結(jié)直腸癌患者血清lncRNA SNHG11及miRNA-27b水平分析及與預(yù)后的關(guān)系*

陳毅聰,尚爾波,侯園婷,敖 俞

廣州市增城區(qū)中醫(yī)醫(yī)院：1.檢驗科;2.腫瘤科,廣東廣州 511300;3.廣州市番禺區(qū)中心醫(yī)院腫瘤科，廣東廣州 511400

結(jié)直腸癌是一類常見的消化道惡性腫瘤疾病，其發(fā)病率及病死率均居惡性腫瘤前列，且隨著社會的發(fā)展，結(jié)直腸癌的發(fā)病率呈逐年上升趨勢[1-2]。早期結(jié)直腸癌的臨床癥狀并不明顯，多數(shù)患者確診時已進(jìn)展為中晚期，雖然結(jié)直腸癌的診斷、治療已取得較大進(jìn)展，但研究表明，結(jié)直腸癌患者5年生存率仍不足50%，而且約有40%患者會出現(xiàn)轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)[3-5]。因此，研究結(jié)直腸癌生物標(biāo)志物對疾病的診斷和治療具有十分重要的意義。長鏈非編碼RNA(lncRNA)是一類長度為200～300 bp的非編碼RNA分子，其可調(diào)節(jié)組蛋白的修飾、蛋白質(zhì)功能活性以及染色體重塑等，并通過轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后調(diào)控以及表觀遺傳等過程調(diào)控基因的表達(dá)[6-7]。已有研究證實，lncRNA可參與機(jī)體多種生理、病理過程，并在癌細(xì)胞的生長、增殖中發(fā)揮重要作用[8]。lncRNA小核RNA宿主基因11(SNHG11)屬lncRNA家族成員之一，位于人類染色體20q11.23上。既往關(guān)于lncRNA SNHG11在結(jié)直腸癌中表達(dá)的研究多集中于組織標(biāo)本[9]，關(guān)于其在血清中的水平及與患者臨床特征關(guān)系的報道較少。微小RNA(miRNA)是一類內(nèi)源性非編碼小RNA分子，其主要通過抑制作用調(diào)節(jié)機(jī)體基因表達(dá)。miRNA在細(xì)胞增殖、凋亡、分化等過程中發(fā)揮著重要作用。研究表明，miR-27b與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，但其在結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展中的表達(dá)情況尚未明確[10]。基于此，本研究對結(jié)直腸癌患者血清lncRNA SNHG11、miR-27b水平進(jìn)行分析，并研究這兩項指標(biāo)與結(jié)直腸癌患者預(yù)后的關(guān)系，旨在為結(jié)直腸癌的診斷、治療及預(yù)后評估提供新的思路。

1 資料與方法

1.1一般資料 將2016年1月至2018年1月廣州市增城區(qū)中醫(yī)醫(yī)院收治的94例結(jié)直腸癌患者納入研究作為結(jié)直腸癌組，男55例、女39例，年齡(58.4±5.6)歲；將同期于本院就診的94例結(jié)直腸良性疾病患者納入研究作為結(jié)直腸癌良性疾病組，男58例、女36例，年齡(58.1±6.2)歲；另外，選取94例體檢健康者作為對照組，男50例、女44例，年齡(57.9±6.8)歲。所有納入研究者均對本研究知情同意并簽署知情同意書。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2納入及排除標(biāo)準(zhǔn) 結(jié)直腸癌組納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)經(jīng)病理學(xué)檢查確診為結(jié)直腸癌；(2)既往無手術(shù)史；(3)擬行外科手術(shù)治療；(4)術(shù)前未行放化療；(5)年齡≥18歲。結(jié)直腸良性疾病組納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)確診為炎性疾病、損傷性疾病或非腫瘤的息肉性疾病等結(jié)直腸良性疾病；(2)既往無手術(shù)史；(3)年齡≥18歲。對照組納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)近1個月內(nèi)體檢健康；(2)年齡≥18歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)有其他系統(tǒng)或組織的惡性腫瘤；(2)合并感染性疾病、心肺功能障礙性疾病等其他嚴(yán)重疾病；(3)近6個月服用過免疫功能調(diào)節(jié)藥物等可能影響實驗結(jié)果的藥物；(4)依從性差；(5)處于妊娠期或哺乳期；(6)同時參加了其他研究項目。

