基于PI3K/Akt 信號軸探究補腎活血湯治療乳腺癌骨轉移的機制研究

陳雪珍，朱 蓉，楊滿英，謝 婷，楊 爭，袁 博，胡金輝*

1.張家界市中醫醫院，湖南 張家界 427000；2.湖南中醫藥大學，湖南 長沙 410208；3.湖南中醫藥大學第一附屬醫院，湖南 長沙 410007

國際癌癥研究署（International Agency for Research on Cancer, IARC）發布的2020 年全球癌癥數據顯示，乳腺癌新發病高達226 萬例，被稱為全球女性第一大癌[1-3]。 雖然乳腺癌[4-7]的治療不斷更新和完善，但仍有部分患者會出現骨轉移、腦轉移、肺轉移、肌肉轉移、鎖骨上淋巴結轉移、肝轉移等遠處轉移；由于癌癥復發、轉移的出現，使乳腺癌患者的臨床結局仍不滿意，特別是三陰性乳腺癌（triple negative breast cancer, TNBC）。TNBC 具有高侵襲性、高轉移率、治療手段有限等復雜問題，嚴重威脅患者生命健康和生活質量[4-7]。 其中，骨轉移常導致病理性骨折、骨痛、高鈣血癥，甚至累及脊髓等，嚴重影響患者及家屬生活質量。 由于乳腺癌骨轉移機制尚未明確[8]，臨床上治療方案較單一，效果欠佳且時間持久。因此，尋找能防治乳腺癌發生骨轉移的輔助治療方案具有深遠意義。

補腎活血湯是一種中藥復方制劑，具有補腎填精、活血化瘀的功效，臨床研究證實其在治療乳腺癌及乳腺癌骨轉移患者中有明確療效[9-11]。實驗研究證實，其對于抗血管生成、抑制腫瘤細胞遷移侵襲、促進骨質修復等方面均有一定療效[12-13]，但復方成分復雜，作用機制尚未明確。 磷酸肌醇3-激酶（phosphatidylinositol-3-ki-ases, P I3 K）/蛋 白 質 激 酶B（protein kinase B, Akt）信號通路在腫瘤的發生發展中發揮著極其重要的作用，該通路中的突變在癌癥中經常被發現，在乳腺癌中尤為常見，特別是與TNBC 密切相關[14-17]。 目前研究結果顯示，PI3K/Akt通路涉及乳腺癌與乳腺癌骨轉移的多個過程，包括增殖、遷移、侵襲、上皮間質轉化、免疫逃逸、誘導破骨細胞形成等。研究表明，補腎中藥淫羊藿可通過PI3K/Akt 促進成骨分化治療骨質疏松[18]；沒藥的成分之一槲皮素[19]能通過調節PI3K/Akt 信號通路來減少細胞增殖、誘導細胞凋亡等發揮抗癌作用。 骨微環境中成骨與破骨原是動態平衡的狀態，一旦打破則可能出現骨質增生、骨質破壞等情況。 因此，本研究擬通過構建乳腺癌骨轉移模型，探究補腎活血湯是否通過調控PI3K/Akt 信號軸抑制腫瘤細胞轉移能力和破骨細胞活性改善骨轉移，對其治療乳腺癌骨轉移機制進行研究，為補腎活血湯臨床治療乳腺癌骨轉移提供新的視角。

1 材料

1.1 實驗動物及細胞

雌性，SPF 級， 體質量15～20 g，5～6 周齡的BALB/c裸鼠30 只，動物由湖南中醫藥大學統一購買（來源于湖南斯萊克景達有限公司），許可證號：SCXK（湘）2019-0009，符合湖南中醫藥大學動物倫理委員會要求（LLBH-202141404）。 鼠源性TNBC 細胞系4T1（武漢普諾賽生命科技有限公司，批號：CL-0007，傳代至約18 代），用含10%胎牛血清和1%雙抗（青霉素-鏈霉素）的1640 培養，于37 ℃、5% CO2孵育。細胞密度達80%傳代。

