巴豆葉乙酸乙酯提取物抗血吸蟲活性的初步研究

李 漓，何雨晴，吳智煌，楊勝輝*，周小江*

湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長沙 410208

血吸蟲病是一種由裂體屬（Schistosoma）寄生蟲引起的、廣泛流行于熱帶及亞熱帶地區(qū)的人畜共患病，嚴(yán)重危害人類健康[1-2]。 血吸蟲病影響著全球70多個國家或地區(qū)，據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，全球至少有2.4 億人感染血吸蟲病，超過8 億人居住在易感染風(fēng)險地區(qū)[1，3]，在我國流行危害較大的是日本血吸蟲病[4]。 血吸蟲病在我國流行歷史悠久，并且流行的范圍廣泛，截至2020 年底，全國共有450 個血吸蟲病流行縣（市、區(qū)），共有血吸蟲病流行鄉(xiāng)（鎮(zhèn)）3352個、流行村28 376 個，流行村的總?cè)丝谶_(dá)7137.04 萬人[5-6]。

血吸蟲在人等終宿主體內(nèi)存在蟲卵、尾蚴、童蟲和成蟲4 個階段[7]。 血吸蟲病是一種免疫性疾病，在其感染過程中，尾蚴、童蟲、成蟲和蟲卵均可對人體造成損害，損害的主要原因是不同蟲期所釋放的抗原均能誘發(fā)一系列免疫病理變化，并出現(xiàn)一些并發(fā)癥[7]。 其中最大的損害是由沉積在肝臟中的蟲卵導(dǎo)致肉芽腫及繼發(fā)性纖維化[8-9]。

由于中藥具有多成分、多途徑和多靶點(diǎn)協(xié)同調(diào)控作用特點(diǎn)，因此，在治療血吸蟲病，尤其是血吸蟲病肝纖維化時，具有潛在的優(yōu)勢，能夠有效控制肝纖維化的發(fā)展[10]。巴豆葉收載于《中華本草》，又名雙眼龍葉、大葉雙眼龍葉，為大戟科植物巴豆Croton tiglium L.的葉，具有祛風(fēng)活血、殺蟲解毒的功效。同時，巴豆葉是傣族、哈尼族、毛南族和德昂族的習(xí)用藥[11-13]。 巴豆在我國的西南和南部地區(qū)均有分布，尤其是云南、四川、廣西等地，其資源很豐富[12-13]。 巴豆葉中主要含二萜類、降倍半萜類、生物堿、苯丙素類、揮發(fā)油等成分[14-18]，其提取物具有抗氧化、抗腫瘤、殺皮膚寄生蟲等作用[19]，其所含二萜類成分具有抗腫瘤、抗結(jié)核、抗炎等活性[14-16,20]。 本團(tuán)隊(duì)前期從巴豆葉乙酸乙酯提取物（ethyl acetate extract from the leaves of Croton tiglium, EAELCT）中分離鑒定了20 個二萜類化合物，其中12 個為新二萜（含1 個新骨架）[14-16]。 本文在前期的研究基礎(chǔ)上，對EAELCT 抗血吸蟲病的作用進(jìn)行研究，以期找到“標(biāo)本同治”的抗血吸蟲藥物及為開發(fā)利用巴豆葉這一可再生資源打下基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 動物

SPF 級昆明小鼠，雌雄各半，體質(zhì)量18～22 g，購于長沙市天勤生物技術(shù)有限公司，許可證號：SCXK（湘）2019-0014，質(zhì)量合格證：4307262211100423576。小鼠自由攝食及飲水，飼養(yǎng)溫度20～25 ℃，室內(nèi)通風(fēng)良好。 實(shí)驗(yàn)經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院動物實(shí)驗(yàn)倫理委員會批準(zhǔn)（ZYFY20191115）。

血吸蟲感染的陽性釘螺由湖南省血吸蟲病防治研究所提供。 在室溫和光照條件下將釘螺于去氯水中靜置2 h 逸蚴，將水面上的尾蚴收集到15 mL 的塑料離心管中，加入4 ℃預(yù)冷的洗滌培養(yǎng)基，離心洗滌2 次，每次5 min，棄去上清液，收集尾蚴，備用。

1.2 藥材與試劑

巴豆葉購于成都荷花池藥材市場，經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)周小江教授鑒定為大戟科植物巴豆Croton tiglium L.的干燥葉；吡喹酮片（沈陽紅旗制藥有限公司，批號：1706071）；HE 染液、Masson 染液（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，批號：ZLI-9613、G1340）；IFN-γ、IL-2、IL-5、IL-10、IL-13 ELISA 試劑盒（美國Thermo Fisher 公司，批號：BMS4021、BMS239、BMS603、BMS614、BMS6015）。 其他試劑均為分析純。

