基于TLR4/MyD88/NF-kB 信號(hào)通路探討追風(fēng)透骨膠囊減緩?fù)孟ス顷P(guān)節(jié)炎模型軟骨退變的作用機(jī)制

曹寅生，易 強(qiáng)，鄺高艷，危建文，金久楚，羅振華*

1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長(zhǎng)沙 410007；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長(zhǎng)沙 410208

膝骨關(guān)節(jié)炎(knee osteoarthritis, KOA)是一種以關(guān)節(jié)軟骨逐漸破壞為重要特征的退行性關(guān)節(jié)疾病[1]，在成年人群中其發(fā)病率隨年齡的增長(zhǎng)而上升，是老年人重要的致殘因素之一，目前其發(fā)病機(jī)制尚未充分研究[2]。 一直以來(lái)，無(wú)完全治愈骨關(guān)節(jié)炎疾病的特效藥物，可用的治療方法主要集中在緩解癥狀和延緩疾病進(jìn)展上[3]，不同藥物治療KOA 的作用機(jī)制也有待研究。中醫(yī)藥治療因其獨(dú)特的作用機(jī)制，在防治骨關(guān)節(jié)疾病中有著特殊的優(yōu)勢(shì)。 追風(fēng)透骨膠囊是由經(jīng)典名方小活絡(luò)丹、苓桂術(shù)甘湯、九味羌活湯化裁而來(lái)，具有祛風(fēng)除濕、通經(jīng)活絡(luò)、散寒止痛之功效，對(duì)治療KOA 具有明顯療效。 臨床研究表明，單獨(dú)使用與追風(fēng)透骨膠囊相同藥物組成的追風(fēng)透骨丸治療KOA，可顯著緩解膝關(guān)節(jié)疼痛并改善其功能[4]，其改進(jìn)劑型追風(fēng)透骨膠囊在臨床上聯(lián)合玻璃酸鈉治療KOA，同樣可有效緩解患者早中期KOA 疼痛癥狀并改善膝關(guān)節(jié)功能[5]。

骨關(guān)節(jié)炎患者軟骨組織中Toll 樣受體4（Tolllike receptor 4, TLR4）/髓細(xì)胞分化初級(jí)反應(yīng)蛋白88（myeloid differentiation primary response protein 88,MyD88）/核 因 子kappa-B（nuclear factor kappa-B,NF-κB）信號(hào)通路呈持續(xù)活化狀態(tài)，骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生、進(jìn)展可能與之相關(guān)[6]。 追風(fēng)透骨膠囊治療KOA的作用機(jī)制可能與TLR4/MyD88/NF-kB 信號(hào)通路相關(guān)，與白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β, IL-1β）、白細(xì)胞介素-6（interleukin-6, IL-6）、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)促炎細(xì)胞因子的分泌相關(guān)。 本研究擬通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，闡明追風(fēng)透骨膠囊治療KOA 動(dòng)物模型、緩解KOA 進(jìn)展的作用機(jī)制，為中醫(yī)藥防治KOA 提供有效的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)理論依據(jù)。

1 材料

1.1 動(dòng)物

健康雄性6 月齡新西蘭大白兔50 只，清潔級(jí)，體質(zhì)量（2500±500） g，動(dòng)物購(gòu)買及飼養(yǎng)均于湖南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心完成[動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(湘)2020-0005；單位許可證號(hào)：SYXK（湘）2019-0009]。 本實(shí)驗(yàn)經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（倫理審查號(hào)：LLBH-202007070001）。

