人參皂苷通過上調糖皮質激素受體表達對AIH 小鼠肝臟的保護作用

曹夢醒，師 哲，李 勇*

上海中醫藥大學附屬市中醫醫院，上海 200071

自身免疫性肝炎（autoimmune hepatitis, AIH）是一種自身免疫反應介導的進行性肝臟炎癥，其診斷以谷丙轉氨酶（alanine aminotransferase, ALT）、谷草轉氨酶（aspartate aminotransferase, AST）、免疫球蛋白IgG 以及自身抗體（ANA、SMA、抗LKM1 和抗SLA）水平升高為主[1]。 AIH 常隱匿起病而無特異性癥狀，常表現為嗜睡、乏力、右上腹疼痛等，且近30%患者首診時已存在肝硬化表現[2]。 雖然AIH 的發病機制尚不明確，但與藥物接觸、病毒性肝炎史以及遺傳易感個體等因素高度相關[3]，是一種T 細胞產生針對肝臟自身抗原的免疫反應[4]。 臨床一線用藥以大劑量地塞米松和（或）聯合硫唑嘌呤抑制T細胞免疫力為主，但這種療法常因感染、消化性潰瘍等嚴重不良反應而難以為繼。 近些年有使用利妥昔單抗或英夫利昔單抗等生物制劑治療難治性AIH的報道，但仍存在感染、肝毒性等并發癥而加大用藥風險[5]。 因此，如何選擇治療方案以提高免疫耐受性的同時減輕副作用將成為治療AIH 的關鍵。

miRNA-223 是最早發現的與骨髓系細胞發育密切相關的miRNA 之一，其在骨髓細胞中高度表達，通過外泌體或細胞外囊泡轉移的方式調節骨髓祖細胞分化，并調節免疫微環境[6-9]。 miRNA-223 在粒細胞系的分化和成熟過程中增加，其高水平的表達又能進一步促進骨髓祖細胞系向粒細胞的分化和成熟[6，10-11]。 此外，miRNA-223 對粒細胞祖細胞（即MDSC）分化與活化具有抑制作用，對其敲除可促進粒細胞祖細胞數量的擴增。

人參皂苷（ginsenoside, GSS）是人參最主要的活性成分，與糖皮質激素的化學結構以及生物學效應相似[12]。 有大量研究證明，GSS 可通過GR 途徑抑制T 細胞的免疫活性，顯著減輕由T 細胞過度活化引起的局部炎性浸潤與組織損傷[13]。 阻斷GR 后，由GR介導生效的途徑不會完全削弱，證明在GR 途徑外還存在其他途徑介導了GSS 對免疫的抑制[14]。GSS 對糖皮質激素（glucocorticoids, GC）具有一定的增效減毒作用。 在長期應用GC 導致GR 表達下降時，GSS的應用除增強GC 的免疫抑制能力外還一定程度逆轉了GC 引起的GR 轉錄與翻譯下調[15-18]。 為進一步探究人參皂苷在AIH 中是否有GC 相似的免疫抑制效應，本文使用S-100 誘導的AIH 小鼠模型，觀察GSS 對AIH 的調節作用，為AIH 的治療提供替代藥物的新選擇。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

C57BL/6 雄性小鼠購于上海斯萊克實驗動物有限責任公司，許可證號碼：SCXK（滬）2017-0005。 小鼠飼養于上海市中醫醫院動物房SPF 級小鼠飼養室，飼養環境為恒溫24～27 ℃，濕度50%～80%，飲水與飼料經輻照、高壓滅菌不限量供應。本動物實驗已通過上海市中醫醫院實驗中心動物實驗倫理與福利委員會審核，倫理號：2021019。

