰性對照慢病毒載體(不含IL2sig-Fas)。按照分子克隆實驗磷酸鈣轉染法進行操作，同時將pCDH-IL2sig-Fa/pCDH、psPAX2、pMD2.G質粒以15、12、9 μg的量用磷酸鈣混合液轉染至HEK293細胞中，于37 ℃、5%CO2條件下培養至48 h。然后在倒置熒光顯微鏡下觀察轉染后的結果，若HEK293細胞表達綠色熒光蛋，證明慢病毒質粒轉染成功。構建的重組慢病毒記為LV-IL2sig-FasL，陰性對照慢病毒(不含IL2sig-Fas)記為LV?；厥占毎囵B基直接感染HepG2細胞，待72 h后加入終濃度為10 μg/mL的嘌呤霉素處理細胞，每天加1次，持續4 d，最終獲得全部被慢病毒感染的HepG2細胞，陽性命名為HepG2-LV-IL2sig-FasL細胞，陰性命名為HepG2-LV細胞。

1.2.4ELISA檢測FasL蛋白的分泌 培養HepG2-LV-IL2sig-FasL和HepG2-LV細胞至第72 h，收集兩種細胞的培養基，按照人FasL ELISA試劑盒說明書操作，用酶標儀在單波長450 nm處測定吸光度值(A450)，每個樣品設置3個平行重復檢測。

1.2.5MTT檢測細胞生長情況 將HepG2-LV-IL2sig-FasL、HepG2-LV、HepG2[作為空白對照(NC)]細胞分別以1×105/孔的密度種在96孔板中，每種細胞設置3個平行重復檢測，于37 ℃、5%CO2條件下培養至48 h后按照MTT試劑盒說明書進行操作，用酶標儀在單波長570 nm處測定3種不同細胞的吸光度值(A570)。

1.2.6qPCR檢測凋亡因子的轉錄水平 培養穩轉細胞HepG2-LV-IL2sig-FasL和HepG2-LV，在第96 h對FasL、Fas、Caspase-8、Fas相關死亡域蛋白(FADD)等凋亡相關基因的表達進行qPCR檢測。按TRIzol法提取2組細胞總RNA,取總RNA約2 μg,反轉錄合成cDNA,反應體積為20 μL。以GAPDH作為內參,取合成的cDNA 2 μL進行上述凋亡基因的qPCR檢測，每個樣本設置3個平行檢測，引物序列見表1。所有反應體系配制好后，置于ABI QuantStudio 5 qPCR儀進行檢測，PCR反應條件為95 ℃ 60 s,60 ℃ 30 s，共40個循環。當qPCR反應運行結束，導出數據并在GraphPad Prism 5軟件中進行統計學分析和作圖。

表1 實時熒光定量PCR引物序列

1.2.7Western blot檢測凋亡因子的蛋白表達水平 分別收集HepG2-LV-IL2sig-FasL、HepG2-LV、HepG2 3種細胞，用刮鏟刮取細胞，每個樣品加125 μL RIPA裂解緩沖液冰上裂解10 min，根據BCA蛋白定量試劑盒說明書操作，用Molecular Devices多功能酶標儀測定總蛋白，根據總蛋白水平確定上樣量。進行SDS-PAGE電泳，條件為120 V、90 min。然后轉膜(尼龍膜)，100 V轉膜1 h，用濃度為5%的牛奶緩沖液室溫下封閉1 h，分別與FasL、Fas、Caspase-8及β-Actin一抗孵育，4 ℃過夜。PBST洗滌3次，每次10 min，后與相對應的二抗室溫孵育1 h，用PBST重復洗3次，每次10 min。最后用ECL超敏發光液孵育后置于SGM2018147迷你化學發光成像儀顯色。以β-Actin作為內參，用ImageJ軟件測灰度值，計算上述蛋白的相對表達水平(以目的蛋白的灰度值與Actin灰度值的比值表示)。每個樣本設置3個平行重復檢測。