1.3 儀器

高速冷凍離心機(jī)（德國eppendorf 公司，型號：5415R）；細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國Thermo 公司，型號：HERAcell 240i）；切片機(jī)（德國萊卡公司，型號：RMZ135）；顯微鏡（廈門Motic 公司，型號：BA410E）。

1.4 受試藥物

取干燥的巴豆葉3 kg，剪碎，加70%的乙醇回流提取2 次，每次1 h，第一次加10 倍量，第二次加8 倍量，濾過，合并提取液，減壓回收乙醇，加水超聲混懸。 水混懸液采用石油醚萃取脫脂后，分取水層，再加乙酸乙酯進(jìn)行多次萃取，直至無色，合并乙酸乙酯萃取液，減壓濃縮后蒸干，得乙酸乙酯提取物136 g，得率為4.53%。

試驗(yàn)時，取EAELCT，加少許DMSO 溶解后，加生長培養(yǎng)基和蒸餾水超聲使混懸，分別配制成濃度為34、17、8.5、4.25 μg/mL 的體外試驗(yàn)培養(yǎng)液和濃度為0.015 00、0.007 50 和0.003 75 g/mL 的體內(nèi)試驗(yàn)供試液。

2 方法

2.1 體外殺血吸蟲童蟲試驗(yàn)

血吸蟲童蟲的培養(yǎng)及分組：取血吸蟲尾蚴加5 mL生長培養(yǎng)基（含10%胎牛血清、90% RPMI 1640、200 U/mL 的青霉素、200 μg/mL 的鏈霉素、2.5 μg/mL的兩性霉素B 和10 mmol/L 的4-羥乙基哌嗪乙磺酸溶液），重懸，吸入注射器中，來回反復(fù)推壓尾蚴20 次左右，使尾蚴脫尾變成童蟲，鏡檢斷尾率可達(dá)99%以上。離心，去除上清的斷尾，收集童蟲。分為空白對照組、DMSO 組、吡喹酮組和不同濃度的EAELCT 組。

殺血吸蟲童蟲：于有童蟲的離心管中加入1 mL生長培養(yǎng)基，混勻后，滴加于6 孔板，45 條童蟲/每孔。按上述分組，每組加2 mL 不同濃度（34、17、8.5、4.25 μg/mL）含藥的生長培養(yǎng)基，空白對照組加入生長培養(yǎng)基。將6 孔板置于37 ℃、CO2培養(yǎng)箱中孵育，分別于24、48、72 h 用顯微鏡觀察蟲體變化及生存狀況，計(jì)算童蟲死亡率。

2.2 體內(nèi)抗血吸蟲試驗(yàn)

2.2.1 體內(nèi)抗血吸蟲童蟲試驗(yàn) 按照隨機(jī)數(shù)字表，隨機(jī)選擇10 只小鼠作為空白對照組，再參照文獻(xiàn)建立血吸蟲童蟲感染模型[21]，采用腹部貼片法感染小鼠，40 條尾蚴/小鼠，建模成功后隨機(jī)分為模型組、吡喹酮對照組（0.2 g/kg）、EAELCT 高劑量組（0.3 g/kg）、中劑量組（0.15 g/kg）和低劑量組（0.075 g/kg）。每組10 只。感染后于第1、2、3、4、5、6、7 天連續(xù)灌胃不同濃度的EAELCT，吡喹酮對照組于感染后第1、第2天連續(xù)灌胃2 d，模型組以等量的生理鹽水灌胃。感染后第29 天處死小鼠，收集肝門靜脈、腸系膜靜脈內(nèi)血吸蟲蟲體，計(jì)數(shù)小鼠體內(nèi)蟲體總數(shù)，計(jì)算殺蟲率，比較各組殺蟲率的差異。

2.2.2 體內(nèi)抗血吸蟲成蟲試驗(yàn) 按照隨機(jī)數(shù)字表，隨機(jī)選擇10 只小鼠作為空白對照組，再參照文獻(xiàn)建立血吸蟲成蟲感染模型[21]，采用腹部貼片法感染小鼠，20 條尾蚴/小鼠，感染后小鼠隨機(jī)分組，分組情況同“2.2.1”，每組10 只小鼠。 感染29 d 后用EAELCT連續(xù)灌胃7 d，吡喹酮對照組于感染29 d 后連續(xù)灌胃2 d，模型組以等量的生理鹽水灌胃。感染后第42天處死小鼠，收集肝門靜脈及腸系膜靜脈內(nèi)血吸蟲成蟲，計(jì)數(shù)蟲體總數(shù)，計(jì)算殺蟲率，比較各組殺蟲率的差異。