1.2 藥物與試劑

人參皂苷（上海源葉生物科技有限公司，批號：B30M11C114347）；弗氏完全佐劑（美國Sigma-Aldrich公司，批號：MFCD00131105）；（強）RIPA 裂解液（批號：20101ES60）、TRIzol（批號：19201ES60）、Universal Blue qPCR SYBR Green Master Mix（批號：11184ES03）、脫脂奶粉（批號：36120ES60）、Tween-20（批號：60305ES76）、PMSF（批號：20104ES03）、十二烷基硫酸鈉（批號：20106ES76）均購自翌圣生物科技（上海）有限公司；BCA 蛋白濃度測定試劑盒（江蘇碧云天生物有限公司，批號：P0012S）；超敏ECL 化學發光液（上海天能科技有限公司，批號：180-5001）；HE試劑盒（生工生物工程（上海）有限公司，批號：E607318-0200）；MEF2C（批號：5030S）、iNOS（批號：13120S）、β-Actin（13E5）（批號：4970S）均購自美國Cell Signaling Technology 公司。

2 實驗方法

2.1 動物造模、分組及干預方法

隨機選取C57BL/6 同源小鼠6 只作為空白組；參照LOHSE 等[19]描述的實驗性AIH 小鼠模型制備方法進行造模。 造模方法如下：選取C57BL/6 同源小鼠應用抗原S-100 與弗氏佐劑完全研磨乳化后腹腔注射，0.2 mL/20 g，每周1 次，第7 天再次注射加強免疫炎癥反應，第14 天即造模完成。 造模成功的模型小鼠隨機分為模型組、人參皂苷(AIH+GSS)組與陽性對照地塞米松(AIH+DEX)組，每組6 只。造模過程中空白組小鼠腹腔注射PBS，0.2 mL/20 g，每周1 次，共2 次。 在第14 天造模完成后，空白組、模型組予無菌蒸餾水灌胃200 μL/20 g，AIH+GSS組予人參皂苷50 mg/kg 等容量灌胃，AIH+DEX 組予地塞米松1 mg/kg、200 μL/20 g 腹腔注射。每天1 次，共14 d。

2.2 外泌體分離

摘取小鼠眼球取血，向血液中加入EDTA-2K抗凝，離心半徑8.7 cm，3000 r/min 4 ℃15 min 離心，收集上清液于液氮中凍存備用；將血漿用PBS以1∶2 進行稀釋，以離心半徑8.7 cm，2000 r/min 4 ℃10 min 離心后取上清液至新離心管，并加入樣本1/2體積的沉淀試劑，渦旋震蕩混勻后4 ℃60 min 孵育；孵育結束后以離心半徑8.7 cm，10 000 r/min 15 min離心，棄盡上清液；以預冷PBS 清洗管壁及管底白色沉淀后，以原始血漿容量用PBS 進行吹打復溶，富集的外泌體。

2.3 MDSC 細胞、Treg 細胞、Th17 細胞染色

收集部分細胞至流式管中計數，調整至1×106個/管，加入PBS 離心，棄上清液；加100 μL PBS 重懸，分別加入流式抗體CD11b、Gr-1、CD4 和CD25，避光孵育；加入PBS 1 mL/管，離心棄上清液。檢測MDSC 細胞：取250 μL PBS 重懸細胞后進行流式檢測。 檢測Treg 細胞：加PBS 重懸細胞，每管加入1 mL固定/破膜緩沖液，混勻后避光孵育，離心棄上清液。于100 μL 破膜液中重懸細胞，加入抗體Foxp3，避光孵育，離心棄上清液。 取破膜液重懸細胞后進行流式檢測。 檢測Th17 細胞：以完全培養基重懸細胞，按說明書加入500×eBioscience Cell Stimulation Cocktail，37 ℃培養箱培養6 h；將細胞收集至流式管中，加入PBS 1 mL/管，離心棄上清；加PBS 重懸，加入流式抗體IL-17A，避光孵育；加入PBS，離心棄上清，此步驟重復2 次；加PBS 重懸細胞后進行流式檢測。

