lncRNA CASC11在三陰性乳腺癌中的臨床意義及其與miR-676-3p調控的關系

徐 陽 ，潘勝男

南京醫科大學附屬淮安第一醫院醫學檢驗中心，江蘇淮安 223300

三陰性乳腺癌(TNBC)指的是免疫組織化學染色報告中，雌激素受體(ER)、孕激素受體(PR)及人表皮生長因子受體2(EGFR-2)均為陰性的乳腺癌亞型[1]，約占新診斷乳腺癌數量的24%[2]，是目前乳腺癌治療中最棘手的一類，病死率高且最容易轉移和復發[3]，雖然診斷和治療的手段有了長足的發展，但是TNBC患者的生存率仍然不容樂觀[4]，腫瘤轉移極大地降低了治療的成功率，是腫瘤相關性死亡首要的因素[5-6]，因此，全面了解TNBC發生、發展的機制對于改善患者的預后意義重大。長鏈非編碼RNA(lncRNAs)是長度超過200個核苷酸且缺乏蛋白質編碼功能的轉錄本，參與多種生理和病理過程，尤其是腫瘤領域[7]。此外，越來越多的證據表明lncRNA能夠通過競爭性內源RNA(ceRNA)機制吸附微小RNA(miRNAs)調控下游基因表達和生物學功能，例如lncRNA BCRT1通過miR-1303/PTBP3促進乳腺癌的進展[8]，lncRNA H19通過吸附miR-19b-3p促進肺癌細胞鐵死亡[9]。本研究擬探討lncRNA癌易感候選基因11(CASC11)對TNBC細胞株MDA-MB-231遷移和侵襲能力的影響及其調控機制，以期為TNBC的轉移機制研究提供新的見解。lncRNA CASC11也有望成為TNBC新的治療靶點和預后標志物。

1 材料與方法

1.1材料與試劑 實驗中所使用的132例TNBC組織和配對癌旁組織的cDNA芯片購自上海芯超生物科技有限公司，公司與合作醫院簽訂了合作協議，標本收集獲得合作醫院的倫理委員會批準并經過被研究對象及其家屬同意，產品編碼HBreD132Su07，患者臨床及病理資料包括年齡、性別、脈管浸潤、陽性淋巴結數目、淋巴結轉移、遠處轉移、TNM分期以及隨訪資料等信息，所有患者術前均未接受任何治療，包括放射治療、化學治療及靶向治療等治療。手術時間從2009年1月至2016年9月，隨訪截至2020年8月，死亡29例，完整資料可以在網站(https://www.superchip.com.cn/)上查詢。胎牛血清(FBS)和DMEM培養基購自美國Thermo公司，Trizol試劑和Lipofectamine 2000購自美國Invitrogen公司，實時熒光定量PCR(qPCR)檢測試劑盒購自日本Takara公司，Transwell小室購自美國康寧公司，lncRNA CASC11小RNA干擾片段(si-CASC11)、miR-676-3p類似物(mimics)/抑制劑(inhibitor)、lncRNA CASC11野生型和突變型雙熒光素酶報告載體均由上海吉泰生物有限公司構建合成，雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自美國Promega公司，所有引物購自上海生物工程有限公司。使用Starbase2.0(http://starbase.sysu.edu.cn/)以及TCGA (https://portal.gdc.cancer.gov)生物信息學數據庫驗證lncRNA CASC11與miR-676-3p是否存在物理學上的結合位點。

1.2方法

1.2.1細胞培養 人正常乳腺上皮細胞株(MCF-10A)以及4個TNBC細胞系(MDA-MB-231、4T1、BT549和HCC1937)購自中國科學院上海細胞庫，將細胞培養使用含10% FBS的DMEM培養基中，放置于5%CO2、37 ℃的孵育箱中培養，待細胞生長至70%～80%密度后進行傳代，選擇對數生長期的細胞進行實驗。