2.2.3 調(diào)節(jié)小鼠Th1/Th2 型細(xì)胞因子的免疫應(yīng)答 分組及給藥同“2.2.1”和“2.2.2”，其中，殺童蟲試驗(yàn)：于感染前、感染后第14 天、第29 天分別采集血液；殺成蟲試驗(yàn)：于感染前、感染后第29 天、第42 天分別采集血液。 采用ELISA 試劑盒檢測血清中IL-2、IL-5、IL-13、IFN-γ 等細(xì)胞因子的含量，比較EAELCT對小鼠在發(fā)病過程中相關(guān)Th1/Th2 型細(xì)胞因子表達(dá)的影響。

2.2.4 對血吸蟲病小鼠肝纖維化影響 分組及給藥同“2.2.2”，于42 d 處死小鼠，分取肝臟。 觀察小鼠肝臟的外觀變化，取肝左葉0.5 g 置于4%多聚甲醛中固定，石蠟包埋切片進(jìn)行HE 染色，顯微鏡下觀察肝纖維化的程度，并通過Imagine ProPlus 6.0 圖像軟件測定小鼠肝組織中蟲卵肉芽腫面積，每組測量20 個蟲卵肉芽腫，計(jì)算各組的平均肉芽腫面積。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

3 結(jié)果

3.1 體外殺血吸蟲童蟲試驗(yàn)結(jié)果

與空白對照組對比，各給藥組48 h 及72 h 后對血吸蟲童蟲均有明顯殺滅效果，各濃度EAELCT組中血吸蟲童蟲的死亡率均顯著高于空白對照組（P＜0.05）， 其中34 μg/mL EAELCT 組殺童蟲效果最好，蟲體死亡率顯著高于17.00 μg/mL、8.50 μg/mL 和4.25 μg/mL EAELCT 組（P＜0.05），72 h 后童蟲死亡率達(dá)到100%，EAELCT 體外殺童蟲呈明顯的劑量和時間依賴性。 詳見表1。

表1 EAELCT 體外殺血吸蟲童蟲的效果(±s)

表1 EAELCT 體外殺血吸蟲童蟲的效果(±s)

注：與空白對照組比較，#P＜0.05；與吡喹酮組比較，＆P＜0.05；與EAELCT（34.00 μg/mL）組比較，*P＜0.05。

組別 血吸蟲童蟲死亡率/%24 h 48 h 72 h濃度/(μg/mL)每孔童蟲數(shù)/條空白對照組吡喹酮組DMSO 組EAELCT 組—30.00—34.00 17.00 8.50 4.25 45 45 45 45 45 45 45 10.94 17.39 9.17 21.98#15.69 11.39 5.04＆*18.81 47.30#19.75 71.93#＆41.33#*36.21#*31.93#＆*31.63 56.36#36.67＆100.00#＆88.14#＆*78.33#＆*50.00#*

3.2 體內(nèi)殺血吸蟲試驗(yàn)結(jié)果

在體內(nèi)抗血吸蟲童蟲試驗(yàn)中，與模型組相比，EAELCT 高、中、低劑量組的每鼠蟲荷數(shù)均顯著減少，顯示較好的殺蟲率（P＜0.05）。 與吡喹酮組相比，EAELCT 各濃度組的每鼠蟲荷數(shù)更低（P＜0.05），每鼠殺蟲率更高（P＜0.05）。 詳見表2。

表2 EAELCT 對血吸蟲童蟲殺蟲效果(±s)

表2 EAELCT 對血吸蟲童蟲殺蟲效果(±s)

注：與模型組比較，*P＜0.05；與吡喹酮組比較，#P＜0.05。

組別模型組吡喹酮組EAELCT 組每鼠殺蟲率/%—21.06±1.83 31.05±3.74#39.05±4.61#43.75±4.89#劑量/（g/kg）—0.200 0.075 0.150 0.300小鼠數(shù)/只10 9 9 7 7每鼠蟲荷數(shù)/條28.73±5.08 22.68±4.79*19.81±7.14*#17.51±7.09*#16.16±3.27*#

在體內(nèi)抗血吸蟲成蟲試驗(yàn)中，與模型組相比，EAELCT 高、中、低劑量組中每鼠蟲荷數(shù)均顯著降低（P＜0.05），提示EAELCT 對血吸蟲成蟲有較好的殺蟲效果。與吡喹酮組比較，EAELCT 高、中、低劑量組中每鼠蟲荷數(shù)更高（P＜0.05），每鼠殺蟲率更低（P＜0.05）。 詳見表3。

