CD155表達(dá)水平對非小細(xì)胞肺癌PD1免疫療法反應(yīng)性的影響

肖龍敏，韓文健，吳 洪

恩施土家族苗族自治州民族醫(yī)院外三科，湖北恩施 445000

免疫檢查點抑制劑(ICIs)的使用已成為癌癥治療領(lǐng)域最有前途的方法之一[1-3]。在已確定的多種免疫調(diào)節(jié)劑中，程序性細(xì)胞死亡蛋白1(PD1)/程序性細(xì)胞死亡蛋白配體1(PDL1)軸導(dǎo)致慢性感染和腫瘤中T細(xì)胞免疫耗竭已被廣泛研究[4]。因此，針對PD1或PDL1的阻斷抗體已被開發(fā)并批準(zhǔn)用于治療各種晚期癌癥，包括非小細(xì)胞肺癌，使其成為最成功的ICI[5-6]。然而，進(jìn)一步的臨床應(yīng)用面臨廣泛的挑戰(zhàn)，例如一小部分受益人群、原發(fā)性和獲得性耐藥、缺乏預(yù)測和預(yù)后生物標(biāo)志物以及治療相關(guān)的不良反應(yīng)[7]。一種新的ICI靶標(biāo)是黏附分子CD155，它還充當(dāng)由腫瘤細(xì)胞和腫瘤相關(guān)骨髓細(xì)胞表達(dá)的免疫檢查點配體[8-9]。CD155在多種實體癌類型(包括非小細(xì)胞肺癌)的腫瘤細(xì)胞上被上調(diào)，并且已被證明有利于腫瘤生長和腫瘤存活[10]。目前尚不清楚非小細(xì)胞肺癌CD155對免疫浸潤環(huán)境的影響程度，或者CD155在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)是否會影響對PD1免疫療法的反應(yīng)性?；诖?，本研究旨在探討CD155表達(dá)水平對非小細(xì)胞肺癌PD1免疫療法反應(yīng)性的影響。

1 資料與方法

1.1一般資料 納入本院2014-2018年收治的非小細(xì)胞肺癌患者111例，其中男69例，女42例。診斷標(biāo)準(zhǔn)：根據(jù)《中國表皮生長因子受體基因敏感突變和間變淋巴瘤激酶融合基因陽性非小細(xì)胞肺癌診斷治療指南(2014版)》[11]的診斷標(biāo)準(zhǔn)診斷為非小細(xì)胞肺癌。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)患者同意且積極配合PD1免疫療法者；(2)臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)患有其他腫瘤者；(3)標(biāo)本采集前接受任何治療者；(3)患有精神疾病者；(4)合并高血壓、心臟病者。所有患者均由本院病理科確診并簽署知情同意書。所有患者標(biāo)本采集前未接受任何治療，標(biāo)本采集后被快速冷凍在液氮中，保存在-80 ℃。通過電話、門診、或查閱病例途徑開展隨訪，中位隨訪時間達(dá)28個月。對所有入組患者均進(jìn)行了有效隨訪，隨訪時間結(jié)束后仍未出現(xiàn)疾病進(jìn)展的患者將按照截止時間記錄。

1.2試劑 CD155、PDL1、CD8、PD1抗體購自Abcam公司。DAB Chromogen Kit購自北京華夏遠(yuǎn)洋科技有限公司。

1.3方法

1.3.1治療方法和療效評價 使用2 mg/kg的pembrolizumab進(jìn)行PD1免疫療法。21 d為一個治療周期，2個周期后評估患者的治療效果。將治療前4周內(nèi)所有入組患者的影像學(xué)數(shù)據(jù)作為基線，并pembrolizumab治療后每2個周期檢查一次CT或MRI，以評估療效。通過復(fù)查胸腹部CT、骨掃描、顱腦MⅪ等檢查，與治療前影像進(jìn)行對比，根據(jù)iRECIST的患者的療效展開評估，存在完全緩解(CR)、部分緩解(PR)、疾病穩(wěn)定(SD)與疾病進(jìn)展(PD)之分。無進(jìn)展生存期(PFS)定義為入組的患者開始使用PD1免疫療法至腫瘤出現(xiàn)(任一方面)進(jìn)展或(由任一原因)死亡之間的時間，也可為沒有出現(xiàn)進(jìn)展的隨訪截止時間。