1.2 主要藥物與試劑

追風(fēng)透骨膠囊（天地橫一制藥股份有限公司，規(guī)格：0.26 g/粒，批號(hào)：200505）；硫酸氨基葡萄糖膠囊（浙江海正藥業(yè)股份有限公司，規(guī)格：0.314 g/粒，批號(hào)：71812133）；miRNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（康為世紀(jì)有限公司，批號(hào)：CW2141）；SuperECLPlus 超敏發(fā)光液（美國(guó)Advansta 公司，批號(hào)：K-12045-D50）；兔NF-κB抗體、TLR4 抗體、MyD88 抗體（美國(guó)Proteintech 公司，批號(hào)分別為10745-1-AP、19811-1-AP、23230-1-AP）；二步法試劑盒、DAB 試劑盒（中杉金橋有限公司，批號(hào)分別為600D54、600W23）；兔IL-6 抗體、IL-1β 抗體、TNF-α 抗體（北京博奧森生物技術(shù)有限公司，批號(hào)分別為bs-6312R、bs-0812R、bs-7320R）。

1.3 主要儀器

臺(tái)式冷凍離心機(jī)（湖南湘儀有限公司，型號(hào)：H1650R）；熒光定量RCP 儀、熒光PCR 板（美國(guó)Thermo 公司，型號(hào)分別為PIKOREAL96、SPL0960）；電泳儀、水平瓊脂糖電泳槽（北京六一有限公司，型號(hào)分別為DYY-2C、DYCP-31DN）；搖床（型號(hào)：TS-1）旋渦混合器（型號(hào)：GL-88B）均購(gòu)自江蘇其林貝爾有限公司；磁力攪拌器（中國(guó)雷磁有限公司，型號(hào)：JB-13）；-80 ℃冰箱（中國(guó)美菱有限公司，型號(hào)：DW-HW438）。

2 方法

2.1 造模

參考改良Videman 造模法[7-8]造模。 （1）用卷尺測(cè)量兔左側(cè)踝關(guān)節(jié)上約1 cm 小腿的周長(zhǎng)記錄為下周長(zhǎng)，測(cè)量腹股溝下約0.5 cm 左側(cè)大腿根部的周長(zhǎng)，記錄為上周長(zhǎng)，用直尺測(cè)量兔左下肢完全伸直狀態(tài)下大腿內(nèi)側(cè)中線上踝關(guān)節(jié)上約1 cm 至大腿根部下約0.5 cm 的直線長(zhǎng)度，記錄為縱軸長(zhǎng)。 剪取長(zhǎng)度保證足夠包繞兔左下肢1 周的高分子繃帶，離體制作成管型，管型高分子繃帶的一端內(nèi)表面周長(zhǎng)為下周長(zhǎng)加3～4 cm，另一端內(nèi)表面周長(zhǎng)為上周長(zhǎng)加0.5 cm，管型的長(zhǎng)度為縱軸長(zhǎng)。 先用剪刀修剪管型高分子繃帶兩端尖銳部分并使之整齊圓潤(rùn)，然后以數(shù)層透明膠帶包繞其上下兩端及外表面。 在離管型高分子繃帶上端約0.5 mm 處，用老虎鉗把1 mm 的鐵絲穿過(guò)管型，打結(jié)后擰成一個(gè)直徑約為8 mm 的金屬環(huán)，檢測(cè)其牢固程度，將寬10 cm、長(zhǎng)30 cm 的彈性繃帶穿過(guò)金屬環(huán)。 在助手的幫助下使兔左下肢處于完全伸直狀態(tài)，然后緩慢地將其左下肢自上而下插入管型高分子繃帶中，把彈性繃帶打結(jié)，使之環(huán)繞大腿根部前方的軀干1 周，調(diào)整懸吊式外固定支具，使之固定兔左膝關(guān)節(jié)于伸直位而不脫落。 （2）將兔放回籠中觀察1 h，如兔左下肢因造模支具過(guò)度壓迫導(dǎo)致血運(yùn)障礙，則立即剪斷彈性繃帶，取下管型高分子繃帶，待后左下肢血運(yùn)正常后重新調(diào)整造模；若血運(yùn)良好，則先在管型高分子繃帶外表面及上下緣纏繞包裹細(xì)鐵絲網(wǎng)，再用數(shù)層透明膠帶覆蓋，防止管型高分子繃帶被啃咬破壞。每天觀察造模支具佩戴情況，連續(xù)觀察6 周。造模期內(nèi)，如發(fā)現(xiàn)造模支具脫落或模型兔造模側(cè)下肢出現(xiàn)損傷，予以重新固定。 模型驗(yàn)證：造模6 周后，從正常組和KOA 造模組中按隨機(jī)數(shù)字表法各選取3 只兔行KOA 模型驗(yàn)證，驗(yàn)證方法包括觀察對(duì)比兩組兔造模側(cè)膝關(guān)節(jié)的功能活動(dòng)，以及膝關(guān)節(jié)軟骨大體觀察及HE 染色觀察對(duì)比。 若造模組較正常組膝關(guān)節(jié)活動(dòng)功能障礙，關(guān)節(jié)軟骨破壞明顯，Pelletier 評(píng)分及Mankin 評(píng)分明顯升高，則造模成功。 驗(yàn)證成功后，完成藥物干預(yù)階段的隨機(jī)分組，第2 天以灌胃的方式開(kāi)始給藥。