1.2 試劑與藥品

p-PI3K 兔單克隆抗體(批號：PA5-38905)，購自美國thermofisher 公司；磷酸化蛋白質激酶B（phosphorylated protein kinase B, p-Akt）兔單克隆抗體(批號：9271S)，購自美國Thermofisher 公司；活化T 細胞胞質核因子1（nuclear factor of activated T cells c1,NFATc1）小鼠單克隆抗體(批號：66963-1-Ig)、β-肌動蛋白（β-actin）小鼠單克隆抗體(批號：66009-1-Ig)、一抗、二抗稀釋液(批號：SA00001-1、SA00001-2)均購自美國Proteintech 公司；基質金屬蛋白酶2（matrix metalloproteinase 2, MMP-2）兔單克隆抗體(批號：Ab92536)購自英國Abcam 公司；蘇木精核染液（批號：20210809）、伊紅染色液（批號：20210809）、TRAP 染色試劑盒（批號：20210918）均購自中國Abiowell 公司。 補腎活血湯全部中藥均由湖南中醫藥大學第一附屬醫院藥劑科統一采購，具體成分如下：杜仲15 g（批號：2112192），獨活15 g（批號：NG22032103），沒藥6 g（批號：2021120201），紅花6 g（批號：SX22032203），當歸尾12 g（批號：TH22042504），熟地黃12 g（批號：21120141B），山茱萸15 g（批號：SX22032207），補骨脂15 g（批號：HY22051001），枸杞子15 g（批號：CK22053105），菟絲子15 g（批號：SX22041301），肉蓯蓉15 g（批號：21121841A）。PI3K抑制劑LY294002(批號:154447-36-6-50 mg)，購自中國MCE 公司。

1.3 儀器

YT-CJ-2NB 型超凈工作臺(北京亞泰隆公司)；DH-1601 型恒溫培養箱(上海三藤儀器公司)；YD-315 型病理切片機(浙江金華益迪試驗器材)；DYY-6C 型電泳儀、DYCZ-40D 型轉膜儀(中國北京六一公司)；BX43 型光學顯微鏡(日本Olympus 公司)；E7242X 型醫用診斷X 線射線管組件（中國深圳威圖公司）。

2 方法

2.1 動物造模[20]、分組

30 只BALB/c 裸鼠，隨機選取6 只裸鼠作為空白組（蒸餾水灌胃20 mL·kg-1，每天1 次；取對數生長期4T1 乳腺癌細胞接種于其余BALB/c 裸鼠右側脛骨，接種后標記并進行完全隨機分組：模型組（蒸餾水灌胃20 mL·kg-1，每天1 次）、補腎活血湯組（中藥液灌胃36.67 g·kg-1，每天1 次）、LY294002 組（LY294002 腹腔注射，50 mg·kg-1，每周2 次）、補腎活血湯聯合LY294002 組（中藥液灌胃，36.67 g·kg-1，每天1 次＋LY294002 腹 腔 注 射，50 mg·kg-1，每周2次）；每組6 只。 具體造模操作為：制備細胞懸液密度約1×106細胞，接種體積20 μL，準備27 G 胰島素注射器，吸入人乳腺癌4T1 細胞懸液備用。 4%水合氯醛注射液（0.15 mL/10 g）腹腔注射麻醉。 麻醉成功后用左手固定后肢，屈膝呈90°暴露膝蓋和脛骨之間的白色髕韌帶。 用75%乙醇將裸鼠的右后肢進行消毒，右手握住針平行于脛骨，并將針通過髕韌帶中心扎入脛骨近端骨髓腔內，緩慢注入大約20 μL的細胞懸液，拔出針頭后用棉花按壓針口。 約3 d脛骨區可見瘤體，經X 線檢測發生溶骨性改變，本研究以脛骨區可見瘤體為模型成功評價標準。