表3 EAELCT 體內(nèi)對血吸蟲成蟲殺蟲效果(±s)

表3 EAELCT 體內(nèi)對血吸蟲成蟲殺蟲效果(±s)

注：與模型組比較，*P＜0.05；與吡喹酮組比較，#P＜0.05。

組別模型組吡喹酮組EAELCT 組劑量/（g/kg）—0.200 0.075 0.150 0.300小鼠數(shù)/只10 8 7 9 7每鼠蟲荷數(shù)/條14.93±3.21 4.02±1.19*9.07±2.58*#7.84±4.41*#6.85±1.81*#每鼠殺蟲率/%—73.07±7.59 39.25±3.65#47.49±4.86#54.12±5.98#

3.3 調(diào)節(jié)血吸蟲病小鼠Th1/Th2 型細(xì)胞因子的免疫應(yīng)答結(jié)果

體內(nèi)抗血吸蟲童蟲試驗(yàn)中，Th1/Th2 型細(xì)胞因子的免疫應(yīng)答結(jié)果見圖1。 感染后期EAELCT 高、中、低劑量組的Th1 型細(xì)胞因子IFN-γ、IL-2 表達(dá)水平較模型組明顯增加（P＜0.05）；而EAELCT 高、中、低劑量組的Th2 型細(xì)胞因子IL-5、IL-13 表達(dá)水平較模型組明顯下降（P＜0.05）。

圖1 EAELCT 對血吸蟲童蟲小鼠血清中IFN-γ（A）、IL-2（B）、IL-5（C）、IL-13（D）的影響

體內(nèi)抗血吸蟲成蟲試驗(yàn)中，Th1/Th2 型細(xì)胞因子的免疫應(yīng)答結(jié)果見圖2。 結(jié)果表明，感染后期EAELCT 高、中、低劑量組的Th1 型細(xì)胞因子IFN-γ和IL-2 表達(dá)水平較模型組明顯增加（P＜0.05）；Th2型細(xì)胞因子IL-5、IL-13 表達(dá)水平較模型組均明顯下降（P＜0.05）。

圖2 EAELCT 對血吸蟲成蟲小鼠血清中IFN-γ（A）、IL-2（B）、IL-5（C）、IL-13（D）的影響

3.4 EAELCT 抗血吸蟲病小鼠肝纖維化結(jié)果

肉眼觀察顯示，模型組小鼠肝臟顏色發(fā)暗，分布有大量的蟲卵結(jié)節(jié)；EAELCT 不同濃度組的小鼠肝臟顏色較紅潤，肝臟表面的蟲卵結(jié)節(jié)數(shù)目相對較少。HE染色顯示，模型組有大量的蟲卵肉芽腫，炎癥細(xì)胞浸潤明顯，而EAELCT 高、中、低劑量組較模型組的蟲卵肉芽腫面積明顯減?。≒＜0.05）。 詳見圖3、表4。

表4 蟲卵肉芽腫面積對比(±s)

表4 蟲卵肉芽腫面積對比(±s)

注：與模型組比較，*P＜0.05；與吡喹酮組比較，#P＜0.05。

組別劑量/（g/kg）模型組吡喹酮組EAELCT 組—0.200 0.075 0.150 0.300測量的蟲卵肉芽腫數(shù)/個20 20 20 20 20測量的蟲卵肉芽腫面積/μm2 51 047.85±3 641.25 26 347.49±1 926.54*41 567.27±2 986.76*#40 648.73±2 647.12*#34 964.75±2 346.45*#

圖3 各組小鼠肝臟HE 染色比較（×100）

4 討論

血吸蟲病嚴(yán)重威脅人類健康，晚期可導(dǎo)致肝硬化、腹水和上消化道大出血等多種并發(fā)癥。 血吸蟲感染機(jī)體后即使體內(nèi)的血吸蟲蟲體被殺滅，但沉積在肝臟中的蟲卵仍然可能會導(dǎo)致肉芽腫和肝纖維化。因此，血吸蟲病肝纖維化是當(dāng)前的治療難題。目前，血吸蟲病的首選治療藥物為吡喹酮，但它不能改變肝纖維化進(jìn)程或逆轉(zhuǎn)肝纖維化，且有產(chǎn)生耐藥性的情況[22-23]。 因此，本文特選擇具有殺蟲解毒功效的多民族用藥巴豆葉進(jìn)行研究。 巴豆葉作為傣族、哈尼族、毛南族和德昂族的習(xí)用藥，在我國分布面廣，資源豐富。 本研究發(fā)現(xiàn)，EAELCT 不僅有較好的殺血吸蟲作用，而且能調(diào)節(jié)Th1/Th2 型細(xì)胞因子的免疫應(yīng)答和改善肝纖維化，顯示了中藥多成分、多途徑和多靶點(diǎn)協(xié)同調(diào)控作用的特點(diǎn)。