2.2 分組及給藥

適應(yīng)性喂養(yǎng)2 周后，從50 只新西蘭兔隨機(jī)選取10 只作為正常組，其余40 只為KOA 造模組。 造模觀察6 周后，從KOA 造模組和正常組中各隨機(jī)選取3 只兔行KOA 模型驗(yàn)證，KOA 模型驗(yàn)證成功后重新隨機(jī)分組，從剩余的正常組中隨機(jī)選取6 只作為空白組(A 組)，將剩余的KOA 造模組抽取30 只隨機(jī)分為模型組(B 組)、硫酸氨基葡萄糖組(C 組)、追風(fēng)透骨膠囊低劑量組(D 組)、追風(fēng)透骨膠囊中劑量組(E 組)、追風(fēng)透骨膠囊高劑量組(F 組)，每組6 只。 重新分組后開(kāi)始給藥，E 組：根據(jù)追風(fēng)透膠囊成人每次用量為1.04 g，2 次/d，則60 kg 成人每千克每次用藥量為17 mg，參照劑量-體表面積換算方法[9]計(jì)算兔給藥量。 得出兔每次的給藥量為56 mg/kg，藥物和蒸餾水混合后充分?jǐn)嚢杈鶆颍渲瞥苫鞈乙海辔噶繛?0 mL/kg，2 次/d。 D 組：給藥量為28 mg/kg，灌胃量為10 mL/kg，2 次/d。 F 組：給藥量為112 mg/kg，灌胃量為10 mL/kg，2 次/d。 C 組：硫酸氨基葡萄糖給藥量為50 mg/kg，灌胃量為10 mL/kg，2次/d。A、B 組：予蒸餾水灌胃，灌胃量為10 mL/kg，2 次/d。

2.3 觀察指標(biāo)及檢測(cè)

外科無(wú)菌操作暴露兔造模側(cè)膝關(guān)節(jié)軟骨面，在完成對(duì)關(guān)節(jié)軟骨的大體觀察及Pelletier 評(píng)分[10]后，在冰盒上取下股骨遠(yuǎn)端及脛骨平臺(tái)的膝關(guān)節(jié)軟骨組織，部分置于凍存管中-80 ℃凍存，用于提取研究相關(guān)的蛋白及mRNA，檢測(cè)軟骨中TNF-α、IL-1β、IL-6的含量，部分用于HE 染色觀察及Mankin 評(píng)分[11]。

