加味消脂利肝方治療非酒精性脂肪肝的網絡藥理學研究及實驗驗證

廖小妹，陳美麗，王璽舜，唐博翔，何文智*

1.湖南中醫藥大學口腔醫學院，湖南 長沙 410208；2.湖南中醫藥大學，湖南 長沙 410208；3.湖南中醫藥大學附屬長沙市中醫醫院，湖南 長沙 410002

非酒精性脂肪肝（non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD）是以肝細胞脂肪變性、蓄積，炎癥性壞死為病理特征，以炎癥反應、胰島素抵抗（insulin resistance,IR）為病理機制，無過量飲酒史的臨床綜合征。NAFLD 作為一種潛在的進行性肝病，有25%左右的脂肪變性發展為肝臟炎癥并進展為非酒精性脂肪性肝炎[1]，持續的肝損傷和細胞死亡將導致纖維化，最終導致肝硬化和肝癌[2-3]，并且在早期一般不具有臨床治療指征。 目前，疾病發展過程中得到普遍肯定的NAFLD 發病機制是“多次打擊”學說，它闡述其基本表現為由肝細胞內甘油三酯(triglyceride, TG)的蓄積，逐漸過渡成肝組織壞死性炎癥和纖維化，進行性發展為肝硬化和肝癌，成為NAFLD患者致死的主要因素[4]。 減少炎癥反應、降低肝細胞損害程度、促進患者肝功能恢復、提高生活質量是臨床研究NAFLD 的目標[5]。目前，治療該疾病主要包括生活方式干預、手術、輔助藥物等[6-8]，雖有一定的治療效果[9]，但長期服用效果不佳、肝毒性較大，停藥后的反彈現象使其臨床依從性差[10]。

中醫學認為NAFLD 是膏粱厚味誘發，導致濕、痰、瘀互結的病理因素[11]。 中醫藥治療疑難雜癥，數千年來積累了很多有效的治療手段。 臨床中醫運用辨證治療NAFLD[12]，針灸[13]、推拿[14]、穴位埋線[15]等治法，均獲得較好療效，中醫藥治療作用溫和、成本低、治療依從性高等優勢，尤其適用于需長期治療的慢性代謝性疾病[16]。綜上所述，臨床更期待從傳統中藥組方中尋找新的NAFLD 治療方法。

加味消脂利肝方是臨床醫家在丹梔逍遙散及保和丸基礎上加減化裁而組成，具有疏肝解郁、消脂利肝的功效。 前期臨床研究中，明確了丹梔逍遙散降脂的有效性，療效顯著，安全性高[17]。 加味消脂利肝方疏肝軟堅，健脾消積，解毒散瘀；方中黃連抗炎、降血脂、解熱，并通過抑制神經氨酸苷酶進而影響脂肪變性[18]，屬于NAFLD 臨床辨證用方君藥之一。 但該藥方的藥效作用機制尚不明確，活性成分及靶點關聯性未知。 基于此，本研究擬采用網絡藥理學探索加味消脂利肝方干預NAFLD 的機制，為加味消脂利肝方的臨床應用提供科學依據，同時實驗驗證加味消脂利肝方治療NAFLD 的療效。

1 網絡藥理學

1.1 加味消脂利肝方藥物靶點篩選

借助TCMSP收集加味消脂利肝方各中藥的化學成分[19]。設定口服生物利用度≥30%、類藥性≥0.18[20]為TCMSP 數據庫的篩選條件，獲得活性成分及作用靶點后，將化合物作用的靶點轉化為UniProt 蛋白質數據庫標準化的靶點，限定物種為“Homo sapiens”。

1.2 非酒精性脂肪肝疾病靶點庫建立

用“Non alcoholic fatty liver disease”“Non-alcoholic fatty liver disease”“NAFLD”為疾病關鍵詞，通過GeneCards、OMIM 數據庫篩選NAFLD 的潛在靶點。 在GeneCards 數據庫中，Score 值和該靶點與疾病聯系成正相關， 選取相關性分數＞5 的靶點，取兩個數據庫信息的并集，建立疾病靶點庫。

1.3 蛋白質-蛋白質相互作用（protein-protein interaction, PPI）網絡構建

疾病與藥方靶點取交集并繪制韋恩圖，并提交至STRING 數據庫構建PPI 網絡模型[21]，生物種類設定為“Homo sapiens”，最小互相作用閾值設定為“highest confidence”（＞0.9），獲得PPI 網絡，并通過Cytoscape 3.9.0 中的MCODE 插件對PPI 網絡進一步分析獲取關鍵靶點。

1.4 基因本體（gene ontology, GO）分析與京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes, KEGG）通路富集分析