2.4 Western blot 分析

使用RIPA 裂解液提取肝臟組織蛋白后，BCA蛋白試劑盒檢測蛋白含量。 樣品蛋白中加入適量5×SDS loading buffer，在100 ℃的金屬浴鍋加熱5 min。 使用SDS-PAGE 凝膠進行電泳分離膠分離蛋白，并轉移至0.45 μm 孔徑的PVDF 膜。 條帶浸沒在封閉液中室溫慢搖3 h，封閉完成后，使用TBST 配制適合濃度的一抗，將目標條帶浸沒于一抗中，4 ℃孵育過夜，用TBST 漂洗3 次。 使用TBST 配制適合濃度的HRP 標記二抗，將目標條帶浸于二抗中，室溫慢搖孵育1 h。 用TBST 漂洗后，ECL 顯色液覆蓋全膜。 最后應用Bio-Rad ChemiDocTM XRS+系統與Image Lab 軟件曝光。

2.5 染料法熒光定量PCR

提取肝臟組織總RNA，測各樣本RNA 濃度及純度。 在每個離心管中加入1 μg RNA 樣本，5×gDNA wiper Mix 3 μL，RNase freeH2O 補足至15 μL，42 ℃水浴加熱2 min；在上述15 μL 體系中加入5 μL 的4×Hifair R○ⅢSuperMix plus。反應條件：25 ℃，5 min，55 ℃，15 min，85 ℃，5 min 得到的cDNA-20 ℃保存備用。 在離心管中加入Universal Blue qPCR SYBR Green Master Mix 10 μL，加正反向引物各0.4 μL(引物見表1)， 加入cDNA 模板2 μL，ddH2O 補足至20 μL，混勻。按照說明書設置反應條件，實施上機檢測，用相對表達量=2-△△Ct公式計算各個組的表達情況。

表1 引物序列

2.6 小鼠肝功能與肝組織病理學檢測

使用ALT/GPT 檢測試劑盒檢測小鼠血清ALT水平，AST/GOT 檢測試劑盒檢測AST 水平。用4%的多聚甲醛將肝組織固定24 h 后，按照相應的步驟進行脫水至蠟并包埋，切片5 μm，制白片后烤干備用，染色前將白片按相應順序脫蠟至水使用。 采用HE 染色與Masson 染色，染色后使用顯微鏡觀察小鼠肝組織的變化。

2.7 統計方法

流式數據使用CytExpert 分析結果，PCR 結果使用相對定量法計算Ct 值，將結果導入GraphPad Prism 8 繪制統計圖，并使用ANOVA 進行多樣本配對分析，均采用雙側檢驗。 Western blot 結果導入ImageJ 軟件測算灰度值并以GraphPad Prism 8 統計分析繪圖。 在α=0.05 水準上，當P＜0.05 為差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 人參皂苷對AIH 小鼠肝功能的影響

模型組小鼠血清ALT、AST 水平較空白組均顯著升高（P＜0.001）；AIH＋DEX 組小鼠血清ALT、AST濃度較模型組顯著降低（P＜0.001），與空白組無明顯差異(P＞0.05）；AIH＋GSS 組ALT 與AIH＋DEX 組無明顯差異（P＞0.05），AST 顯著低于模型組（P＜0.001），略高于DEX 組（P＜0.01）。 詳見表2。

表2 人參皂苷對AIH 小鼠轉氨酶的影響（U/L，±s，n=6）

表2 人參皂苷對AIH 小鼠轉氨酶的影響（U/L，±s，n=6）

注：與空白組比較，△△△P＜0.001；與模型組比較，***P＜0.001；與AIH＋DEX 組比較，##P＜0.01。

組別轉氨酶活力ALT AST空白組模型組AIH＋DEX 組AIH＋GSS 組F 值P 值12.18±0.64 14.72±0.50△△△12.22±0.53***12.30±0.56***20.83＜0.0001 23.76±3.26 36.71±1.04△△△21.30±1.29***27.33±3.22***##46.14＜0.0001