2.3.1 造模側(cè)膝關(guān)節(jié)軟骨大體觀察及Pelletier 評(píng)分

藥物干預(yù)6 周后，空氣栓塞處死實(shí)驗(yàn)兔，解剖每只兔造模側(cè)膝關(guān)節(jié)，對(duì)關(guān)節(jié)軟骨行大體觀察并拍取照片，采用Pelletier 評(píng)分[10]評(píng)估軟骨損傷情況。0 分：關(guān)節(jié)面光整，色澤如常；1 分：關(guān)節(jié)面粗糙，有小的裂隙且色澤灰暗；2 分：關(guān)節(jié)面糜爛，軟骨缺損深達(dá)軟骨表中層；3 分：關(guān)節(jié)面潰瘍形成，缺損深達(dá)軟骨深層；4 分：軟骨剝脫，軟骨下骨暴露。軟骨損傷程度與分?jǐn)?shù)呈正相關(guān)。

2.3.2 膝關(guān)節(jié)軟骨HE 染色觀察及Mankin 評(píng)分 對(duì)大體觀察及Pelletier 評(píng)分完成后的軟骨標(biāo)本進(jìn)行處理，切取適量關(guān)節(jié)軟骨，予固定、脫鈣、石蠟包埋處理。將石蠟包埋的軟骨組織切成5 μm 厚的切片，用二甲苯脫蠟，依次用不同濃度梯度的乙醇浸泡后蒸餾水洗凈。 詳細(xì)染色操作順序如下：蒸餾水沖洗3 min，蘇木精染色5 min,蒸餾水洗5 s，浸入1%鹽酸-乙醇5 s，流水沖洗10 min，1%伊紅染色2 min，蒸餾水洗凈5 s。 切片進(jìn)行常規(guī)處理(脫水和透明)，在顯微鏡下觀察切片，倍數(shù)為10×10，參照改良Mankin評(píng)分[11]。 （1）軟骨結(jié)構(gòu)：光滑如常為0 分；表面出現(xiàn)不規(guī)則裂隙為1 分；裂隙深達(dá)移行層為2 分；裂隙深達(dá)輻射層為3 分；裂隙深達(dá)鈣化層為4 分。 （2）軟骨細(xì)胞：數(shù)量如常為0 分；數(shù)量彌散性增多為1 分；出現(xiàn)大量蔟集樣細(xì)胞團(tuán)塊為2 分；數(shù)量明顯減少為3 分。（3）基質(zhì)染色：正常為0 分；染色輕度減退為1 分；染色中度減退為2 分；染色重度減退為3 分。 （4）潮線完整性：完整為0 分；多重潮線為1 分；軟骨下血管侵入潮線為2 分。對(duì)軟骨病理學(xué)改變進(jìn)行評(píng)估，軟骨病理改變程度與分?jǐn)?shù)呈正相關(guān)。隨后采集圖片資料。

2.3.3 RT-PCR 法檢測(cè)軟骨中TLR4、MyD88、NFκB 的mRNA 表達(dá)水平 取各組凍存的膝骨關(guān)節(jié)炎軟骨組織，采用RT-PCR 法進(jìn)行檢測(cè)TLR4、MyD88、NF-κB 的mRNA 表達(dá)。加入Trizol 試劑進(jìn)行裂解，提取總RNA。再逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后進(jìn)行PCR 反應(yīng)。PCR反應(yīng)體系為：cDNA 模板2 μL，PrimerR（10 μmol）1 μL，PrimerF（10 μmol）1 μL，ddH2O 11 μL，2XSYBGREENPCRMasterMix 15 μL。PCR 反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，循環(huán)40 次。 反應(yīng)結(jié)束后采用2－ΔΔCt法計(jì)算各基因相對(duì)表達(dá)量。 引物序列見(jiàn)表1。

