益氣活血自擬方對冠心病氣虛血瘀證大鼠心功能的影響

荊曉朔，汪順偉，歐 穎，張少輝，李 靜，李 亮*

1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)診斷學(xué)湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410208；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)心肺病證辨證與藥膳食療重點研究室，湖南 長沙 410208

心血管疾病嚴(yán)重威脅人類健康，流行病學(xué)調(diào)查顯示，心血管疾病死亡率占全球總死亡率的1/3[1]，其中，冠心病最為常見[2]。 冠心病是由于冠狀動脈粥樣硬化，使管腔狹窄或阻塞，或冠狀動脈痙攣導(dǎo)致心肌缺血缺氧而引起的心臟病[3]。 冠心病歸于中醫(yī)學(xué)“胸痹”“心悸”等范疇，主要病機(jī)為心脈痹阻。氣虛血瘀證是冠心病的核心證候，并貫穿疾病發(fā)生發(fā)展的始終[4]。 益氣活血自擬方（YQHXF）是本課題組前期研究糖尿病性心肌病氣陰兩虛、 痰瘀互結(jié)證的加味生脈補(bǔ)心丹[5-6]進(jìn)一步完善的處方，臨床治療冠心病氣虛血瘀證療效顯著。

病證結(jié)合動物模型的制備能夠深入了解疾病證候且研究有效中藥作用機(jī)制，是實現(xiàn)中醫(yī)藥現(xiàn)代化發(fā)展的關(guān)鍵[7-8]。 為深入研究臨床冠心病氣虛血瘀證的治療方法，本研究采用“結(jié)扎冠狀動脈左前降支合并游泳力竭”的方法制備冠心病氣虛血瘀證大鼠模型，通過觀察YQHXF 對模型大鼠一般狀態(tài)、體質(zhì)量的改變情況，以及對大鼠心電圖、血液流變學(xué)指標(biāo)、心功能及病理形態(tài)學(xué)的影響，從而為YQHXF 對冠心病氣虛血瘀證患者的臨床治療提供可靠的實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選 用24 只SPF 級 健 康 雄 性SD 大 鼠，6～8 周齡，體質(zhì)量（220±20） g，購于湖南斯萊克景達(dá)實驗動物有限公司，使用許可證號：SYXK（湘）2019-0009。飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心，溫度22～26 ℃，相對濕度40%～70%，每籠3 只。 適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d 后進(jìn)行造模及灌胃干預(yù)。 每日定時定量喂食，自由飲水。 本研究經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物倫理委員會審批通過，倫理編號：LLBH-202111200002。

1.2 藥物及主要試劑

YQHXF 由黃芪20 g、丹參15 g、太子參10 g、水蛭6 g、紅花8 g、當(dāng)歸12 g、桂枝10 g、桃仁8 g、炙甘草6 g 組成，中藥飲片經(jīng)現(xiàn)代工藝制成中藥顆粒劑，由湖南省中醫(yī)藥研究院提供。 單硝酸異山梨酯片（魯南貝特制藥有限公司，批號：07201217）；注射用青霉素鈉（華北制藥股份有限公司，批號：F1052112）；異氟烷（天津瑞普生物藥業(yè)有限公司，批號：20210804）；鹽酸利多卡因注射液（山東華魯制藥有限公司，批號：XB21J08）；生理鹽水（四川科倫藥業(yè)股份有限公司，批號：C22011704）；TM-100型醫(yī)用超聲耦合劑（天津津亞科技發(fā)展有限公司，批號：20190041）；4%多聚甲醛通用型組織固定液（北京蘭杰柯科技有限公司，批號：71041800)；DAB顯色試劑盒（批號：ZLI-9018）、PBS 緩沖液粉末（批號：ZLI-9062）、通用二部法檢測試劑盒（批號：PV-9000）均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；Masson 三色染色試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，批號：G1340-7）；伊紅染液（武漢賽維爾生物科技有限公司，批號：CR2205132）；無水蘇木色精（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號：20210529）。

1.3 主要儀器

電子天平（上海梅特勒-托利多儀器有限公司，型號：ME204）；數(shù)字心電圖機(jī)（廣州三銳電子科技有限公司，型號：ECG-5512G）；呼吸機(jī)（深圳瑞沃德生命科技有限公司，型號：R407）；麻醉機(jī)（長沙臨科儀器設(shè)備有限公司，型號：GOWE F680）；全自動血液流變測試儀（北京賽科希德科技發(fā)展有限公司，型號：SA-5600）；便攜式數(shù)字化彩色超聲診斷儀（蘇州飛依諾科技有限公司，型號：VINNO 6）；全自動封閉式生物組織脫水機(jī)（孝感耀楚醫(yī)療器械科技有限公司，型號：YT-12K）；石蠟包埋機(jī)（型號：39507）、半自動輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)（型號：38355）均購自意大利Diapath公司；攤片機(jī)（濟(jì)南博科醫(yī)療器械有限公司，型號：BT-1/B）；光學(xué)顯微鏡（廈門麥克奧迪光學(xué)儀器有限公司，型號：BA410E/B）；超低溫冰箱（美國Thermo公司，型號：902GP）。