在對小鼠肝臟進行HE、Masson 染色檢查肝臟損傷情況中發現，對照組小鼠肝細胞與肝小葉形態正常，界面區無炎細胞浸潤，無膠原纖維增生；模型組肝界面區炎性細胞浸潤嚴重，肝細胞壞死嚴重，小葉形態異常，有明顯膠原纖維增生；AIH＋DEX 組與AIH＋GSS 組界面區炎細胞浸潤明顯減少，小葉形態較正常，膠原纖維增生較少。 詳見圖1。

圖1 人參皂苷對AIH 小鼠肝臟病理的影響

3.2 人參皂苷對免疫微環境的調節功能

模型組小鼠MDSC 細胞數量較空白組顯著下降（P＜0.001），Treg 細胞數量較空白組顯著下降（P＜0.01），Th17 細胞數量較空白組顯著上升，差異具有統計學意義（P＜0.001）；經AIH＋DEX 干預后，MDSC、Treg 細胞數量高于模型組，Th17 細胞數量下降，差異具有統計學意義（P＜0.01）；AIH＋GSS 組MDSC 細胞數量高于模型組（P＜0.001），Treg 細胞數量高于模型組（P＜0.05），Th17 細胞數量低于模型組（P＜0.05）。 詳見圖2。

圖2 人參皂苷對AIH 小鼠免疫細胞的影響

3.3 人參皂苷對miRNA-223 表達的影響

模型組miRNA-233 表達顯著高于空白組（P＜0.001）；AIH＋GSS 組與AIH＋DEX 組miRNA-223 的表達水平均顯著低于模型組（P＜0.001），而兩組間差異無統計學意義（P＞0.05）。 詳見表3。

表3 人參皂苷對miRNA-223 水平的影響（±s，n=6）

表3 人參皂苷對miRNA-223 水平的影響（±s，n=6）

注：與空白組比較，△△△P＜0.001；與模型組比較，***P＜0.001。

miRNA-223 1.01±0.01 2.08±0.33△△△0.67±0.04***0.74±0.05***88.66＜0.0001組別空白組模型組AIH＋DEX 組AIH＋GSS 組F 值P 值

3.4 人參皂苷對MDSC 相關蛋白及其對GR 的影響

模型組Arg-1、iNOS 轉錄水平較空白組顯著降低（P＜0.001）；AIH＋DEX 組與AIH＋GSS 組Arg-1、iNOS 轉錄水平均顯著高于模型組（P＜0.001），其中，AIH＋GSS 組Arg-1、iNOS 轉錄水平略高于AIH＋DEX組（P＜0.01）。 詳見表4。

表4 人參皂苷對MDSC 功能蛋白的影響（±s，n=6）

表4 人參皂苷對MDSC 功能蛋白的影響（±s，n=6）

注：與空白組比較，△△△P＜0.001；與模型組比較，***P＜0.001；與AIH＋DEX 組比較，##P＜0.01。

組別 Arg-1 mRNA iNOS mRNA空白組模型組AIH＋DEX 組AIH＋GSS 組F 值P 值1.00±0.00 0.40±0.13△△△1.30±0.25***1.78±0.14***##80.04＜0.0001 1.00±0.00 0.44±0.04△△△1.53±0.10***2.25±0.38***##90.5＜0.0001

模型組小鼠iNOS、Arg-1、MEF2C 與GR 蛋白表達水平均較空白組顯著下降(P＜0.001)，而AIH＋DEX或AIH＋GSS 干預后表達水平均有明顯上升(P＜0.001)。詳見表5 和圖3。