表1 兔引物序列

2.3.4 Western blot 法 檢 測(cè) 軟 骨 中TLR4、MyD88、NF-κB 的蛋白表達(dá) 取各組凍存的KOA 軟骨組織，采用Western blot 法檢測(cè)TLR4、MyD88、NF-κB 的蛋白表達(dá)。經(jīng)剪碎、RIPA 裂解液裂解，以12 000 r/min離心15 min（離心半徑6 cm）。 收集上清液，即為總蛋白液。 采用BCA 法檢測(cè)蛋白濃度。 蛋白經(jīng)變性后進(jìn)行SDS-PAGE，轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜完畢后置入PBST 中洗凈。將膜浸入脫脂奶粉封閉液，室溫放置60 min，4 ℃過(guò)夜，次日室溫放置30 min。 一抗孵育：5%脫脂奶粉稀釋一抗，與膜在4 ℃下過(guò)夜孵育。 孵育完成后洗膜3次，每次10 min。二抗孵育：5%脫脂奶粉稀釋二抗，與膜室溫下孵育90 min。 孵育完成后洗膜3次，每次10 min。 顯色與曝光：將膜置入ECL 化學(xué)發(fā)光液，孵育完成后用紙濾干，用化學(xué)發(fā)光成像儀拍照。

2.3.5 免疫組化檢測(cè)軟骨中的TNF-α、IL-1β、IL-6的含量 取各組凍存的膝骨關(guān)節(jié)炎軟骨組織，采用免疫組化法檢測(cè)TNF-α、IL-1β、IL-6 的含量。 予固定、脫鈣、石蠟包埋處理，再切片，并用二甲苯脫蠟，不同濃度梯度的乙醇浸泡后蒸餾水洗凈，進(jìn)行抗原修復(fù)，再將切片浸入3%過(guò)氧化氫溶液5 min 來(lái)阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，然后用緩沖液封閉。加一抗：將200 μL 兔一抗滴加到切片上，并在室溫下孵育80 min。 加二抗：滴加80 μL 兔二抗，100 ℃孵育30 min。 DAB 顯色：滴加適量DAB 顯色劑，待反應(yīng)完成后自來(lái)水洗滌。復(fù)染：將切片置入蘇木素4 min，流水沖洗，PBS 返藍(lán)。 脫水封片，顯微鏡下采集數(shù)據(jù)及圖片。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)軟件行數(shù)據(jù)分析。 計(jì)量資料以“±s”表示，若同時(shí)滿足正態(tài)性和方差齊性，多組數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，多組間兩兩比較用LSD 法；若不滿足正態(tài)性和方差齊性，采用非參數(shù)檢驗(yàn)，Kruskal-Wallis 法。 P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 膝關(guān)節(jié)軟骨大體觀察及Pelletier 評(píng)分結(jié)果

A 組：關(guān)節(jié)軟骨顏色、光澤、厚度正常，軟骨完整無(wú)損傷。B 組：關(guān)節(jié)軟骨顏色灰白，無(wú)光澤，厚度明顯變薄，表面凹凸不平，關(guān)節(jié)面承重區(qū)域軟骨有明顯破壞，甚至向下凹陷形成潰瘍直至軟骨深層，骨贅形成。C 組：關(guān)節(jié)軟骨呈淡灰白色，光澤稍差，厚度稍變薄，關(guān)節(jié)軟骨面部分區(qū)域表層軟骨見(jiàn)少許破壞。 D組：關(guān)節(jié)軟骨顏色發(fā)黃，光澤較差，厚度較薄，表面凹凸不平，關(guān)節(jié)面承重區(qū)域軟骨有明顯破壞，甚至向下凹陷形成潰瘍直至軟骨中層，有少量骨贅形成。 E組：關(guān)節(jié)軟骨呈淡灰白色，光澤稍差，厚度稍變薄，關(guān)節(jié)軟骨面部分區(qū)域粗糙。 F 組：關(guān)節(jié)軟骨呈淡灰白色，光澤稍差，厚度稍變薄，關(guān)節(jié)軟骨面部分區(qū)域粗糙。 詳見(jiàn)圖1。

圖1 給藥6 周后各組兔造模側(cè)膝關(guān)節(jié)軟骨大體觀察結(jié)果

給藥6 周后，與A 組比較，B 組Pelletier 評(píng)分增高（P＜0.01）；與B 組比較，F(xiàn) 組Pelletier 評(píng)分降低（P＜0.05），C、D、E 組Pelletier 評(píng)分較B 組均有不同程度的降低，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。 詳見(jiàn)圖2。