1.4 模型制備及分組干預(yù)

大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d 后，隨機(jī)分為4 組：假手術(shù)組、模型組、YQHXF 組、西藥組（單硝酸異山梨酯），每組6 只。除假手術(shù)組外，將所有大鼠的冠狀動脈左前降支進(jìn)行結(jié)扎（術(shù)前禁食12 h），以制備大鼠血瘀模型[9]。 大鼠全身麻醉狀態(tài)下，仰臥位固定于鼠板上，脫毛備皮，行氣管插管術(shù)，以小動物呼吸機(jī)維持呼吸，隨后用手術(shù)剪在心前區(qū)位置處剪開皮膚長約3 cm，用鑷子鈍性分離皮下肌肉，拉鉤擴(kuò)大手術(shù)視野，暴露心臟，在左心耳下方用6 號醫(yī)用縫合線結(jié)扎冠狀動脈左前降支，結(jié)扎后縫合肌肉和皮膚。假手術(shù)組只穿線不結(jié)扎。成模標(biāo)準(zhǔn)：結(jié)扎部位以下心肌即刻變白、心臟搏動減弱且心電圖表現(xiàn)為ST 段弓背抬高和（或）T 波高聳，或與其形成單向曲線[10]。 術(shù)后連續(xù)3 d 肌內(nèi)注射0.2 mL 青霉素鈉以抗感染。 術(shù)后3 d，除假手術(shù)組外，其余所有大鼠進(jìn)行“力竭游泳”14 d，以制備大鼠氣虛模型[11]。 將大鼠放入40 cm×30 cm×50 cm 的桶內(nèi)游泳，室溫24～25 ℃，水溫22～25 ℃，水深30 cm，保證大鼠尾部無法接觸桶底，當(dāng)大鼠沉入水中，頭部在10 s 內(nèi)不能浮出水面時，快速將其撈出，用毛巾擦干，放回鼠籠。成模標(biāo)準(zhǔn)：精神萎靡、四肢無力、毛發(fā)易脫落、叫聲低弱、蜷縮扎堆、嗜睡[11]。 力竭游泳造模的同時，控制攝食量。

本課題組前期研究結(jié)果表明，高劑量的YQHXF改善冠心病氣虛血瘀證效果明顯，因此，本實驗直接采取YQHXF 高劑量（即等效劑量的2 倍）進(jìn)行實驗，按照70 kg 成人和200 g 大鼠的體表面積換算公式[12]計算治療劑量，YQHXF 劑量為17.1 g/kg；西藥組單硝酸異山梨酯劑量為3.6 mg/kg；假手術(shù)組和模型組大鼠每日給予生理鹽水灌胃。 各組大鼠造模成功后，第2 天開始進(jìn)行藥物干預(yù)，連續(xù)灌胃28 d。

1.5 指標(biāo)檢測

1.5.1 一般狀態(tài)評價 在藥物干預(yù)前后對大鼠活動狀態(tài)、舌象、爪甲顏色等變化進(jìn)行觀察記錄。 分別于不同時間段觀察各組大鼠中醫(yī)宏觀表征，對“氣虛”“血瘀”進(jìn)行定性比較。

1.5.2 體質(zhì)量監(jiān)測 記錄各組大鼠造模前及造模后7、14、28 d 的體質(zhì)量，觀察各組大鼠體質(zhì)量變化。

1.5.3 心電圖采集 在大鼠麻醉狀態(tài)下，連接數(shù)字心電圖機(jī)，采集治療后各組大鼠的心電圖。

1.5.4 超聲檢測心功能指數(shù) 末次灌胃后12 h，將大鼠仰臥固定，超聲檢測心功能。 記錄大鼠左心室射血分?jǐn)?shù)（left ventricular ejection fraction, LVEF）、左心室短軸縮短率（left ventricular fraction shortening, LVFS）、左心室舒張末期容積（left ventricular end-diastolic volume, LVEDV）、左心室收縮末期容積（left ventricular end-systolic volume, LVESV）、左心室舒張末期內(nèi)徑（left ventricular end-diastolic inter nal dimension, LVEDID）、左心室收縮末期內(nèi)徑（left ventricular end-systolic internal dimension, LVESID）。