1.2.2細胞轉染和雙熒光素酶報告實驗 取對數生長期的MDA-MB-231細胞制備成單細胞懸液，均勻的接種在六孔板中，于5%CO2、37 ℃的孵育箱中孵育24 h，當細胞密度達到約70%～80%，根據試劑盒說明書進行轉染。配制A液：將5 μL干擾片段或5 μL陰性對照加入到250 μL的低血清培養基中，輕柔混勻靜置5 min；B液：將5 μL lipofectamine 2000加入到250 μL的低血清培養基中，輕柔混勻靜置5 min，將A液和B液混勻并靜置20 min，緩慢加入到相應六孔板中，繼續置于5% CO2、37 ℃的培養箱中培養。構建含有miR-676-3p結合位點的野生型和突變型lncRNA CASC11雙熒光素酶報告載體。lncRNA CASC11突變型質粒突變的部分是與miR-676-3p結合的位點(Starbase2.0數據庫預測)。使用lipofectamine 2000將雙熒光素酶報告載體或陰性對照與miR-676-3p mimics 共轉染至TNBC細胞中，48 h后測定各組熒光素酶活性。

1.2.3qPCR檢測lncRNA CASC11和miR-676-3p的表達水平 使用Trizol試劑提取TNBC細胞系和人正常乳腺上皮細胞株中總RNA，根據反轉錄試劑盒提供說明書進行反轉錄，分別以GAPDH和U6為內參，參照熒光定量PCR試劑盒說明書使用熒光定量PCR儀對lncRNA CASC11和miR-676-3p的表達水平進行qPCR檢測，采用公式2-ΔΔCt計算lncRNA CASC11和miR-676-3p的相對表達水平，本研究所使用的引物序列見表1。qPCR檢測lncRNA CASC11/miR-676-3p的反應條件：95 ℃預變性30 s，95 ℃變性15 s，65 ℃退火30s，72 ℃延伸34 s，共35個循環。

1.2.4Transwell實驗檢測細胞遷移和侵襲能力 用胰蛋白酶消化并收集對數生長期細胞，用無血清培養基將每組細胞調整為5×107/mL的懸液，取250 μL細胞懸液加入到上層小室中(侵襲實驗在此基礎上小室底部加入配套的基質膠)，在下層小室中加入500 μL含10% FBS的DMEM培養基，于37 ℃、5% CO2培養箱中孵育24 h，用棉簽擦去小室上層未穿過膜的細胞，將小室放置于4%多聚甲醛中30 min，取出晾干后進行結晶紫染色，用倒置顯微鏡隨機挑選5個高倍鏡視野計算穿膜細胞數并拍照。

表1 所用引物序列

1.3統計學處理 本研究采用SPSS 21.0和GraphPad Prism 7.0軟件進行統計學分析，統計學方法包括t檢驗、方差分析、Pearson相關、χ2檢驗、Fisher精確檢驗、似然比檢驗、Cox回歸分析及Kaplan-Meier分析等。P<0.05為差異有統計學意義，所有實驗均重復至少3次。

2 結 果

2.1lncRNA CASC11在TNBC中的相對表達水平及其與TNBC患者臨床病理參數間的相關性 qPCR結果顯示，與癌旁組織相比，lncRNA CASC11在TNBC組織中的相對表達水平異常升高，而miR-676-3p則表達下調，見表2，差異有統計學意義(P<0.05)。通過對4種TNBC細胞(MDA-MB-231、4T1、BT549和HCC1937)以及人正常乳腺上皮細胞MCF-10A中lncRNA CASC11的相對表達水平進行檢測，結果發現4種TNBC細胞中lncRNA CASC11的相對表達水平均高于人正常乳腺上皮細胞MCF-10A，差異均有統計學意義(P<0.05)，見圖1。此外，通過分析lncRNA CASC11的表達水平與患者臨床病理間參數間的關系，結果發現，TNBC組織中lncRNA CASC11的相對表達水平與TNBC患者脈管浸潤、陽性淋巴結數目、淋巴結轉移、遠處轉移、TNM分期以及復發情況有關，lncRNA CASC11相對表達水平越高，TNBC患者有較多的腫瘤細胞脈管浸潤，有較多的淋巴結及遠處轉移，TNM分期更高，更易復發(P<0.05)，此外，lncRNA CASC11相對表達水平與患者年齡、T分期無關(P>0.05)，見表3。

表2 TNBC組織和癌旁組織中lncRNA CASC11及miR-676-3p相對表達水平

表3 TNBC組織中lncRNA CASC11相對表達水平與患者臨床病理參數間的相關性[n(%)]

續表3 TNBC組織中lncRNA CASC11相對表達水平與患者臨床病理參數間的相關性[n(%)]