圖2 給藥6 周后各組兔造模側(cè)膝關(guān)節(jié)軟骨Pelletier 評(píng)分結(jié)果

3.2 膝關(guān)節(jié)軟骨HE 染色鏡下觀察結(jié)果

A 組：軟骨HE 染色正常，無(wú)病理學(xué)改變。B 組：軟骨顯著變薄，表層軟骨區(qū)域性缺失，軟骨細(xì)胞數(shù)量顯著減少并排列紊亂，可見(jiàn)血管入侵軟骨基底層，軟骨下骨質(zhì)硬化。 C 組：軟骨變薄，表層軟骨有小的缺損，軟骨細(xì)胞數(shù)量稍減少，部分軟骨細(xì)胞呈簇聚狀排列。D 組：軟骨變薄，表層軟骨部分區(qū)域破損，軟骨細(xì)胞數(shù)量減少，部分軟骨細(xì)胞呈簇聚排列。 E 組：軟骨變薄，表層軟骨有小的缺損，軟骨細(xì)胞數(shù)量稍減少，排列大致正常。F 組：軟骨變薄，表層軟骨有小的缺損，軟骨細(xì)胞數(shù)量稍減少，排列大致正常。 詳見(jiàn)圖3。

圖3 給藥6 周后各組兔造模側(cè)膝關(guān)節(jié)軟骨HE 染色結(jié)果（×100）

3.3 膝關(guān)節(jié)軟骨Mankin 評(píng)分結(jié)果

給藥6 周后，與A 組比較，B 組Mankin 評(píng)分增高（P＜0.01）；與B 組比較，C、D、E、F 組Mankin 評(píng)分均降低（P＜0.01）。與C 組比較，E、F 組軟骨Mankin評(píng)分稍低，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。 詳見(jiàn)圖4。

圖4 給藥6 周后各組兔造模側(cè)膝關(guān)節(jié)軟骨大體觀察的Mankin 評(píng)分結(jié)果

3.4 膝 關(guān) 節(jié) 軟 骨 中TLR4、MyD88、NF-κB mRNA的表達(dá)

給藥6 周后，與A 組比較，B 組軟骨組織中TLR4、MyD88、NF-κB mRNA 表達(dá)水平均上調(diào)（P＜0.01）。 與B 組比較，C、D、E、F 組軟骨組織中TLR4、MyD88、NF-κB mRNA 表達(dá)水平均下調(diào)（P＜0.01）。詳見(jiàn)圖5。

圖5 給藥6 周后各組兔造模側(cè)膝關(guān)節(jié)軟骨組織中TLR4、MyD88、NF-κB mRNA 的表達(dá)結(jié)果

3.5 膝關(guān)節(jié)軟骨中TLR4、MyD88、NF-κB 蛋白的表達(dá)

給藥6 周后，與A 組比較，B 組軟骨組織中TLR4、MyD88、NF-κB 蛋白表達(dá)水平均上調(diào)（P＜0.01）；與B組比較，C、D、E、F 組軟骨組織中TLR4、MyD88、NFκB 蛋白表達(dá)水平均下調(diào)（P＜0.01）。 詳見(jiàn)圖6。

圖6 給藥6 周后各組兔造模側(cè)膝關(guān)節(jié)軟骨組織中TLR4、MyD88、NF-κB 蛋白的表達(dá)結(jié)果

3.6 膝關(guān)節(jié)軟骨中IL-1β、IL-6、TNF-α 的含量

給藥6 周后，與A 組比較，B 組的軟骨細(xì)胞和軟骨基質(zhì)的IL-1β、IL-6 和TNF-α 染色結(jié)果均呈深黃棕色，累積光密度（IOD）值均升高，提示IL-1β、IL-6和TNF-α 含量均增高（P＜0.01）。 與B 組比較，C、D、E、F 組的軟骨細(xì)胞和軟骨基質(zhì)的IL-1β、IL-6 和TNF-α染色結(jié)果均呈淡黃色，IOD 值均降低，提示IL-1β、IL-6 和TNF-α 的含量均降低（P＜0.01）。 詳見(jiàn)圖7～10。