應用MetaScape 數據平臺對加味消脂利肝方與NAFLD 交集靶點進行GO、KEGG 通路富集分析。

2 實驗驗證

2.1 材料

2.1.1 動物 SPF 級SD 大鼠，體質量(200±20) g，由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司出售，實驗動物許可證SYXK(湘)2019-0009，湖南中醫藥大學實驗動物倫理委員會批準倫理編號：XMBH-202110290006。

2.1.2 儀器 Motic 顯微鏡（北京榮興光恒科技有限公司，貨號：BA210T）；SQ2125 石蠟切片機（金華市益迪醫療設備有限公司，貨號：YD-315）；包埋機（常州市中威電子儀器有限公司，貨號：BMJ-A）；蓋玻片（貨號：DY89-1）、載玻片（貨號：AY89-2）均購自海門市遠泰實驗器材廠；全自動樣品快速研磨儀（上海凈信實業發展有限公司，貨號：JXFSTPRP-48）；PVDF膜（上海玉博生物科技有限公司，貨號：IPVH00010）。

2.1.3 藥物 加味消脂利肝方組成：黃連6 g，柴胡30 g，生白芍10 g，廣郁金15 g，莪術10 g，山楂10 g，丹參10 g，大黃15 g，炒枳殼10 g，澤瀉10 g，炒白術15 g，茯苓15 g（湖南中醫藥大學第一附屬醫院中藥房購買，批號：2110001S、2105004S、2108003S、2104001S、2108005W、2109003S、2109004S、2108017W、2108007C、2109008S、2106028C、2110011C)。 辛伐他汀（成都恒瑞制藥有限公司，批號：211005）。

2.1.4 試劑 血清ALT、AST、TG、TC、HDL-C、LDL-C采用ELISA 試劑盒檢測（廠家：南京建成生物工程研究所有限公司，批號：20220512、20220511、20220513、20220512、20211225、20211225）；中性樹脂（長沙艾碧維生物科技有限公司，批號：20220206）；蘇木素伊紅染色液（長沙艾碧維生物科技有限公司，批號：01A20211223）；PBS（長沙艾碧維生物科技有限公司，批號：20220111）。

2.2 方法

2.2.1 造模及藥物制備 NAFLD 模型：利用HFD誘導法造模[22]：持續高脂飼料（高脂飼料配方：普通飼料70%，1%膽固醇，10%豬油，10%蔗糖）喂養6周后，隨機選取4 只解剖，觀察大鼠肝臟脂肪變，判斷模型建立是否成功。 將中藥飲片按劑量比例稱取156 g，水煎煮3 次，每次1 h，合并3 次煎煮濾液，濃縮至200 mL，即加味消脂利肝方生藥濃度0.78 g·mL-1。

2.2.2 分組及給藥 采用SPSS 25.0 以簡單隨機抽樣法將大鼠分為空白組（n=5），模型組（n=5），加味消脂利肝方低、中、高劑量組（n=5），陽性藥組（辛伐他汀組，n=5）。按大鼠體質量每100 g 灌胃1 mL 計算，每天上午加味消脂利肝方低、中、高劑量組分別給予3.9、7.8、15.6 g·kg-1加味消脂利肝方灌胃，陽性藥組給予0.15 mg·kg-1辛伐他汀（按體質量70 kg成人每天10 mg 計算）。 空白組、模型組給予同體積生理鹽水灌胃。 各組均灌胃2 周。

2.2.3 血清脂質指標及肝功能指標檢測 于8 周末實驗結束后腹主動脈取血，常溫下靜置血液1 h，后離心取上清液，用于測定各組大鼠血清TG、TC、HDL-C、LDL-C、ALT、AST 水平。

2.2.4 HE 染色 實驗結束后取材，心臟灌注，取肝臟以多聚甲醛固定用于病理染色，將固定的肝組織脫水，石蠟包埋。60 ℃烤片12 h。切片脫蠟至水：先將切片3 次置于二甲苯中，每次20 min，然后依次置于100%、95%、85%、75%乙醇中5 min。 再用蒸餾水浸洗5 min，蘇木素染5 min，蒸餾水沖洗，PBS 返藍，伊紅染5 min，蒸餾水沖洗，梯度乙醇（95%～100%）脫水，每級5 min（或者直接把切片烤干）。取出后置于二甲苯10 min，2 次，中性樹膠封片，顯微鏡觀察和記錄細胞形態的變化。

2.2.5 統計學分析 使用SPSS 25.0 統計軟件進行分析，兩組或多組數據比較用單因素方差分析或秩和檢驗。 P＜0.05 代表差異有統計學意義。

3 結果

3.1 網絡藥理學預測結果

3.1.1 加味消脂利肝方的潛在活性成分及靶點 通過TCMSP 數據庫檢索到加味消脂利肝方的化學成分1263 個。 通過篩選條件，最終得到加味消脂利肝方的潛在活性成分168 個。 經TCMSP 數據庫檢索，得到作用靶點996 個，合并后刪除重復值，得到靶點258 個。將加味消脂利肝方所含的12 味中藥及預測的258 個相關靶點蛋白，利用Cytoscape 3.9.0 軟件中的功能對其進行分析，構建“中藥-活性成分-作用靶點”網絡及可視化。 詳見圖1。