1.5.5 血液流變學(xué)檢測 心電圖及超聲檢測后，大鼠腹主動脈取血，在2～3 h 內(nèi)采用全自動血液流變測試儀進(jìn)行血液流變學(xué)檢測，比較各組大鼠的卡松黏度、紅細(xì)胞聚集指數(shù)、全血黏度。

1.5.6 HE 染色 剪下心臟，用生理鹽水灌注沖洗干凈后放置于4%多聚甲醛中固定并室溫儲存。 經(jīng)脫水、石蠟包埋后進(jìn)行切片，用于蘇木精、伊紅染色。最后以適量中性樹膠封片，在光學(xué)顯微鏡高倍鏡視野下，隨機(jī)挑選各組玻片進(jìn)行拍照，每組選6 張玻片，每張玻片隨機(jī)選擇6 個不同視野。

1.5.7 Masson 染色 經(jīng)脫水、包埋好的心臟樣本完成切片后進(jìn)行Masson 染色，方法按染色試劑盒說明書操作，完成中性樹膠封片后在顯微鏡下觀察，每組隨機(jī)選6 張玻片，每張切片隨機(jī)選擇6 個不同視野拍照。 保存圖片后使用Image J 軟件進(jìn)行纖維化定量，分析心肌膠原容積分?jǐn)?shù)（collagen volume fraction, CVF）。

1.6 統(tǒng)計方法

采用GraphPad Prism 8.0.2 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。 數(shù)據(jù)均以“±s”表示，均符合正態(tài)性和方差齊性，多組間比較采用單因素方差分析。 以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠一般狀態(tài)

假手術(shù)組狀態(tài)良好，毛色潔白有光澤；與假手術(shù)組比較，模型組精神萎靡、毛發(fā)黯淡、行動遲緩、嗜睡且便稀；與模型組比較，YQHXF 組和西藥組精神狀態(tài)顯著改善，毛色有光澤，自主活動度增加。

2.2 各組大鼠體質(zhì)量變化

造模前，各組體質(zhì)量比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。 造模后7、14、28 d，與假手術(shù)組比較，模型組體質(zhì)量顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，YQHXF 組和西藥組體質(zhì)量顯著升高(P＜0.01)。造模后7、14 d，與西藥組比較，YQHXF 組體質(zhì)量顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）。造模后28 d，YQHXF 組與西藥組間體質(zhì)量比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。詳見表1。

表1 各組大鼠的體質(zhì)量比較（±s，g，n=6）

表1 各組大鼠的體質(zhì)量比較（±s，g，n=6）

注：與假手術(shù)組比較，▲▲P＜0.01；與模型組比較，##P＜0.01；與西藥組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

組別假手術(shù)組模型組YQHXF 組西藥組造模前233.70±3.62 230.70±6.15 233.20±4.79 235.50±6.09造模后7 d 259.30±5.43 231.30±4.55▲▲256.70±9.33*##267.30±5.79##造模后14 d 316.70±6.50 250.80±5.49▲▲275.30±12.44**##310.00±9.96##造模后28 d 355.00±15.79 303.50±11.04▲▲334.30±14.24##333.80±14.63##

2.3 各組大鼠心電圖結(jié)果

與假手術(shù)組比較，模型組心電圖ST 段顯著抬高，類似“弓背向上”。 與模型組比較，YQHXF 組和西藥組心電圖ST 段均不同程度降低。 詳見圖1。

圖1 各組大鼠心電圖結(jié)果

2.4 各組大鼠心功能情況

與假手術(shù)組比較， 模型組LVEF、LVFS 均顯著降低（P＜0.01），LVEDV、LVESV、LVEDID、LVESID均顯著升高（P＜0.01）。與模型組比較，YQHXF 組和西藥組LVEF、LVFS 均顯著升高（P＜0.01），LVEDV、LVESV、LVEDID、LVESID 均顯著降低（P＜0.01）。西藥組與YQHXF組間LVEF、LVFS、LVEDV、LVESV、LVEDID、LVESID比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。 詳見圖2、表2。