圖7 給藥6 周后各組兔造模側(cè)膝關(guān)節(jié)軟骨組織中以免疫組化IOD 值表示的IL-1β、IL-6 和TNF-α 相對(duì)含量

圖8 給藥6 周后各組兔造模側(cè)膝關(guān)節(jié)軟骨組織中IL-1β 免疫組化染色結(jié)果（×400）

4 討論

圖9 給藥6 周后各組兔造模側(cè)膝關(guān)節(jié)軟骨組織中IL-6 免疫組化染色結(jié)果（×400）

圖10 給藥6 周后各組兔造模側(cè)膝關(guān)節(jié)軟骨組織中TNF-α 免疫組化染色結(jié)果（×400）

KOA 是一種以關(guān)節(jié)疼痛、關(guān)節(jié)僵硬、關(guān)節(jié)腫脹、骨摩擦和關(guān)節(jié)無(wú)力為主要表現(xiàn)的退行性關(guān)節(jié)疾病[12]，中老年人群患病率高。KOA 屬于中醫(yī)學(xué)“痹病”的范疇，其中外感風(fēng)寒濕邪致氣血運(yùn)行不暢，經(jīng)脈痹阻，是此病重要的中醫(yī)病機(jī)之一[13]。 追風(fēng)透骨膠囊是追風(fēng)透骨丸的改進(jìn)劑型，具有通筋絡(luò)、祛風(fēng)寒、除濕邪、散寒邪、止痹痛的功效。其中，君藥為川烏，藥理學(xué)研究表明，川烏中的某些成分對(duì)單碘乙酸鹽誘導(dǎo)的大鼠骨關(guān)節(jié)模型的關(guān)節(jié)軟骨具有保護(hù)作用，其可預(yù)防關(guān)節(jié)軟骨變性而降低Mankin評(píng)分，亦可促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖并抑制軟骨細(xì)胞凋亡[14]。有研究表明，烏頭提取液能抑制兔KOA 模型的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的異常降解，起到減緩軟骨退變的作用[15]。 研究發(fā)現(xiàn)，其臣藥之一赤芍所含的芍藥苷可減少大鼠類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎模型關(guān)節(jié)滑膜組織中IL-1β、IL-6、TNF-α 等炎癥因子的分泌，減緩類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎疾病的進(jìn)展[16]。

TLR4 是一種廣泛存在于動(dòng)物細(xì)胞膜表面的跨膜蛋白，屬于10 種Toll 樣受體中的一種[17]，可以誘導(dǎo)各種炎癥因子的產(chǎn)生，參與介導(dǎo)炎癥介質(zhì)的釋放[18]。MyD88 是動(dòng)物細(xì)胞質(zhì)中的一種可溶癥銜接蛋白，接收來(lái)自Toll 樣受體（包括TLR4）發(fā)出免疫信號(hào)，進(jìn)行翻譯整合后再向下游信號(hào)通路傳導(dǎo)，是重要的免疫信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)樞紐之一[19]。 NF-κB 是動(dòng)物細(xì)胞質(zhì)中的一種二聚體蛋白，能被TLR4/MyD88 信號(hào)通路傳導(dǎo)的免疫信號(hào)激活，激活的NF-κB 將通過(guò)核孔轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi)，通過(guò)調(diào)控相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)參與免疫炎癥反應(yīng)[20]。 因此，TLR4 表達(dá)的增加可能通過(guò)MyD88 激活NF-κB 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，引發(fā)包括TNF-α、IL-1β和IL-6 在內(nèi)的促炎性細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄和合成，而TLR4/MyD88/NF-κB 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路持續(xù)被激活將導(dǎo)致過(guò)度的免疫炎癥反應(yīng)并最終造成組織損傷[21]。