本研究結(jié)果表明，EAELCT 在體外對血吸蟲童蟲顯示出較好的殺蟲活性，各濃度EAELCT 組中血吸蟲童蟲的死亡率均顯著高于空白對照組和吡喹酮組；體內(nèi)抗血吸蟲試驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)EAELCT 對血吸蟲童蟲具有較好的殺蟲效果，但對血吸蟲成蟲的殺蟲效果不及吡喹酮。 多位學(xué)者的研究[24-25]證實(shí)，某些中藥的提取物中含有殺血吸蟲的活性物質(zhì)。 劉晨晨等[24]發(fā)現(xiàn)白頭翁提取物中的單體BTW5 對體外培養(yǎng)日本血吸蟲成蟲及童蟲具有較好的殺滅作用。 陳巖勤等[25]學(xué)者證實(shí)，白頭翁總皂苷（PRS）對體外培養(yǎng)的日本血吸蟲童蟲和成蟲具有顯著的殺蟲活性，30 μg/mL PRS 作用4 h 后，日本血吸蟲童蟲及成蟲全部死亡，殺蟲率達(dá)到100%。 這些研究提示，從傳統(tǒng)中草藥中探尋具有預(yù)防和治療血吸蟲感染的活性成分，有助于為臨床開發(fā)新型血吸蟲病治療藥物提供參考和借鑒。然而，中藥抗血吸蟲的具體機(jī)制目前尚不完全清楚。 為進(jìn)一步探討EAELCT 抗血吸蟲病肝纖維化的機(jī)制，本課題組進(jìn)一步研究了EAELCT 對血吸蟲感染小鼠血清中Th1/Th2 型細(xì)胞因子分泌的調(diào)節(jié)作用。血吸蟲病肝纖維化過程中，Th2 型細(xì)胞及其分泌的細(xì)胞因子IL-4、IL-5、IL-10 和IL-13 等發(fā)揮了重要作用[26]。在血吸蟲感染早期即感染后6 周內(nèi)，主要由Th1 型細(xì)胞因子如IL-2、IFN-γ 等發(fā)揮免疫功能，同時抑制Th2 型細(xì)胞應(yīng)答，實(shí)現(xiàn)早期抗寄生蟲感染作用；同時，Th2 型細(xì)胞因子表達(dá)逐漸升高，8～12 周達(dá)到最高水平，隨后慢慢減少[26-27]。 該過程引起以IL-4 和IL-13 介導(dǎo)的Th2 占主導(dǎo)的免疫反應(yīng)，趨化嗜酸性粒細(xì)胞、肝星狀細(xì)胞和淋巴細(xì)胞等細(xì)胞在蟲卵周圍浸潤，形成以蟲卵為中心的肉芽腫，最終促進(jìn)肝纖維化形成[26-27]。 本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，體內(nèi)殺血吸蟲童蟲過程中，EAELCT 高、中、低劑量組的Th1 型細(xì)胞因子IFN-γ、IL-2 表達(dá)水平較模型組明顯增加；而EAELCT 高、中、低劑量組的Th2 型細(xì)胞因子IL-5、IL-13 表達(dá)水平較模型組明顯下降。EAELCT 刺激Th1 型細(xì)胞因子IFN-γ、IL-2 的表達(dá)，抑制Th2 型細(xì)胞應(yīng)答，下調(diào)Th2 型細(xì)胞因子IL-5、IL-13 的表達(dá)，在一定程度上抑制和逆轉(zhuǎn)肝纖維化形成。

本研究通過EAELCT 體內(nèi)外抗血吸蟲的活性研究及對血吸蟲感染小鼠血清Th1/Th2 型細(xì)胞因子分泌的調(diào)節(jié)作用研究，顯示EAELCT 體內(nèi)外具有一定的抗血吸蟲活性，同時具有一定的改善血吸蟲病肝纖維化的作用，但其具體機(jī)制尚未進(jìn)行深入研究，有待于進(jìn)一步探索。 本文的研究結(jié)果，為EAELCT的進(jìn)一步研究和開發(fā)利用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。