2.2 藥物制備與給藥劑量

將中藥材倒入電陶瓷煎藥壺中，一煎加水1000 mL浸泡30 min，武火(500 W)煮沸，轉文火(200 W)煎60 min，過濾藥渣；二煎加水800 mL 煎煮45 min，過濾合并2 次煎液，混勻。 將煎液倒入圓底燒瓶中，置于旋轉蒸發儀上減壓濃縮（70 ℃，-0.1 MPa），至約1 g/mL 時停止。 將濃縮后的煎液倒入蒸發皿中，恒溫水浴鍋蒸干，轉移至真空減壓干燥箱，干燥后得補腎活血湯浸膏。 收集浸膏，用鋁箔袋封裝，保存于干燥器中。根據70 kg 人與20 g 小鼠等效劑量比例1∶9.1 折算并取2 倍濃縮劑量得到裸鼠給藥劑量：補腎活血湯36.67 g·kg-1，灌胃前蒸餾水溶解浸膏成生藥濃度為1.8 g·mL-1；PI3K 抑制劑（LY294002）[21]，按說明書進行配制，給藥劑量為50 mg·kg-1。

2.3 各組裸鼠生長情況及瘤體變化情況

從造模后第4 天開始干預，連續干預14 d，同時觀察裸鼠的生存狀態，實驗開始后每2 天測量一次裸鼠右下肢直徑（mm）。所有裸鼠在實驗期間用同一電子秤、游標卡尺統一測量體質量及右下肢直徑。第15 天脫頸處死后取材，對各組瘤體進行常規石蠟切片，采用HE、TRAP 染色進行觀察。分多聚甲醛固定及-80 ℃凍存。

2.4 X 線評估骨轉移破壞情況

X 線掃描多聚甲醛固定標本，評估骨溶解情況。設置參數為：40 kV、32 mA、6 mAs。

2.5 HE 及TRAP 染色

處死后對裸鼠右下肢骨組織制備石蠟切片，進行病理學HE 染色檢測，確認為乳腺癌骨轉移。TRAP 染色評估破骨細胞數量。

2.6 Western blot 檢測骨組織相關蛋白表達

轉移瘤標本在冷RIPA 緩沖液中溶解，并在12 000 r·min-1，4 ℃離心10 min，離心半徑7 cm。將裂解物從10% SDS-PAGE 凝膠上電泳轉移到NC膜上。 將膜在含有5%脫脂奶的Tris 緩沖鹽（PBST）緩沖液中于室溫下封閉1.5 h 后，膜與抗β-actin、抗p-PI3K、p-Akt、MMP-2、NFATc1 的抗（分別為1∶5000、1∶1000、1∶1000、1∶1000、1∶2000）室溫孵育過夜，洗膜后與二抗（鼠源1∶6000，兔源1∶5000）室溫下孵育1.5 h。加入ECL 顯影液，放于化學凝膠成像系統顯影，采用全自動化學發光圖像分析系統對蛋白條帶進行分析，以目標條帶的灰度值與內參β-actin灰度值的比值表示蛋白的相對表達水平。

2.7 統計學分析

運用SPSS 19.0 及Graphpad Prism 5.0 軟件進行統計分析，每組至少重復3 次，所有計量資料以“±s”表示，檢驗各組數據的正態性檢驗和方差齊性，組間比較采用單因素方差分析，重復測量資料進行球形分布檢驗，P＜0.05 為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 各組裸鼠生長曲線及瘤體變化情況

造模成功率100%。 由于移植瘤表現為局部膝關節腫脹，與普通皮下移植瘤不同，故測量下肢腫脹部分最大直徑進行對比。 結果顯示：與A 組相比，B組、C 組、D 組及E 組裸鼠右下肢直徑增長明顯，其中B 組增長速度最為迅速（P＜0.01）；與B 組相比，C組、D 組及E 組增長較緩，且各組增長程度呈遞減趨勢，以E 組最為明顯（P＜0.01）。 詳見表1、圖1。

圖1 乳腺癌骨轉移裸鼠、瘤體圖

表1 補腎活血湯對乳腺癌骨轉移裸鼠右下肢直徑的影響（mm，±s，n=6）

表1 補腎活血湯對乳腺癌骨轉移裸鼠右下肢直徑的影響（mm，±s，n=6）

注：A.空白組；B.模型組；C.補腎活血湯組；D.LY294002 組；E.補腎活血湯聯合LY294002 組。 整體組別比較，P=0.034＜0.05；與A 組相比，**P＜0.01；與B 組相比，##P＜0.01。