近年來(lái)，Toll 樣受體介導(dǎo)的軟骨細(xì)胞的先天免疫反應(yīng)已被證實(shí)是促進(jìn)KOA 的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[22]。研究發(fā)現(xiàn)，凋亡的軟骨細(xì)胞TLR4 表達(dá)較正常軟骨細(xì)胞明顯增高，高表達(dá)的TLR4 會(huì)進(jìn)一步激活其下游的MyD88及NF-κB 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞產(chǎn)生大量IL-1β、IL-6、TNF-α 等炎癥因子， 而過(guò)量的IL-1β、IL-6、TNF-α 是骨關(guān)節(jié)炎疾病中誘導(dǎo)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡的主要因素之一[23]，抑制軟骨細(xì)胞TLR4 及其下游信號(hào)通路的活化，減少相關(guān)炎癥因子的大量釋放能有效抑制軟骨細(xì)胞的凋亡，從而抑制KOA 發(fā)展[24]。 因此，TLR4/MyD88/NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是研究KOA發(fā)病機(jī)制非常重要的環(huán)節(jié)。

本研究結(jié)果顯示，與空白組比較，模型組膝關(guān)節(jié)軟骨破壞明顯，Pelletier 評(píng)分及Mankin 評(píng)分均升高(P＜0.01)；軟骨中TLR4、MyD88、NF-κB mRNA 及蛋白表達(dá)水平均上調(diào)(P＜0.01),軟骨中IL-1β、IL-6、TNF-α 含量均升高(P＜0.01)。上述結(jié)果說(shuō)明，KOA 模型兔患側(cè)膝關(guān)節(jié)軟骨中TLR4/MyD88/NF-κB 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路處于活化狀態(tài)，并介導(dǎo)產(chǎn)生大量炎癥因子，促進(jìn)軟骨細(xì)胞凋亡，從而促進(jìn)KOA 的進(jìn)展。 與模型組比較，追風(fēng)透骨膠囊低、中、高劑量組及硫酸氨基葡萄糖組的軟骨損傷程度輕，Mankin 評(píng)分均降低(P＜0.01)，軟骨中TLR4、MyD88、NF-κB mRNA 及蛋白表達(dá)水平均下調(diào)(P＜0.01)，軟骨中IL-1β、IL-6、TNF-α含量均降低(P＜0.01)，此外，追風(fēng)透骨膠囊高劑量組軟骨Pelletier 評(píng)分降低明顯(P＜0.05)。 結(jié)果說(shuō)明，追風(fēng)透骨膠囊及硫酸氨基葡萄糖能有效抑制關(guān)節(jié)軟骨中TLR4/MyD88/NF-κB 信號(hào)通路的活化，減少炎癥因子產(chǎn)生，從而延緩KOA 的進(jìn)展。

本研究將TLR4/MyD88/NF-κB 信號(hào)通路相關(guān)指標(biāo)作為檢測(cè)對(duì)象，結(jié)果顯示追風(fēng)透骨膠囊可抑制該信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，但無(wú)法排除追風(fēng)透骨膠囊是否可通過(guò)其他信號(hào)通路及途徑來(lái)延緩KOA 的進(jìn)展。相關(guān)研究表明，腸道中的某些革蘭氏陰性菌大量繁殖后產(chǎn)生大量脂多糖，破壞腸道黏膜屏障的完整性，過(guò)量脂多糖經(jīng)腸道吸收進(jìn)入體內(nèi)后會(huì)通過(guò)TLR4/MyD88/NF-κB 或TLR4/MyD88 非依賴/NF-κB 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路激活免疫炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致組織損傷[25]。 所以，追風(fēng)透骨膠囊對(duì)腸道菌群的調(diào)節(jié)，以及對(duì)腸壁黏膜屏障的作用和對(duì)TLR4 與脂多糖結(jié)合的干預(yù)有待進(jìn)一步研究證實(shí)。