表2 各組大鼠彩色多普勒超聲檢查結(jié)果比較（±s，n=6）

表2 各組大鼠彩色多普勒超聲檢查結(jié)果比較（±s，n=6）

注：與假手術(shù)組比較，▲▲P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

組別假手術(shù)組模型組YQHXF 組西藥組LVEF/%87.72±3.64 69.04±8.74▲▲87.27±2.20##85.08±5.75##LVFS/%52.83±4.95 34.85±6.10▲▲51.24±2.00##49.78±6.81##LVEDV/mL 0.70±0.08 1.34±0.45▲▲0.73±0.13##0.86±0.15#LVESV/mL 0.10±0.03 0.43±0.25▲▲0.10±0.02##0.14±0.08##LVEDID/mm 6.62±0.68 9.13±0.43▲▲6.94±0.50##7.34±0.54##LVESID/mm 3.49±0.31 5.50±1.10▲▲3.51±0.12##3.53±0.67##

圖2 各組大鼠超聲心動圖

2.5 各組大鼠血液流變學(xué)結(jié)果

與假手術(shù)組比較，模型組紅細(xì)胞聚集指數(shù)、卡松黏度、全血黏度（低、中、高切黏度）均顯著升高（P＜0.01）。與模型組比較，YQHXF 組和西藥組紅細(xì)胞聚集指數(shù)、卡松黏度、全血黏度（低、中、高切黏度）均顯著降低（P＜0.01）。 與西藥組比較，YQHXF 組高切黏度顯著降低（P＜0.01）。 西藥組與YQHXF 組間紅細(xì)胞聚集指數(shù)、卡松黏度、低切黏度、中切黏度比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。 詳見表3。

表3 各組大鼠血液流變學(xué)指標(biāo)比較（±s，n=6）

表3 各組大鼠血液流變學(xué)指標(biāo)比較（±s，n=6）

注：與假手術(shù)組比較，▲▲P＜0.01；與模型組比較，##P＜0.01；與西藥組比較，**P＜0.01。

組別 紅細(xì)胞聚集指數(shù) 卡松黏度/(mPa·s) 全血黏度/(mPa·s)低切黏度 中切黏度 高切黏度假手術(shù)組模型組YQHXF 組西藥組4.26±0.60 7.24±0.66▲▲4.60±0.86##5.49±0.42##3.88±0.28 5.83±0.45▲▲3.73±0.56##4.29±0.62##21.38±5.01 42.48±4.30▲▲23.61±4.21##27.73±1.56##4.08±0.29 7.26±0.49▲▲4.91±1.14##5.65±0.24##3.04±0.37 5.69±0.45▲▲3.22±0.67**##4.35±0.24##

2.6 各組大鼠心肌組織HE 染色結(jié)果

假手術(shù)組心肌結(jié)構(gòu)規(guī)則，纖維排列緊密，細(xì)胞核完整且排列整齊。與假手術(shù)組比較，模型組心肌纖維排列明顯紊亂，心肌細(xì)胞出現(xiàn)腫大、壞死且有炎癥細(xì)胞浸潤。 與模型組比較，YQHXF 組和西藥組心肌纖維排列整齊，心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)及形態(tài)改善，炎癥細(xì)胞減少。 其中，YQHXF 組改善較明顯。 詳見圖3。

圖3 各組大鼠心肌組織HE 染色結(jié)果（×400，bar=50 μm）

2.7 各組大鼠心肌組織Masson 染色結(jié)果

與假手術(shù)組比較，模型組心肌間質(zhì)發(fā)現(xiàn)大量膠原纖維變成藍(lán)色，CVF 顯著升高（P＜0.01）。與模型組比較，YQHXF 組和西藥組中藍(lán)色膠原纖維減少，CVF 顯著降低（P＜0.01）。 與西藥組比較，YQHXF 組心肌纖維化減少，CVF 顯著降低（P＜0.05）。 詳見圖4、表4。

表4 各組大鼠心肌組織CVF 比較（±s，n=6）

表4 各組大鼠心肌組織CVF 比較（±s，n=6）

注：與假手術(shù)組比較，▲▲P＜0.01；與模型組比較，##P＜0.01；與西藥組比較，*P＜0.05。

組別假手術(shù)組模型組YQHXF 組西藥組CVF/%9.86±1.37 41.46±3.17▲▲19.21±3.23*##23.50±1.90##

圖4 各組大鼠心肌組織Masson 染色結(jié)果（×400，bar=50 μm）

3 討論

近年來，心血管疾病中冠心病的發(fā)病率愈發(fā)升高[13]，其中，氣虛血瘀證是該病臨床中常見的證型之一，本證因氣虛而無力推動血液運(yùn)行，致血液停滯不前，痹阻于心脈，形成瘀血而引發(fā)[14]。 為了更好地了解冠心病氣虛血瘀證潛在的發(fā)病機(jī)制，需要建立合適的病證結(jié)合動物模型來探索相應(yīng)的作用靶點和臨床治療藥物[15]。 病證結(jié)合動物模型的建立研究為中醫(yī)基礎(chǔ)過渡到臨床治療提供了理論依據(jù)，已成為疾病證候研究的必然趨勢[16]。 隨著中醫(yī)“證”本質(zhì)的深入研究，多學(xué)科參與，病證結(jié)合動物模型飛速發(fā)展，充分體現(xiàn)出中醫(yī)辨病辨證的觀念。