組別ABCDE干預時間0 d 2 d 4 d 6 d 8 d 10 d 12 d 6.89±0.32 7.18±1.16 6.50±0.35 7.14±0.59 6.75±0.76 7.11±0.26 7.23±1.15 6.56±0.35 7.23±0.61 6.83±0.77 7.32±0.33 8.46±1.83 7.36±0.88 7.28±0.72 6.78±1.00 7.51±0.37 9.05±1.42 8.04±1.47 7.83±0.89 7.34±1.00 7.74±0.30 11.49±3.25 9.27±1.45 8.90±1.42 8.35±0.92 7.89±0.30 11.92±2.49 10.75±1.04 9.71±1.87 9.16±1.25 7.99±0.30 14.15±3.21**11.76±1.05 10.71±1.26 9.73±0.93##

3.2 補腎活血湯對乳腺癌骨轉移灶的影響

與A 組比較，B 組、C 組、D 組和E 組HE 染色可見腫瘤細胞浸潤，核大深染，部分可見與正常組織分界，明確發生骨轉移，證實造模成功（如圖2）。 對下肢組織進行X 線檢測，與A 組比較，B 組、C 組、D組及E 組裸鼠右側脛骨呈現溶骨性改變，嚴重者骨干消失，C 組、D 組及E 組骨溶解情況均較B 組稍輕（如圖3）；TRAP 染色提示，與A 組比較，B、C、D、E組破骨細胞數量增多，且C 組、D 組、E 組破骨細胞數量均較B 組有不同程度減少（如圖4）。

圖2 補腎活血湯對裸鼠乳腺癌骨轉移灶病理組織學（HE，×200）

圖3 補腎活血湯對裸鼠乳腺癌骨轉移灶影像學影響

圖4 補腎活血湯對裸鼠乳腺癌骨轉移灶TRAP 染色的影響（TRAP，×400）

3.3 補腎活血湯對乳腺癌骨轉移轉移瘤組織中通路蛋白表達情況的影響

與A 組比較，B 組、C 組、D 組裸鼠瘤組織中p-PI3K、p-Akt、MMP-2 和NFATc1 蛋白的表達均升高（P＜0.01 或P＜0.05），E 組裸鼠瘤組織中p-PI3K、p-Akt 和MMP-2 蛋白的表達均升高（P＜0.01 或P＜0.05）；與B 組比較，C 組、D 組及E 組裸鼠瘤組織中p-PI3K、p-Akt、MMP-2 和NFATc1 的表達均降低（P＜0.01 或P＜0.05）；與C 組比較，E 組裸鼠瘤組織中p-PI3K、p-Akt、MMP-2 的表達均降低（P＜0.01 或P＜0.05），D 組及E 組裸鼠瘤組織中NFATc1 的表達呈現遞減趨勢（P＞0.05）。 詳見表2、圖5。

圖5 各組裸鼠骨轉移瘤組織p-PI3K、p-Akt、MMP-2、NFATc1 蛋白表達圖

表2 補腎活血湯對乳腺癌骨轉移瘤組織中p-PI3K、p-Akt、MMP-2 和NFATc1 蛋白表達的影響（±s，n=6）

表2 補腎活血湯對乳腺癌骨轉移瘤組織中p-PI3K、p-Akt、MMP-2 和NFATc1 蛋白表達的影響（±s，n=6）

注：與A 組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與B 組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與C 組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。 A.空白組；B.模型組；C.補腎活血湯組；D.LY294002 組；E.補腎活血湯聯合LY294002 組。

組別A B C D E F 值P 值p-PI3K/β-actin 0.083±0.015 0.573±0.011**0.430±0.010**##0.300±0.040**##0.210±0.060**##△△95.81 0.000 p-Akt/β-actin 0.100±0.046 0.550±0.090**0.362±0.008**##0.275±0.057*##0.177±0.031##△△31.70 0.000 MMP-2/β-actin 0.097±0.015 0.460±0.036**0.345±0.035**##0.240±0.010**##△0.187±0.035*##△△72.88 0.000 NFATc1/β-actin 0.100±0.026 0.660±0.165**0.355±0.055*#0.260±0.070##0.197±0.060##17.43 0.000