2 結 果

2.1重組慢病毒載體pCDH-IL2sig-FasL的構建與鑒定 挑取單克隆培養菌株(非藍白斑篩選)，進行菌液PCR擴增，篩選pCDH-IL2sig-FasL陽性質粒,產物經過瓊脂糖凝膠電泳鑒定，可以發現有約1 kb的DNA片段，同時抽提陽性重組質粒進行雙酶切鑒定，酶切產物經瓊脂糖凝膠電泳顯示，出現約大于8 kb和約1 kb兩條帶，與預期結果相符。最后，將陽性質粒送武漢奧科公司測序，將NCBI數據庫的序列與測序結果進行對比，證明序列完全一致。

2.2重組慢病毒的制備 48 h后在倒置熒光顯微鏡下觀察，發現HEK293細胞表達綠色熒光蛋白，說明慢病毒質粒制備成功。

2.3ELISA檢測FasL蛋白的細胞外分泌情況 HepG2-LV細胞培養基A450為1.0±0.10，HepG2-LV-IL2sig-FasL細胞培養基A450為1.4±0.05，差異有統計學意義(P=0.003)，說明加入IL2信號肽的FasL蛋白能夠分泌到細胞外。

2.4MTT檢測細胞生長情況 HepG2細胞A570最高,為4.21±0.15；HepG2-LV細胞A570為3.5±0.27；HepG2-LV-IL2sig-FasL細胞A570最低，為2.5±0.07；3種細胞間兩兩比較，差異均有統計學意義(P<0.05)。與其他兩種細胞比較，HepG2-LV-IL2sig-FasL細胞生長受到了明顯抑制，細胞外分泌的FasL蛋白對HepG2細胞具有抑制作用。

2.5qPCR檢測凋亡因子的轉錄水平 HepG2-LV-IL2sig-FasL細胞中FasL、Fas、Caspase-8、FADD的相對表達水平分別為HepG2-LV細胞的5.63±2.88、3.42±0.42、1.77±0.63、3.62±0.45倍，其中FasL、Fas、FADD的表達差異有統計學意義(P<0.05)。

2.6凋亡因子蛋白表達水平的Western blot檢測 HepG2-LV-IL2sig-FasL細胞的檢測中，FasL有條帶檢出，其余2種細胞未檢測出明顯條帶；而Fas和Caspase-8在所有細胞中均有條帶檢出。FasL蛋白在HepG2-LV-IL2sig-FasL細胞中的相對表達水平為3.4±0.37，明顯高于該蛋白在其他兩種細胞中的相對表達水平(P<0.001)；Fas和Caspase-8蛋白在HepG2-LV-IL2sig-FasL細胞中的相對表達水平分別為2.8±0.32和3.0±0.34，也明顯高于這兩種蛋白在其他細胞中的表表達水平(P<0.001)。見圖1。

注：NC表示作為空白對照的HepG2細胞；LV表示HepG2-LV細胞；LV-FasL表示HepG2-LV-IL2sig-FasL細胞；A為Western blot條帶圖；B、C、D分別為FasL、Fas、Casp-8蛋白在3種細胞中的相對表達水平比較。

3 討 論

本研究采用慢病毒作為FasL基因的運載工具，將其有效地整合到宿主染色體上，達到FasL在HepG2細胞中持久性表達的目的。同時克服了一般運載分子的缺點，如使生物大分子構象改變、活性部位易受到影響、藥效降低和毒副作用等[11-14]。

Fas/FasL通路在胞內具有雙重調控作用。一方面，FasL與靶細胞表面受體Fas結合，使Fas細胞質區的死亡結構域(DD)與轉接器蛋白的FADD結合，形成死亡誘導信號復合體(DISC)，進而激活下游的凋亡蛋白，從而介導細胞凋亡以保證功能異常細胞能夠被及時清除，在免疫監測中扮演著十分重要的作用[15-18]。另一方面，當Fas/FasL介導的細胞凋亡發生了異常改變，引起一系列的不良反應，繼而對人體造成不良的影響。研究證明Fas或FasL的不正常表達可能與細胞損傷、生殖系統疾病、免疫疾病、神經系統病變、炎癥反應、腫瘤發生有關[19]。

高彥軍等[20]發現，PM2.5動物實驗組中大鼠肺組織出現顯著病變并伴有凋亡跡象，隨著刺激物PM2.5水平增加，凋亡水平也增加，而且Western blot證明Fas、FasL、Caspase-8等蛋白的表達隨PM2.5的增加而增加。因此PM2.5的有效暴露可以誘導實驗動物肺上皮細胞發生Fas/FasL途徑介導的凋亡。