圖1 加味消脂利肝方“中藥-活性成分-作用靶點”網絡圖

3.1.2 NAFLD 疾病靶點的獲取 從GeneCards、OMIM 數據庫搜索，得NAFLD 靶點2652 個，合并去重后共得到2552 個NAFLD 疾病靶點。 運用Venny平臺將潛在活性成分的作用靶點與NAFLD 疾病靶點合并后取交集，最終獲得148 個加味消脂利肝方治療NAFLD 的潛在靶點。 詳見圖2。

圖2 加味消脂利肝方靶點-NAFLD 靶點韋恩圖

根據以上信息篩選得到33 個加味消脂利肝方治療NAFLD 的活性成分（表1）。其中君藥預測得到22 個活性成分，包括黃連3 個、柴胡5 個、丹參8個、大黃6 個；臣藥篩選得到活性成分11 個，包括白芍4 個、郁金2 個、莪術1 個、山楂葉4 個；佐使藥預測得到12 個活性成分，包括枳殼5 個、澤瀉3 個、白術3 個、茯苓1 個。

表1 加味消脂利肝方治療NAFLD 的活性成分

3.1.3 PPI 網絡構建結果 將148 個潛在靶點信息錄入STRING 平臺構建PPI 網絡。 設最低要求交互分數：最高置信度為0.900，結果顯示，該網絡一共含有靶蛋白節點數132 個。詳見圖3。將上述結果導入Cytoscape 3.9.0 中進行關鍵靶點分析，根據MCC 方法選取的加味消脂利肝方治療NAFLD 的關鍵靶點，預測關聯系數前10 的靶點為核心靶點。 詳見圖4。

圖3 靶點PPI 網絡圖

圖4 靶點PPI 關鍵靶點預測

3.1.4 GO 分析與KEGG 通路富集分析結果 對篩選得到的148 個NAFLD 靶點進行GO、KEGG 通路分析。 根據P＜0.01 篩選出2105 條GO 分析結果，包括生物過程（biological process, BP）1846 個、細胞組分（cellular component, CC）97 個、分子功能（molecular function, MF）162 個。 根據靶點富集數目進行篩選，運用在線生物網站繪制排名前10 的結果。 詳見圖5。 同時，以P＜0.01 作為條件進行篩選，共富集得到198 條通路，并篩選出靶點富集數目排名前20 的結果[23]。 詳見圖6。 分析結果表明，加味消脂利肝方治療NAFLD 的作用靶點涉及的通路有PI3KAkt 信號通路、MAPK 信號通路、TNF 信號通路、NFκB 通路等。

圖5 GO 分析圖

圖6 KEGG 通路分析富集氣泡圖

3.2 加味消脂利肝方對NAFLD 大鼠模型的作用

3.2.1 模型判定 空白組大鼠肝臟顏色呈均勻紅褐色，邊緣銳利，質軟。模型組肝臟體積增大，顏色呈暗土黃色，邊緣圓鈍，包膜緊張，質地變脆。 詳見圖7。3.2.2 血清指標檢測結果 模型組血清TG、TC、LDL-C、ATL、AST 水平明顯高于空白組（P＜0.05 或P＜0.01）、HDL-C 水平低于空白組（P＜0.01）。 治療2 周后，與模型組相比，加味消脂利肝方中劑量組血清TG、TC、LDL-C、ATL、AST 水平降低（P＜0.05）， 血清HDL-C 水平升高（P＜0.05）；陽性藥組血清TG、TC、LDL-C、ATL、AST 水平降低（P＜0.05），血清HDL-C水平升高（P＜0.05）。 詳見圖8。

圖7 大鼠肝臟肉眼觀察圖

圖8 各組大鼠血清指標

3.2.3 加味消脂利肝方對SD 大鼠肝組織病理學的影響 與空白組比較，模型組肝臟可見內脂滴性空泡及炎癥性浸潤。 與模型組相比，加味消脂利肝方低、中、高組肝臟內脂滴性空泡顯著減少，陽性藥組的脂肪變性及炎癥壞死明顯改善。 詳見圖9。