1.3方法

1.3.1指標(biāo)的檢測 所有納入研究者于入組時抽取靜脈血5 mL，以3 000 r/min離心5 min，分離血清，根據(jù)RNA提取試劑盒說明書提取血清RNA，并根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，采用SYBR 實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qPCR)試劑盒(中國杭州博日科技有限公司)進(jìn)行qPCR檢測。PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 10 min，95 ℃ 10 s，60 ℃ 1 min，循環(huán)40次。采用2-ΔΔCt法計算各組lncRNA SNHG11、miR-27b相對表達(dá)水平，內(nèi)參為U6，每個標(biāo)本重復(fù)檢測3次，取平均值。引物由中國北京鼎國生物科技有限公司合成，序列見表1。

表1 引物序列

1.3.2觀察指標(biāo) (1)比較結(jié)直腸癌組、結(jié)直腸良性疾病組及對照組血清lncRNA SNHG11、miR-27b水平；(2)以結(jié)直腸癌患者lncRNA SNHG11、miR-27b水平平均值為界將患者分為高表達(dá)組和低表達(dá)組，隨訪3年，采用K-M生存曲線分析兩組患者累積存活率。(3)根據(jù)結(jié)直腸癌組患者年齡、性別、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、有無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、病理類型、TNM分期、腫瘤最大徑及分化程度將其分為不同亞組，比較亞組間lncRNA SNHG11、miR-27b水平；(4)采用受試者工作特征(ROC)曲線分析lncRNA SNHG11、miR-27b水平用于評估患者生存預(yù)后的價值；(3)根據(jù)隨訪3年后患者是否存活，將其分為存活組和死亡組，比較兩組患者的血清lncRNA SNHG11、miR-27b水平。

2 結(jié) 果

2.13組血清lncRNA SNHG11、miR-27b水平比較 相較于結(jié)直腸良性疾病組及對照組，結(jié)直腸癌組血清lncRNA SNHG11水平更低(P<0.05)，而miR-27b水平更高(P<0.05)，見表2。

表2 3組血清lncRNA SNHG11、miR-27b水平比較

2.2不同臨床特征結(jié)直腸癌患者血清lncRNA SNHG11、miR-27b水平比較 相較于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或TNM分期為Ⅰ～Ⅱ期患者，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期患者血清lncRNA SNHG11水平更低(P<0.05)，而miR-27b水平更高(P<0.05)，見表3。

表3 不同臨床特征結(jié)直腸癌患者血清lncRNA SNHG11、miR-27b水平比較

續(xù)表3 不同臨床特征結(jié)直腸癌患者血清lncRNA SNHG11、miR-27b水平比較

2.3存活組和死亡組lncRNA SNHG11、miR-27b水平比較 存活組lncRNA SNHG11、miR-27b相對表達(dá)水平分別為4.16±0.40、3.52±0.35，死亡組lncRNA SNHG11、miR-27b相對表達(dá)水平分別為3.53±0.35、4.08±0.37，兩組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(t=8.150、7.384，P<0.001)。

2.4lncRNA SNHG11、miR-27b水平用于評估結(jié)直腸癌患者生存預(yù)后的價值 ROC曲線分析顯示：lncRNA SNHG11用于評估患者生存預(yù)后的最佳截斷值為3.883，曲線下面積(AUC)為0.868；miR-27b用于評估患者生存預(yù)后的最佳截斷值為3.971，AUC為0.851，見表4。

表4 lncRNA SNHG11、miR-27b水平用于評估結(jié)直腸癌患者生存預(yù)后中的價值

2.5lncRNA SNHG11高表達(dá)組及低表達(dá)組累積存活率的比較 隨訪3年，lncRNA SNHG11高表達(dá)組(54例)中36例存活，累積生存期為32.99(32.12，33.86)個月，累積存活率為66.67%，lncRNA SNHG11低表達(dá)組(40例)中16例存活，累積生存期為26.93(25.35，28.50)個月，累積存活率為40.00%，兩組累積存活率比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(logrankχ2=26.438，P<0.05)。

2.6miR-27b高表達(dá)組及低表達(dá)組累積存活率比較 隨訪3年，miR-27b高表達(dá)組(43例)中18例存活，累積生存期為33.16(32.21，34.10)個月，累積存活率為41.86%，miR-27b低表達(dá)組(51例)中34例存活，累積生存期為27.50(25.89，29.12)個月，累積存活率為66.67%，兩組累積存活率比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(logrankχ2=27.198，P<0.05)。