圖3 人參皂苷對相關蛋白表達的影響

表5 人參皂苷對相關蛋白表達的影響（灰度值，±s，n=3）

表5 人參皂苷對相關蛋白表達的影響（灰度值，±s，n=3）

注：與空白組比較，△△△P＜0.001；與模型組比較，***P＜0.001，**P＜0.01。

組別 iNOS GR MEF2C Arg-1空白組模型組AIH＋DEX 組AIH＋GSS 組F 值P 值1.00±0.03 0.47±0.01△△△1.28±0.11***0.98±0.04***93.94＜0.0001 1.00±0.12 0.52±0.06△△△0.96±0.06***0.90±0.08**20.97 0.0004 1.00±0.04 0.35±0.02△△△0.70±0.03***0.70±0.02***257.7＜0.0001 1.00±0.02 0.51±0.01△△△0.98±0.05***0.83±0.02***183.8＜0.0001

4 討論

AIH 是一種自身免疫反應介導的界面型肝炎，因Th17 為首的輔助性T 細胞受到異常激活并不斷損傷肝細胞所致。有大量研究證實，MDSC 細胞擁有對T 細胞較強的抑制能力，可以很好地減輕因輔助性T 細胞過度活化對機體的損傷，而與骨髓細胞發育高度相關的miRNA-223 對MDSC 的增殖起決定性作用[6，10-11，26-27]。 系統性自身免疫性疾病中抗原呈遞細胞將自身抗原肽呈遞并激活初始CD4＋T 輔助(Th0)細胞，Th0 細胞迅速活化為Th1、Th2、Th17細胞并大量釋放促炎細胞因子并誘導了機體正常組織炎性損傷，這也是AIH 的發病機制之一[20-21]。 在此過程中，標記為CD4＋CD25＋FOXP3＋Treg 細胞的分化受損常被認為是自身免疫系統疾病發生的關鍵[22]。在AIH 患者外周血中Treg 細胞功能受損，Foxp3 表達明顯降低[23]。 MDSC 細胞擁有抑制T 細胞增殖和誘導細胞毒性T 淋巴細胞活性的能力[24-25]。 并且MDSC細胞通過特異性高表達Arg-1、iNOS 酶分別產生尿素、L-鳥氨酸和NO 來抑制T 細胞活性[26-27]。 肌細胞增強因子2 家族蛋白(myocyte enhancer factor-2,MEF2)作為控制基因表達與表觀遺傳修飾的轉錄因子，其家族亞型在不同組織中的表達水平表現出一定的異質性[28]。 其中，MEF2C 亞型在骨髓細胞中特異性表達并廣泛參與了骨髓祖細胞的增殖、分化與成熟，對免疫系統調節有至關重要的作用[6，28-29]。 在一項對骨髓細胞分化及粒細胞功能調節的研究中發現，MEF2C 是潛在的對MDSC 細胞分化增殖調控的靶點[6]。

在本課題組前期對臨床AIH 患者的證候研究中發現，患者求診時常以脾虛生濕、濕郁化熱之面色萎黃、乏力倦怠、舌苔黃厚膩有齒痕等表現為主，土壅木郁化熱而又見脅肋悶痛不適等，又或發黃疸等癥。 AIH 的病因病機可歸納為先天稟賦不足，或勞傷脾胃，乃至脾胃運化失司，水谷生濕化熱，蘊結成毒；中焦受氣取汁，變化而赤，是謂血，脾虛令中焦氣機失運，則氣血生化不足，又肝體陰而用陽，若肝失陰血滋養則氣不涵養而化火灼津，反傷于肝而成AIH。 其中，肝郁脾虛，氣滯、濕熱與邪毒令本病虛實夾雜，纏綿難愈。總結出本病之病位在肝，而根本在乎脾與腎，以脾腎虛為本，濕熱瘀邪為標。 因此，以人參為核心立方，輔以疏肝祛邪，養護中土，健運脾胃，以行散中焦濕阻，肝氣無濕阻則與脾氣升降運行，周身大氣一轉，正氣充盛則邪氣散而AIH 得愈。