1.3.2免疫組織化學(xué)染色(IHC) 使用CD155、 PDL1抗體和 Chromogen Kit觀察染色，并用稀釋的蘇木精復(fù)染。對兩個具有代表性的高倍視野進(jìn)行IHC評估，評估陽性腫瘤細(xì)胞的百分比和IHC信號的最大強(qiáng)度(0+到3+)。CD155 評分使用盲法H評分法，分類如下：0+(無陽性細(xì)胞)、1+(0～99個陽性細(xì)胞)、2+(100～199個陽性細(xì)胞)或3+(200～300個陽性細(xì)胞)。PDL1陰性定義為與用陰性IgG抗體染色相同的組織,PDL1陽性定義為PDL1抗體染色為棕色的組織。

1.3.3多重免疫組織熒光分析 非小細(xì)胞肺癌組織標(biāo)本在載玻片上以 3 mm切片，并用PD1抗體、CD8抗體、相應(yīng)熒光二抗、DAPI進(jìn)行染色。載玻片用 DAPI 復(fù)染并蓋上蓋玻片。使用 InForm 分析軟件對多光譜圖像進(jìn)行光譜分離，然后進(jìn)行組織和細(xì)胞分割。對來自 InForm 的合并數(shù)據(jù)文件進(jìn)行預(yù)處理，并使用 Spotfire 圖像映射工具為每個標(biāo)記(PD1+、CD8+)設(shè)置熒光閾值，然后使用Microsoft Excel中的表格進(jìn)行分段細(xì)胞計數(shù)。

1.4統(tǒng)計學(xué)處理 本研究使用PRISM軟件進(jìn)行的統(tǒng)計學(xué)分析。使用χ2檢驗分析CF155不同分類與治療反應(yīng)的相關(guān)性。使用Spearman相關(guān)分析通過多重免疫熒光進(jìn)行檢測的CD155表達(dá)水平與免疫細(xì)胞計數(shù)的相關(guān)性。P<0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1CD155限制了非小細(xì)胞肺癌患者對抗PD1聯(lián)合治療的反應(yīng) 使用IHC 對接受 PD1免疫療法的非小細(xì)胞肺癌患者治療前組織標(biāo)本中的CD155蛋白水平進(jìn)行了表征。根據(jù)IHC染色水平，17.12%(19/111)的非小細(xì)胞肺癌組織標(biāo)本為 CD155 陰性(評分 0+)，27.03% (30/111) 分類為評分1+，25.23% (28/111) 評分為2+，30.63% (34/111) 得分為3+，見圖1A。與 CD155 低表達(dá)的腫瘤患者相比 (評分為0+、1+)，治療前為CD155 高表達(dá)的患者(評分為2+、3+)的 PD1免疫療法治療后表現(xiàn)出較高的SD或PD率，而CR或PR率較低，見圖1B。此外，觀察到PD1免疫療法治療后6 個月內(nèi)的疾病進(jìn)展與的非小細(xì)胞肺癌患者的高 CD155腫瘤水平之間存在明顯關(guān)聯(lián)，見圖1C。使用PFS 和Kaplan-Meier 和 Cox 比例風(fēng)險模型進(jìn)一步評估 CD155 與治療反應(yīng)之間的關(guān)聯(lián)。與 CD155低表達(dá)腫瘤相比，CD155高表達(dá)腫瘤患者的中位 PFS較短(P<0.05)，見圖1D。

注：A為不同評分的CD155免疫染色評分；B為不同CD155評分患者的治療后表現(xiàn)；C為CD155評分與治療反應(yīng)性的關(guān)系；D為CD155表達(dá)水平與存活概率的關(guān)系。

2.2CD155高表達(dá)/PDL1陰性非小細(xì)胞肺癌對抗PD1治療的反應(yīng)很差 接下來比較了腫瘤CD155與PDL1陰性和PDL1陽性非小細(xì)胞肺癌的PD1免疫治療結(jié)果。腫瘤為PDL1陰性和CD155高表達(dá)的患者的 RECIST反應(yīng)較差，見圖2A。接受PD1免疫療法治療且腫瘤為PDL1陰性和 CD155高表達(dá)的患者的6個月PFS率也更差(P<0.05)，中位PFS更短(P<0.05)。相比之下，CD155低表達(dá)的PDL1陽性腫瘤患者具有更好的PFS結(jié)果，見圖2。