本實驗通過“結(jié)扎冠狀動脈左前降支合并游泳力竭”的方法制備冠心病氣虛血瘀證動物模型，其中，結(jié)扎冠狀動脈可直接造成心肌缺血使大鼠呈現(xiàn)“血瘀”狀態(tài)，強(qiáng)迫大鼠游泳使之疲勞耗氣且限制飲食導(dǎo)致氣血生化不足而呈現(xiàn)“氣虛”狀態(tài)。 本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠出現(xiàn)精神萎靡、毛發(fā)黯淡、行動遲緩、嗜睡且便稀的體征，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠體質(zhì)量明顯降低（P＜0.01）。 心電圖是診斷心肌缺血的主要方法之一[17]，通過分析心電圖ST 段變化可以判斷心肌缺血的嚴(yán)重程度[18]。 模型組大鼠心電圖ST 段顯著抬高，即出現(xiàn)心肌缺血特異性表現(xiàn)；彩色多普勒超聲檢查結(jié)果顯示， 模型組大鼠心功受損嚴(yán)重。 血液流變學(xué)指標(biāo)是反應(yīng)機(jī)體血流情況的重要指標(biāo)，可判定血瘀程度[19]。 與假手術(shù)組比較，模型組紅細(xì)胞聚集指數(shù)、卡松黏度、全血黏度（低、中、高切黏度）均顯著升高（P＜0.01）。HE 染色顯示，模型組大鼠心肌纖維排列明顯紊亂，心肌細(xì)胞出現(xiàn)腫大、壞死且有炎癥細(xì)胞浸潤。 Masson 染色顯示，模型組大鼠心肌間質(zhì)有大量藍(lán)色的膠原纖維出現(xiàn)。 通過觀察模型組大鼠的一般狀態(tài)、體質(zhì)量、心電圖、彩色多普勒超聲檢查、血液流變學(xué)指標(biāo)以及形態(tài)學(xué)染色的結(jié)果，可發(fā)現(xiàn)模型組大鼠符合冠心病氣虛血瘀證的證候表現(xiàn)。

研究表明，治療冠心病氣虛血瘀證以益氣活血為基本法[20]，YQHXF 方由黃芪、丹參、太子參、水蛭、當(dāng)歸、桂枝、紅花、桃仁、炙甘草9 味藥組成，方中黃芪益氣，丹參活血，二味共為君藥；太子參助黃芪以增強(qiáng)養(yǎng)陰益氣之功，水蛭增丹參破血逐瘀之效，二者共為臣藥使瘀祛而不傷正；配以當(dāng)歸通心生血，紅花、桃仁活血通經(jīng)、祛瘀止痛，桂枝溫通經(jīng)脈、助陽化氣，諸藥配伍具有益氣活血、化瘀通絡(luò)之功效。 本實驗結(jié)果表明，YQHXF 干預(yù)后大鼠一般狀態(tài)顯著改善且自主活動度高，體質(zhì)量升高，心電圖ST 段降低，心功能提高，血液黏稠度降低，心肌細(xì)胞及纖維結(jié)構(gòu)、形態(tài)改善，炎癥細(xì)胞浸潤減少，心肌纖維化程度降低，從而緩解氣虛血瘀的癥狀。 通過上述實驗結(jié)果證明，本課題組自擬方Y(jié)QHXF 治療冠心病氣虛血瘀證療效顯著。

綜上所述，通過結(jié)扎大鼠冠狀動脈左前降支、力竭游泳且限制飲食多因素復(fù)合制備的冠心病氣虛血瘀證動物模型符合中醫(yī)證候特征和西醫(yī)病理學(xué)改變。該造模方法符合中醫(yī)病因病機(jī)的發(fā)展規(guī)律，對模型動物的評價確切。 YQHXF 中益氣藥與活血藥配伍對模型大鼠的氣虛血瘀狀態(tài)有一定的治療作用，其可改善大鼠一般狀態(tài)及心電圖結(jié)果，降低血液黏稠度，減少心肌炎癥細(xì)胞浸潤，降低心肌纖維化程度，提高心功能，為臨床治療冠心病氣虛血瘀證提供了一定的理論依據(jù)。