圖9 SD 大鼠肝組織HE 染色結果（×400）

4 討論

隨著生活飲食習慣的改變，我國慢性代謝性肝臟疾病發病率不斷上升，因肝臟炎癥性壞死，脂肪變性造成肝功能損傷最終導致的肝纖維化、肝硬化逐年增加，尤其是中老年更為嚴重，長期治療使患者承受了極大的心理和經濟壓力[24]。 NAFLD 的全球患病率為25%，據報道，南美洲為30.45%、亞洲為27.37%、北美洲為24.13%、歐洲為23.71%、非洲為13.48%，其中，中東地區的患病率最高，為31.79%[25-26]，患病率在全球范圍內呈上升趨勢。 研究證明肝脂肪沉積是NAFLD 的重要病理改變，其病理改變具有可逆性，常可通過改變生活方式緩解，然而早期NAFLD無特異性診治手段，改變生活方式對患者挑戰性大，因此臨床重點探索潛在的治療藥物[26]。

中醫學將脂肪肝歸屬于“脅痛”“積聚”“濕濁”等病的范疇，其發病可由飲食失調、過食肥甘厚味、缺少運動以及情志所傷引起，本虛標實，肝郁為發病關鍵環節，脾虛為病機，痰瘀互阻為主要病理因素貫穿疾病始終[27]，臨床中醫治療以張仲景“見肝之病，知肝傳脾，當先實脾”的理論為基礎[28]，中藥方以調肝兼理脾藥為主。 近年來，隨著飲食結構和生活方式的改變，不同患者表現出的疾病征象不盡相同[29]，因此，NAFLD 的早期篩查有利于及時發現疾病并延緩疾病的進展，符合中醫學“治未病”理論[30]。

本實驗分析發現，與模型組比較，加味消脂利肝方中劑量組TG、TC、LDL-C 水平降低（P＜0.05），HDLC 水平升高（P＜0.05），肝功能ALT、AST 水平改善（P＜0.05），加味消脂利肝方能明顯改善大鼠血清血脂及肝功能，肝臟組織病理得到明顯改善，為后續進一步實驗驗證提供了部分基礎，而改善脂質指標及肝功能指標未成劑量依賴性，可能與肝臟代謝功能受損，無法代謝高濃度藥量有關，但其肝組織病理學改變有一定劑量變化趨勢，其結果具有臨床意義。

對于中藥治療NAFLD 作用機制，網絡藥理學可以較好的預測[31]。 有研究表明，TCMSP 篩選結果中活性成分小檗堿已被用于治療代謝綜合征，尤其是通過調節腸道菌群治療NAFLD[32]。 小檗堿增加了SCFA 誘導的細菌增殖，并降低了肥胖和瘦素水平，增加了胰島素敏感性和脂聯素水平，增加益生菌雙歧桿菌和乳酸桿菌的數量。同時小檗堿[33]降低NAFLD肝細胞活性、IL-6 和TNF 水平[34]，下調NF-κB活 性，抑制肝臟炎癥反應的產生[35]。 柚皮素可通過EGFRPI3K-Akt/ERK-MAPKinase 通 路，降低NF-κB 活性、抑制肝臟炎癥反應[36]，同時，山柰酚可通過抑制Tyk-STAT 信號通路，改善炎癥反應導致的代謝性疾病[37]。

IL-6、TNF、IL-4、IL-10 等炎癥因子誘導的炎癥反應[38]是NAFLD 發生發展中導致肝細胞脂肪變性、脂肪蓄積后肝組織壞死性炎癥和纖維化不可逆轉的損傷，引起肝功能受損的物質基礎[39]，尤其IL-6 作為一種重要的炎癥因子和脂肪因子，可以誘導機體產生IR[40]。 IL-6、TNF-α 的水平增高是導致疾病發生的一個重要因素，槲皮素濃度與巨噬細胞中膽固醇外流和ABCA1 mRNA 及其蛋白質的表達呈正相關[41]，槲皮素能減輕腸道損傷、改善腸屏障完整性、調控腸道菌群[32]，進而改善脂質代謝[42]。 木犀草素能降低巨噬細胞中總膽固醇水平，并改善脂質代謝和抑制炎癥反應[43]，這些活性物質是中藥方中的常見成分，預期對疾病治療效果與實驗結果相互印證。

綜上所述，基于網絡藥理學結合實驗研究，對加味消脂利肝方治療NAFLD 的作用機制進行預測，證實了加味消脂利肝方發揮了治療NAFLD 的作用，且具有多成分、多靶點、多途徑的作用機制特征。目前實驗研究進一步論證其分子機制，加味消脂利肝方中君藥黃連含有活性成分小檗堿，小檗堿作為影響腸道菌群治療代謝性疾病的主要活性成分，抑制炎癥因子改變腸道菌群進而治療NAFLD，為后續實驗驗證加味消脂利肝方治療NAFLD 的藥效物質基礎提供一定的思路，其中腸道菌群在加味消脂利肝方治療NAFLD 中發揮的作用，期待試驗的進一步驗證。