注：A為不同CD155和PDL1表達(dá)情況患者治療后的表現(xiàn)；B為不同CD155和PDL1表達(dá)情況患者對于治療的反應(yīng)性；C為不同CD155和PDL1表達(dá)情況患者對患者存活概率的影響；CD155high表示CD155高表達(dá)；CD155low表示CD155低表達(dá)；PDL1negative表示PDL1陰性表達(dá)；PDL1positive表示PDL1陽性表達(dá)。

2.3CD155與腫瘤浸潤性CD8+T細(xì)胞上PD1表達(dá)增加相關(guān) 使用多重免疫組織熒光來檢查關(guān)鍵抑制性受體PD1在CD8+T 細(xì)胞上的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)CD8+T細(xì)胞的數(shù)量在CD155不同表達(dá)水平非小細(xì)胞肺癌組織中無顯著差異(P>0.05)，見圖3A。相反，PD1+CD8+T 細(xì)胞的數(shù)量與增加的CD155評分顯著相關(guān)(P<0.05)，見圖3B。

圖3 CD155與腫瘤浸潤性CD8+ T細(xì)胞上PD1表達(dá)增加相關(guān)

3 討 論

針對細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞抗原-4(CTLA-4)、PD1或PDL1的ICI藥物的開發(fā)在免疫腫瘤學(xué)領(lǐng)域獲得了巨大的興趣。雖然CTLA-4是1987年發(fā)現(xiàn)的第一個免疫檢查點分子，但PD1/PDL1軸在CD8+T細(xì)胞衰竭中的作用已被廣泛研究[12]。免疫腫瘤學(xué)家將這一概念擴(kuò)展到抗腫瘤免疫，使PD1/PDL1成為藥物開發(fā)最有希望的靶點[13]。本研究發(fā)現(xiàn)在非小細(xì)胞肺癌中，CD155的表達(dá)表達(dá)水平與PD1免疫療法療效存在相關(guān)性。與 CD155低表達(dá)腫瘤相比，CD155高表達(dá)腫瘤患者的中位 PFS較短(P<0.05)。腫瘤為PDL1陰性和 CD155高表達(dá)的患者的RECIST 反應(yīng)較差。

與CD155低表達(dá)的腫瘤患者相比 (評分為0+、1+)，治療前為CD155 高表達(dá)的患者(評分為2+、3+)的 PD1免疫療法治療后表現(xiàn)出較高的SD或PD率，而CR或PR率較低。CD155介導(dǎo)NK細(xì)胞黏附，觸發(fā)NK細(xì)胞效應(yīng)因子功能[14]。結(jié)合兩種不同的NK細(xì)胞受體:CD96和CD226。這些相互作用在細(xì)胞-細(xì)胞接觸部位積累，導(dǎo)致NK細(xì)胞和靶細(xì)胞之間形成成熟的免疫突觸。這會引起溶解顆粒和IFN-γ的黏附和分泌，激活NK細(xì)胞的細(xì)胞毒性。這種轉(zhuǎn)移在一些表達(dá)大量CD155的腫瘤細(xì)胞中更為重要，并可能觸發(fā)殺傷型NK細(xì)胞的激活，為腫瘤提供一種免疫逃避機(jī)制。并且在介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞侵襲和遷移中發(fā)揮作用。

CD155表達(dá)水平影響PD1免疫療法的療效，這表明靶向CD155通路的治療可能對非小細(xì)胞肺癌患者有益。腫瘤CD155信號通過免疫檢查點受體CD96和TIGIT來促進(jìn)CD8+T細(xì)胞抑制[15]。本研究發(fā)現(xiàn)PD1+CD8+T 細(xì)胞的數(shù)量與增加的CD155評分顯著相關(guān)，并且這種增加與 非小細(xì)胞肺癌患者的早期進(jìn)展時間相關(guān)。鑒于這些數(shù)據(jù)，共同靶向CD155 通路聯(lián)合PD1免疫療法治療可能會提高對非小細(xì)胞肺癌患者的反應(yīng)性。

綜上所述，CD155的表達(dá)水平與非小細(xì)胞肺癌組織中免疫浸潤的PD1+CD8+T細(xì)胞數(shù)量具有相關(guān)性。此外，靶向CD155途徑的治療可能會改變非小細(xì)胞肺癌患者對PD1免疫療法的反應(yīng)。