注：與MCF-10A細胞比較，**P<0.01，***P<0.001，NS表示差異無統計學意義。

2.2lncRNA CASC11與TNBC患者的總體生存時間及無復發生存時間的相關性分析 通過生存分析發現，在TNM Ⅰ期(27例)、TNM Ⅱ期(59例)、TNM Ⅰ～Ⅳ期(132例)的TNBC患者中，lncRNA CASC11高表達患者的總體生存時間較lncRNA CASC11低表達的患者明顯縮短，差異有統計學意義(χ2分別為11.32、37.81、38.35，P<0.05)，lncRNA CASC11高表達患者的無復發生存時間較lncRNA CASC11低表達患者明顯縮短，差異有統計學意義(χ2分別為18.42、39.99、57.18，P<0.05)。而在TNM Ⅲ期(39例)中，lncRNA CASC11高表達TNBC患者總體生存率和無復發生存率與lncRNA CASC11低表達患者比較差異無統計學意義(χ2分別為0.400和0.683，P>0.05)，見圖2。多因素Cox回歸分析結果顯示，TNBC組織中lncRNA CASC11的表達水平是TNBC患者預后較差的獨立危險因素(P<0.05)。見表4。

注：a和e分別為TNM Ⅰ期(27例)總體生存曲線和無復發生存曲線；b和f分別為TNM Ⅱ期(59例)總體生存曲線和無復發生存曲線；c和g分別為TNM Ⅲ 期(39例)總體生存曲線和無復發生存曲線，d和h分別為TNM Ⅰ～Ⅳ期(132例)總體生存曲線和無復發生存曲線；TNM Ⅳ期例數太少，無法單獨分析；***表示P<0.001，ns表示差異無統計學意義(P>0.05)。

2.3lncRNA CASC11對TNBC細胞遷移和侵襲能力的影響 通過在MDA-MB-231細胞株中轉染3種si-CASC11用于敲減lncRNA CASC11的表達，qPCR檢測結果發現，轉染si-CASC11-3#后lncRNA CASC11的下調效果最明顯(P<0.05)，見圖3a，因此本實驗選擇si-CASC11-3#進行體外細胞功能實驗。通過Transwell實驗驗證發現，與空白對照組和陰性對照組相比，敲減lncRNA CASC11后MDA-MB-231細胞的遷移和侵襲能力明顯收到抑制(P<0.05)，見圖3b。

注：a表示si-CASC11的篩選；b表示轉染si-CASC11能夠抑制MDA-MB-231細胞的遷移和侵襲能力;si-NC表示對照干擾片段；與轉染si-NC的細胞比較，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

表4 TNBC患者預后影響因素的Cox回歸分析

2.4下調miR-676-3p能夠逆轉lncRNA CASC11沉默介導的TNBC細胞遷移和侵襲的抑制 Transwell實驗結果顯示，與空白對照組和陰性對照組相比，轉染si-CASC11能夠抑制MDA-MB-231細胞的遷移和侵襲能力。聯合轉染si-CASC11和miR-676-3p inhibitor后發現，與單獨轉染si-CASC11相比，聯合轉染組MDA-MB-231細胞的遷移和侵襲能力增強。結果表明，下調miR-676-3p能夠逆轉敲減lncRNA CASC11介導的TNBC細胞遷移和侵襲的抑制作用，見圖4。

注：si-NC表示對照干擾片段；與si-NC比較，***P<0.001。

2.5lncRNA CASC11在TNBC細胞中可能調控miR-676-3p表達 通過使用人類miRNA靶標預測工具Starbase2.0并結合TCGA數據庫，預測miR-676-3p可能是lncRNA CASC11的靶標，見圖5a。轉染si-CASC11干擾片段后，miR-676-3p表達水平明顯升高，見圖5b。此外，使用雙熒光素酶報告實驗進一步驗證lncRNA CASC11和miR-676-3p之間的是否存在物理學結合位點，通過構建與miR-676-3p具有結合位點的lncRNA CASC11野生型和突變型雙熒光素酶報告質粒，見圖5d。“microRNA與lncRNA結合驗證”結果發現，與陰性對照組相比，共轉染miR-676-3p mimics后能夠抑制lncRNA CASC11野生型表達載體的熒光素酶活性，但lncRNA CASC11突變型表達載體的熒光素酶活性沒有變化，見圖5c。