人參大補肺脾腎元氣，能充養正氣而祛邪外出，而人參皂苷是其中發揮補益元氣最主要的藥效成分，目前已發現的皂苷類單體已多達30 余種[30]。 目前已有較多關于人參皂苷扶正祛邪的功效在免疫學方面的研究，如人參皂苷Rg3 可呈劑量依賴性激活IL-12 途徑誘導樹突狀細胞的成熟與下調CD4+T 細胞[31-32]，Rh2 可 通 過 增 強CD4+、CD8+T 細 胞 活 性 并誘導T 細胞向腫瘤細胞周圍浸潤[33]，Rg3 可通過激活巨噬細胞吞噬活性，激活CD4+T 細胞活性，促進IFN-γ、TNF-β、IL-2 等細胞因子增強機體免疫功能[34-35]等。 人參皂苷不同單體在不同的疾病中常可表現出不同的免疫調節能力[36]，總體而言這種對免疫雙向調節的能力都可歸納為中醫理論的扶正祛邪。正所謂“正氣內存，邪不可干”，于宏觀而言，人參對機體的調補之功，乃補氣生津，安神益智；于微觀言，這種補攝之能不再局限于傳統的“補”，而在于“陰平陽秘，精神乃治”；免疫過強，則“陽強不能密，陰氣乃絕”，人參有選擇性地降低過高的免疫水平，提高過低的免疫水平，使機體免疫處于健康平和的狀態，則陰陽平和，相互協調，其人氣實而難生AIH。

有研究表明，人參皂苷對機體的調節活性與GC相似，大多是通過GR 實現的[37]，這或與人參皂苷擁有與GC 相似的甾體樣化學結構有關[12]。自身免疫性疾病患者臨床一線用藥以地塞米松、潑尼松龍等GC為主。 有中醫學者認為，糖皮質激素之于人體，有補火助陽之功，少用可“少火生氣”，溫煦臟腑，運行氣血，補元陽而散陰寒；峻用、久用則“壯火食氣”，煎灼津液，耗傷精髓[38-39]。 長期GC 用藥除產生一系列嚴重不良反應外，還會降低GR 表達與活性，最終導致GC 耐受[40-41]。 這也與GC 的“少火生氣，壯火食氣”相似。 但研究指出，人參皂苷可通過上調GR 表達水平、增強GR 與GC 的結合活力、輔助GR 對下游通路的激活效應等方式減輕由GC 帶來的不良反應，并對GC 增效減毒[30]。 但目前尚未有研究表明人參皂苷也通過激活GR，對AIH 有相同的免疫調節作用。 因此，我們設立地塞米松為陽性對照，觀察人參皂苷對AIH 小鼠的影響。 實驗結果表明，人參皂苷可通過上調GR 的表達，增強Arg-1、iNOS 的轉錄與表達，促進MDSC 與Treg 的表達，抑制Th17 細胞的數量，調整肝臟的免疫微環境。 這種人參皂苷對免疫細胞的調節與糖皮質激素相似，均可調節小鼠免疫微環境，緩解AIH 肝臟中T 效應細胞帶來的肝臟損傷。 同時，在應用人參皂苷或地塞米松后MEF2C的表達量均有所提升。 由此推測，人參皂苷對MDSC的激活作用或與其對MEF2C 的激活有關。 此外，在對外周血外泌體的miRNA 檢測中，本研究表明人參皂苷與地塞米松均對miRNA-223 表現出良好的抑制作用。 實驗結果表明人參皂苷對AIH 小鼠的保護作用或通過對miRNA-223 的抑制與對GR 與MEF2C 的激活實現，據此實現對MDSC 的擴增與對肝臟免疫微環境的調節。

雖然在我們的實驗中人參皂苷對AIH 中肝臟的保護作用略低于AIH+DEX，且應用劑量遠大于后者，但鑒于人參皂苷在一定劑量的應用尚未有嚴重不良反應報道，對比GC 長期、大劑量應用帶來的嚴重不良反應，人參皂苷或能成為GC 之后新的替代選擇。