3 討 論

雖然結(jié)直腸癌的早期檢出率已有所提高，并為手術(shù)根治提供了時間窗口，但仍有一定比例的患者死于復(fù)發(fā)或者轉(zhuǎn)移。目前臨床上針對結(jié)直腸癌的診斷及評估病情的方法包括篩查試驗、結(jié)腸鏡檢查、直腸指檢、糞便隱血檢查、雙重對比劑鋇灌腸造影、組織病理學(xué)檢查等，其中診斷的金標(biāo)準(zhǔn)為結(jié)腸鏡檢查聯(lián)合組織病理檢查。“金標(biāo)準(zhǔn)”采用的檢查方法具有較高的靈敏度和特異度，有助于醫(yī)師在疾病進(jìn)展前期進(jìn)行根治治療[11]，但均包含了侵入性操作且花費較高，導(dǎo)致患者依從性較差。而其他幾類方法雖操作簡便、成本較低，但因靈敏度和特異度不高，應(yīng)用受限。因此尋找一種容易檢測、靈敏度高的生物學(xué)標(biāo)志物具有十分重要的意義。

既往的研究表明，結(jié)腸上皮細(xì)胞中的遺傳以及表觀遺傳學(xué)變化的累積是促進(jìn)結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展的因素[12-13]。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，lncRNA與腫瘤的關(guān)系逐漸受到廣大醫(yī)學(xué)研究者的關(guān)注，研究取得一定進(jìn)展[14-17]。大量lncRNA參與了結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展過程，并發(fā)揮重要作用[12]。lncRNA CCAT1在結(jié)直腸癌發(fā)生的早期階段已有所升高，患者血標(biāo)本中其水平也有所升高[18]。TAKAHASHI等[19]的研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA PVT-1可對TGF-β信號通路以及調(diào)亡信號產(chǎn)生抑制作用，進(jìn)而促進(jìn)結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展，并提示lncRNA PVT-1可作為評估結(jié)直腸癌患者預(yù)后指標(biāo)之一。SNHG11為小核RNA宿主基因(SNHGs)之一，既往有研究報道，其在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)水平與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[20]。XU等[21]的研究則提示，血漿lncRNA SNHG11可作為結(jié)直腸癌早期診斷及預(yù)后評估的生物學(xué)標(biāo)志物。本研究則采用較易獲得的血清作為檢測標(biāo)本。結(jié)果顯示，相較于結(jié)直腸良性疾病患者或健康者，結(jié)直腸癌患者血清lncRNA SNHG11水平有所下降。進(jìn)一步根據(jù)患者臨床特征進(jìn)行亞組分析，結(jié)果顯示，相較于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或TNM分期為Ⅰ～Ⅱ期患者，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期患者血清lncRNA SNHG11水平更低(P<0.05)。這與既往研究結(jié)果較為一致[21]，但本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)血清lncRNA SNHG11水平在有/無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的亞組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，這可能與標(biāo)本來源不同、檢測方式不同有關(guān)。

miRNAs是一類長度為17～25個核苷酸的非編碼RNA，其不能編碼蛋白質(zhì)，主要作用機(jī)制為通過與靶基因的3′端非翻譯區(qū)相結(jié)合從而對靶基因的表達(dá)進(jìn)行抑制，miRNA在疾病的發(fā)生發(fā)展、過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[22]。miR-27b位于人9號染色體上，miR-27b在多種腫瘤組織中存在異常表達(dá)，miR-27b可能參與癌癥的發(fā)生、發(fā)展[23]。本研究結(jié)果顯示，相較于結(jié)直腸良性疾病患者或健康人群，結(jié)直腸癌患者血清miR-27b水平顯著升高。進(jìn)一步根據(jù)患者臨床特征進(jìn)行亞組分析，結(jié)果顯示，相較于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或TNM分期為Ⅰ～Ⅱ期患者，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期患者血清miR-27b水平更高，這提示miR-27b表達(dá)水平與結(jié)直腸癌患者病情存在一定聯(lián)系。

本研究還通過ROC曲線分析了血清lncRNA SNHG11、miR-27b水平用于評估結(jié)直腸癌患者生存預(yù)后的價值。結(jié)果顯示，lncRNA SNHG11的最佳截斷值為3.883，AUC為0.868；miR-27b的最佳截斷值為3.971，AUC為0.851；上述兩項指標(biāo)均具有較高的靈敏度和特異度。隨訪結(jié)果顯示，相較于lncRNA SNHG11低表達(dá)或miR-27b高表達(dá)患者，lncRNA SNHG11高表達(dá)或miR-27b低表達(dá)患者累積存活率更高，說明血清lncRNA SNHG11水平較低或miR-27b水平較高患者預(yù)后較差。

本研究也存在以下不足：(1)為單中心研究，樣本量較小；(2)未進(jìn)一步分析血清lncRNA SNHG11水平與患者病理組織lncRNA SNHG11表達(dá)的相關(guān)性，難以從分子生物學(xué)角度進(jìn)行分析。

綜上所述，結(jié)直腸癌患者血清lncRNA SNHG11水平有所下降，而miR-27b水平有所上升，其水平在診斷患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期中具有一定價值，并可作為輔助指標(biāo)用于評估患者預(yù)后。