注：a為通過生物信息學數據庫對lncRNA CASC11和miR-676-3p的物理學結合位點進行預測；b為敲減lncRNA CASC11后miR-676-3p的表達水平變化；c為共轉染miR-676-3p mimics和lncRNA CASC11野生型或突變型雙熒光素酶報告質粒后熒光素酶活性變化；d為lncRNA CASC11野生型和突變型雙熒光素酶報告質粒的構建；與mimics NC比較，***P<0.001；WT為野生型；MUT為突變型。

3 討 論

如今，TNBC占所有乳腺癌的比例為15%～20%，與其他乳腺癌分子亞型相比，TNBC更易復發轉移，并且在明確診斷后總體生存率處于較低的水平[10]。因此，闡明TNBC發生、發展的分子機制并尋找潛在的治療靶點顯得尤為重要。越來越多的研究表明，lncRNA在腫瘤發生發展的過程中發揮著至關重要的作用，研究報道，lncRNA CASC11在前列腺癌、膀胱癌、惡性膠質瘤、肺癌、神經母細胞瘤等腫瘤中異常升高，通過內源競爭RNA(ceRNA)機制促進腫瘤的惡性生物學行為[11-15]，本研究發現，lncRNA CASC11在TNBC組織和細胞中的表達異常升高，表明lncRNA CASC11可能參與了TNBC的發生。此外，lncRNA CASC11的表達與TNBC脈管浸潤、陽性淋巴結數、淋巴結轉移、遠處轉移呈正相關，表明lncRNA CASC11促進TNBC侵襲及轉移，腫瘤發生轉移往往先浸潤基底膜，突破基底膜后通過脈管或者淋巴結轉移到周圍或遠處器官，一旦腫瘤細胞發生轉移對預后會產生極為不利的影響，體外侵襲和轉移實驗結果驗證了該推斷，同樣lncRNA CASC11與患者TNM分期以及復發密切相關，患者TNM分期高往往意味著腫瘤進展越快，腫瘤復發意味著以前對腫瘤療效很好的放射治療、化學治療及靶向治療方案變得沒有效果，惡性腫瘤細胞再次生長起來，患者預后往往不良。

生存分析結果發現，在TNM Ⅰ期、TNM Ⅱ期和TNM Ⅰ～Ⅳ期的TNBC患者中， lncRNA CASC11高表達的TNBC患者總體生存率和無復發生存率均低于lncRNA CASC11低表達患者，此外，多因素回歸分析結果表明，lncRNA CASC11的高表達是TNBC患者預后不良的獨立危險因素，提示lncRNA CASC11可能會成為TNBC患者潛在的預后標志物，綜合以上證據表明，lncRNA CASC11與TNBC的轉移、復發以及不良預后密切相關，在TNBC的發生、發展過程中起到了至關重要的作用。

有研究報道miR-676-3p在神經母細胞瘤中表達水平異常下調，并能通過ceRNA機制調控腫瘤的發生發展進程[16]。本實驗通過生物信息學數據庫發現lncRNA CASC11與miR-676-3p存在互補序列，本研究發現miR-676-3p在TNBC組織中表達水平同樣異常下調，在TNBC細胞中敲減lncRNA CASC11能夠促進miR-676-3p的表達，表明兩者之間可能存在某種調控關系，體外侵襲和遷移實驗結果表明下調miR-676-3p能夠逆轉lncRNA CASC11沉默介導的TNBC細胞遷移和侵襲的抑制作用，lncRNA CASC11可能通過調控miR-676-3p進而促進TNBC細胞的侵襲和遷移能力，雙熒光素酶報告實驗初步預測lncRNA CASC11和miR-676-3p可能存在物理學結合位點，但是需要進一步的確證實驗驗證。

綜上所述，本研究表明lncRNA CASC11與TNBC患者脈管浸潤、淋巴結轉移、遠處轉移、TNM分期、復發以及不良預后有關，可能發揮癌基因的功能。此外，體外細胞實驗進一步表明lncRNA CASC11可能通過調控miR-676-3p進而促進TNBC細胞的侵襲和轉移，因此，lncRNA CASC11可能會成為TNBC患者潛在的分子治療靶點以及預后標志物。