4 討論

現代醫學治療乳腺癌有手術、放化療、靶向治療、內分泌治療、中醫藥等多種綜合治療手段，藥物選擇豐富多樣[4]。 但是對于晚期乳腺癌，特別是轉移率高達65%～75%的骨轉移[22]，治療手段及療效仍有待進一步開發研究。 PI3K/Akt 通路是細胞內的信號傳導通路，其突變在TNBC 中經常被發現，高達70%[23-24]。PI3K/Akt 通路可促使M2 巨噬細胞發生極化并釋放特異性降解細胞外基質的MMP-2[25-30]；MMP-2 作為乳腺癌侵襲性的標志物，能促進腫瘤細胞和腫瘤基質細胞的遷移，導致腫瘤細胞更難以被免疫細胞識別、追蹤與殺傷[31-32]；另外，PI3K/Akt 信號通路可以通過調控破骨細胞特異性蛋白質NFATc1 的表達來影響破骨細胞形成和分化。 因此，PI3K/Akt 信號通路可能通過調控MMP-2、NFATc1 達到改善乳腺癌溶骨性骨轉移的作用[33-35]。

中醫學認為，乳腺癌病機為正虛邪戀，正氣虧虛，邪毒凝結，病位在乳，歸經屬于肝、胃、腎。邪毒以痰、瘀、毒為主[7，36-37]。 加上手術、放化療等伴隨的毒副反應，導致氣血精的進一步虛損，臟腑功能隨之減退，全身呈現免疫低下、代謝減退及紊亂等狀態。 乳腺癌骨轉移以腎虛為本，血瘀為標，瘀血邪毒趁虛而入流于至虛病所，深入經筋骨骱之中，膠著不去，使經脈凝滯不通，發為病灶，出現骨痛等現象。 補腎活血湯出自《傷科大成·跌打引經用藥法》，方中杜仲、熟地黃、補骨脂、獨活共為君藥，具有補腎壯陽、益精生髓、強筋壯骨之效；沒藥、當歸尾、紅花共為臣藥，助君藥以補腎填精、祛瘀通絡、活血止痛；肉蓯蓉、菟絲子、山茱萸、枸杞子均為佐藥，性甘溫平，善于補腎益精助陽。全方以補為主，標本同治，有補腎填精、活血化瘀之效。研究證實，補腎活血湯有改善局部血液循環、提高成骨細胞活性、促進骨髓間充質干細胞增殖和成骨分化、抑制破骨形成等作用[38-40]。

本研究結果顯示，造模后，組織中p-PI3K、p-Akt、NFATc1 及MMP-2 蛋白的表達增高，藥物干預后，C 組、D 組及E 組的轉移瘤組織中p-PI3K、p-Akt、NFATc1 及MMP-2 蛋白的表達均較B 組下降；組間比較發現，E 組表達最低，呈現協同作用。 由此可見，乳腺癌骨轉移發生時，機體內PI3K/Akt 通路被激活，破骨細胞活性增加，腫瘤侵襲性增強；補腎活血湯能抑制PI3K/Akt 信號通路的活化，PI3K/Akt通路的抑制下調了NFATc1 及MMP-2 蛋白的表達，減弱了破骨細胞的活性及腫瘤細胞侵襲性。 因此，補腎活血湯可能通過抑制PI3K/Akt 通路下調MMP-2 及NFATc1 的表達發揮治療乳腺癌骨轉移的作用。 本課題組選用人源性TNBC 細胞株MDAMB-231 細胞裸鼠脛骨注射造模，在預實驗進行動物造模時出現造模周期長，成模率低的困境，故后期調整為鼠源性TNBC 細胞株4T1 細胞。 由于實驗設備等的原因，對于X 線結果無法進行量化分析，評估存在一定局限性，無法獲得統計學的驗證，后續研究可結合小動物CT 進行檢測，進一步評估骨小梁、骨密度等指標。

綜上所述，補腎活血湯可抑制PI3K/Akt 通路以下調MMP-2 及NFATc1 的表達，削弱破骨細胞的活性和腫瘤侵襲性來治療乳腺癌骨轉移。 本研究為補腎活血湯的進一步深入研究提供了方向，為補腎活血湯的臨床運用提供了數據支持。