戴芳等[21]通過對20例臨床精液標本進行分析，發現弱精組、少精組和少弱精組中Fas表達水平與正常組相比均偏高，但與精子濃度、前向運動精子數呈負相關，差異有統計學意義(P<0.05)。同時，少精組和少弱精組中FasL轉錄水平上調，Fas轉錄水平與前向運動精子和精子活力呈正相關，差異有統計學意義(P<0.05)。該研究初步證實Fas/FasL在轉錄及表達水平的異常促進了精細胞凋亡。有研究發現納米二氧化硅通過誘導小鼠睪丸TM4細胞氧化應激反應，激活Fas/FasL通路，促使TM4細胞發生凋亡，且納米二氧化硅表現出劑量依賴性地抑制TM4細胞的存活率和數量[22]。

毒性彌漫性甲狀腺腫(Graves)患者I131治療前后的對比分析得出，觀察組中外周血Fas表達水平高于對照組，緩解組、復發組的Fas表達水平均高于對照組，緩解組Fas表達水平低于觀察組和復發組，所有對比均有統計學意義(P<0.05)。由此可見，Fas在外周血中的表達水平隨著Graves病程的發展而升高[23]。還有類似研究顯示慢性淋巴細胞性甲狀腺炎患者經硒酵母聯合地塞米松治療后，血清中Fas和FasL的蛋白表達水平明顯降低，患者的甲狀腺功能明顯改善[24]。

Fas/FasL通路在神經系統疾病中也扮演重要角色，研究人員發現在對難治性癲癇患者予以左乙拉西坦聯合鼠神經生長因子治療半年后，可有效控制癲癇發作，提高臨床療效，且FasL、Fas、Bcl-2等蛋白水平也顯著低于對照組(P<0.05)，說明Fas/FasL通路參與了癲癇的發病過程[25]。

Fas/FasL通路是維持機體組織正常生理功能的重要信號通路。研究證明，Fas和FasL廣泛表達于人體組織細胞中，一但機體組織細胞功能遭到破壞，就會直接導致Fas/FasL凋亡通路無法執行凋亡程序，啟動異常細胞的死亡，造成機體相關組織細胞走向不可逆轉的癌變[26]。結腸癌細胞中CD47高表達，但過表達CD47蛋白卻又阻斷Fas/FasL通路，抑制人結腸癌細胞SW480凋亡[27]。辣椒素可以抑制人胃癌細胞MKN-45的活力，促進Fas/FasL通路介導的細胞凋亡[28]。研究人員還發現肝癌和上皮性卵巢癌組織中存在Fas跨膜表達的下調和FasL跨膜表達增加的情況，這樣腫瘤細胞表面Fas受體無法被免疫細胞識別，同時腫瘤細胞表面異常表達的FasL配體又會結合免疫細胞膜表面受體Fas從而誘導免疫細胞自身凋亡，以此來逃避宿主的免疫應答[29-30]。

目前，治療肝癌的主要方法以手術、放射介入、化療為主，但整體療效有限，多數患者就診時已屬肝癌晚期，不符合手術治療范圍，化學藥物可以阻止癌細胞的增殖，但藥物不僅作用于癌細胞，也會對正常的組織細胞造成損傷，引起臨床不良反應。放射治療的不良反應也一樣明顯。因此需要尋求有效治療肝癌的新手段，而生物療法是腫瘤治療領域的一場革新，其中就包括免疫檢查點抑制治療法，而Fas/FasL通路在多種疾病特別是腫瘤發生、發展過程中起重要作用，有可能成為治療的靶點。

綜上所述，本研究結果顯示，添加的IL2信號肽的分子能夠引導FasL蛋白分泌到HepG2細胞外，還能抑制腫瘤HepG2細胞增殖，提高細胞內凋亡信號因子的轉錄水平和蛋白表達水平，具有明顯的抗腫瘤作用。但本實驗僅在細胞外證明外源性FasL對HepG2細胞的抑制效果，本課題組還將進一步開展動物模型體內實驗，驗證本研究采用的方法在臨床治療中的可行性。本研究成功采用慢病毒系統表達可分泌至細胞外的FasL蛋白，初步證明了靶向Fas/FasL通路治療肝癌的可能性，為肝癌治療的研究提供了新的思路。